GPC组装.docx

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GPC组装

液相色谱之玩法—普通液相色谱改成凝胶色谱实录

1．前言

我在一家国企的技术中心的分析室工作，单位原来有2台安捷伦液相色谱：

1100：

2003年购置，最简单配置，包括：

双元泵、可变波长紫外检测器，双元泵的其中的一个通道因为作正相色谱被我换上了氟材料的密封圈；

1200：

2007年购置，包括：

四元泵带脱气机、柱温箱、二极管阵列检测器、折光检测器。

这两台仪器购置的时候是资金比较充裕，项目开展较多的时候，不过来了以后休息的时间比较多，因此被认为是没用的仪器。

并不是真的不需要，记得有一次一个课题组要测正相色谱，咨询分析室领导，领导的回答是我们是反相色谱，做不了，因此它只能继续休息。

至于后来我把1100的柱塞圈换成氟材料为另一个课题组做正相色谱已经是一年以后的事（这个去年已经写过了），当时它连续几个月连续开机过了一把瘾。

不过随着课题的结束，它也逐渐沉寂下来。

虽然之后也有问题能够用它解决，但是课题组不知道，也不会提交液相色谱测定任务要求。

当我看到它们积满灰尘寂寞的呆在角落，心里总是有种说不出滋味，以为它们将会在孤寂中等着报废了。

偶然的阴差阳错，让我做一个聚合物粘度的测定工作。

在测定的时候，我很多事地问课题组既然研究分子量，为什么不用GPC测，他们说我们分析室测不了，这个样品不溶于四氢呋喃，课题组联系了很多地方，拥有四氢呋喃体系GPC没有一个肯换成氯仿来做。

我立刻说我们只要买根凝胶柱就可以自己做，他们也很有兴趣，很快向领导汇报了。

现在的经济形势不太好，领导很慎重，要求做好调研工作。

课题组联系外送测试，而我就考虑配置。

其实在之前我只对GPC有些纸上谈兵的印象，根本没做过，只不过我想其它课题基本已经成形，只有这个聚合物工作才开始，如果不抓住这个机会，也许液相色谱真的无出头之日了。

不过后来事情发生了变化，课题组找了氯仿体系的GPC，测试费250/个，而我了解到凝胶柱比普通液相柱贵很多，就算日本的比较便宜，也要近1万元1根，而且一般都会用多根凝胶柱，标样一套也要几千元，仅从经济利益上来说自己做不太合算，因此觉得不会自己做了。

当我和课题组长交换意见时，他却询问我原来仪器的价格，他说他会跟领导说第一：

用几万元发挥了几十万元仪器的功能，是值得的；第二：

这个不仅是为一个项目做，以后和聚合物有关的项目都可以用。

结果领导不但批下来了，而且后期一直追问进展情况。

我想液相色谱如果有知，应该感谢这样知人善任的课题组长。

2．配置方案

从硬件讲，GPC比一般的液相色谱简单，毕竟只要一个通道，如果直接用原有的1200配置也是可以的，不过四元泵实际是一元泵加比例阀，如果用于GPC，要将比例阀旁路。

需要另外买一个转接头（货号P/N0100-1847），更重要的是我不清楚氯仿对普通柱塞密封圈是不是有影响，因此用1100双元泵的那个四氟柱塞泵的通道是比较稳妥的。

至于脱气机，反正不混合，而且听说安捷伦的脱气机还比较娇气，不用也罢。

这个样品没紫外吸收，只有用1200配的折光检测器，有了折光检测器就得加柱温箱。

既然说还要为其它项目做准备，所以紫外检测器还要留着。

虽然2台仪器一直在睡大觉，但不能因为我做了GPC就变成一台了，所以剩下的还是要组成一个完整的体系，以备不时之需。

最后配置方案：

GPC：

双元泵、柱温箱、折光检测器、可变波长紫外检测器（备用）

普通液相色谱：

四元泵加脱气机、二极管阵列检测器

由于领导批准的爽快，我做计划时还是选了PL的色谱柱，不是说贵的一定好，只不过一是科研单位包括文章中用的比较多，第一次做，就当买个放心吧；二是从瓦里安买比安捷伦价格便宜了很多（不知道归了安捷伦以后价格如何），比我预算要低。

最终采购拿来给我确认配置的合同上是三万零八元，包括一根保护柱、二根色谱柱、10套10分子量的一次性混标，另外还采购了一些针头过滤器、过滤白头之类液相色谱必备的耗材。

采购计划交上去，我就安心地开始着手仪器的组装、软件的安装及调试了

3．软件安装

不怕被人说成傻瓜，一直觉得安捷伦的软件很贴心。

我以为所有人都知道安捷伦的软件都是液相气相共用，并且新版本可以用在旧机器上。

不过自从听说有人安装软件都要服务工程师上门，知道并非所有人能都像我这样有机会折腾。

首先，安捷伦的化学工作站的版本必须和操作系统匹配，否则会出很多问题。

但是如果你找不到合适的操作系统，你可以找合适的工作站版本。

安装时选2070安装液相、2170是安装气相，只要输入相应的系列号即可，本来觉得这个行为可能算使用盗版，现在觉得新版本软件既然能用旧系列号，证明不是盗版，这能说是打相应的版本补丁，毕竟系列号是我买的。

用GPC都要配GPC插件，我很久以前为了好玩跟别人复制过GPC插件，在不同的A版本化学工作站装成功过，但这次拿出来却发现B版上不兼容，只好去搞了新版插件。

所以插件不一定是每个版本都有对应的，但至少A版和B版插件版本是不一样的。

操作软件的报告内容要理解还得去补一下高分子的基础知识，不过分析人员依照操作说明依样画葫芦就能做了，安捷伦科技大学网站有详细的操作软件说明下载，我以前就靠着这份说明硬是在没有硬件的脱机情况下学会使用它的。

不过因为有人说安捷伦这个软件不好，而GPC插件仅是个纯粹的数据处理软件，所以我现在恶补高分子知识的同时也在寻找其它GPC软件，将来可以将液相测定数据导出后用其它软件处理。

4．仪器连接调试

本来以为模块化设计的液相色谱硬件连接是很简单的事，只要花点力气就行。

我把各模块按照需要垒好，但连好发现网卡装在新的模块上电脑认不出旧的模块，换到旧的模块上面认不出新的模块，连线、网卡反复替换检查发现没问题，只好打电话给安捷伦客服求救，他们回答这是很正常的，需要固件升级，收上门服务费960元。

因为以前从来没考虑过兼容问题，也没有提过此方面的费用。

事情到了这个重要关头，我不想因为一点小事耽误了进程，我知道固件升级跟计算机刷BIOS一样，没什么困难的，于是托人（安捷伦重要客户）帮我讨要升级软件和相应的版本，对方答复不建议自己升级，联系了一个工程师来帮我升级。

来了以后，我才知道升级软件和相应固件版本在软件光盘里都有，其实告诉我就行了，不过工程师说如果BIOS坏了就得换板子，这样如果不幸碰到死机断电的事损失就大了（我认为没必要，完全可以在电脑城找人用专门机器重刷或拆下BIOS完好的废板子重刷，不过没试过，没有发言权）。

我把软件都复制在电脑里了，打开软件光盘下LCFirmware文件夹里有个Fwupdatesetup的安装程序，双击即可安装Fireware升级软件，还有2个pdf文件是讲软件使用和各模块版本信息的，需要升级的Firmare版本在LC文件夹下（如图1）

图1Fireware升级工具程序及Fireware版本

安装了fireware升级工具后出现了FirewareUpdateTool的图标，胆大的同仁就可以根据说明自己升级固件了。

图2是我的仪器升级后的版本信息，可以看到二元泵、柱温箱及折光检测器升级后的固件版本号

图2升级工具

升级完以后，仪器的各模块就可以相互联系了。

下图是仪器实物图，新旧模块颜色对比还是比较强烈的，一看就是拼起来的，从上至下分别为二元泵、柱温箱、折光检测器、紫外检测器，边上是手动进样的六通阀。

图3组装后的GPC实物图

因为考虑氯仿的挥发性，所有的仪器废液都放在通风柜里，按照惯例，折光检测器是应该放在紫外检测器后面的，我暂时不用紫外检测器，为了尽量减少死体积，柱温箱和折光检测器放在一起，连接的管路也基本上切割得刚好，备用的紫外检测器在这里只是起个支架的作用。

5．测定

测定前开始平衡，折光检测器自从买来就没用过，也不知道基线噪声多少算平衡好，不过折光检测器有循环通道，索性平衡了一个晚上再做，反正试剂基本上不消耗。

首先做标准曲线，本来我打听了很多标样，单标、混标，各种价格相差也很大，没用过也不知道该怎么选择，想先跟着PL柱子买点进口的一次性混标试试，正常后再根据自己需要选用国产的标样，当时人家销售跟我说10个分子量10组20瓶，成交价格2千多，我对这个价格一直有点怀疑，因为有些给我的报价进口单标一瓶就要1000多，所以在合同上采购让他们注明了20份/件。

拆开看发现是20个小棒子，每个棒子上沾点聚苯乙烯，不能说上当，只能说一分价钱一分货，不过用起来还是很方便的。

把棒子插在放有2ml氯仿的样品瓶中溶解后取出，用进样针进10微升左右。

10个分子量取了9点，分子量580的已经在色谱柱的下限了，峰很宽，做进去没什么意思。

图4两组标样及实际谱图

图5标准曲线

样品溶解后进样，除了样品的一个峰外，最后还有3个负峰（后面讨论），有时为了省时间，没等负峰出完就进第二针，负峰就会在样品的前面，但不会影响样品的分子量测定。

图6样品GPC图

按照GPC插件的操作得到报告，如果参照软件的说明采用原来的屏幕观看方式看起来既不清晰也不方便，我装了一个pdf打印机程序并选为默认打印机，在GPC插件中点击打印，便出现了较为清晰pdf文件页面。

图7实验报告图

5．一些问题

作了一段时间的GPC，感觉它无论理念和习惯是和液相色谱定量分析大不相同。

是由于没能接触到GPC的专业人员，遇到很多问题和困惑找不到可以讨论的人，在论坛中也很少有人提到。

前不久花了1000元去上了安捷伦一天的GPC培训，可能我的要求太高，觉得基本就在讲软件操作，而这个只要是GPC操作人员就知道怎么做，而我有些问题的回答让我不太满意。

后来在反馈意见上说希望增加实际操作中的问题及解决方案，也许以后能有所提高吧。

这里我列举一些我遇到问题和我认为的答案，希望能得到相关专家的批评和指正。

5.1浓度问题

在培训的时候我问过培训老师，样品的含量重要吗，她说当然，计算不同分子量时要用到。

也许是她没理解我的意思，我知道在计算分子量公式是有物质的量的数据的。

但我想问的是在GPC分析时，样品的浓度误差对最终分析的结果影响到底多大？

这其实分为2个方面，一个是样品的浓度，做一般液相分析时分析天平、容量瓶、准确的手势是实验准确性的保证，但是在GPC测定时，即使做的再正确，你会发现根本没有地方需要运用你的浓度数据进行计算。

由于GPC测的分子量分布，不管浓度高低，分子段的比例是不变的。

因此我有以下结论：

a．样品浓度的准确性要求并不高：

我是在样品瓶中加入几粒样品然后用溶剂加到瓶子上的刻度。

b．样品浓度应该根据柱子容量、灵敏度等选择（有人还说根据分子量大小调整，分子量小的浓度高些，我暂时还没有分子量相差较大的样品来比较）：

我的柱子建议浓度0.05-0.5%，因为这个样品在目前体系上灵敏度不高，我用到了近上限0.4%。

c．为了较好的重复性，最好浓度比较接近：

按目前我的做法，浓度基本上0.35-0.45%，比起一般液相色谱当然不够精密，不过基本也保持在上限。

另一个问题就是我现在仍然比较困惑的问题，就是各分子量浓度（或者说各分子量相对比例），这个主要表现在标样上，一组混标当然没问题，证书上会有各分子量的比例，不管配置浓度是否准确，比例是不会变的。

但是我用的是2组混标10个分子量，每组是一个小棒子上沾了一点聚苯乙烯标样，按照说明溶到2ml溶剂中，在校正表的重量一栏我都用的默认的1，但是我称过溶解前后棒子质量，发现溶解掉的聚苯乙烯并不一样，而且溶剂是挥发性的，也不能保证2ml的准确性，这样10个做到一个图里，浓度比例应该不一样的。

如果在计算分子量的时候用的这个分子的量是按照标样浓度与响应值来算的，显然会造成误差。

为了证实一下我的想法，我尝试把表中某些分子量的从1改到3（从浓度来说是相当大的变化了）,标线是分子量对应流出体积，本来不该有变化，但事实有很变化（尽管不明显），但用于最后的分子量分布结果变化很小。

图8更改各分子量重量比例的标准曲线图

我想软件中既然有用到浓度比例的，应该有用的，不清楚其如何计算，就无法判断它对误差的影响程度，如果我验证方法是正确的，那么分子量浓度比例差异引起得误差可以忽略不计，但这个结论还要与大家共同探讨。

5.2重复性问题

做分析方法的必须考虑的就是准确性、精密度，我在做GPC之前之后问过很多人什么样的误差是合理的，答案有5%、10%、20%（这个好像有点吓人了），如果上述答案都是有依据的话，我觉得答案的前提可能跟分子量范围和测试条件有关，但回答的人都忘了前提了。

我问课题组的重均分子量在10万左右的，我出的数据变动多少认为正常，他们说差几千是正常的。

我连续做了重复测定了几次，发现分子量也就差个1、2千，而同一张图，我对图的积分时间稍做变化（两端都在基线上），统计分子量能差3千多。

从我的测定结果看重复性是很好的，误差比数据处理的误差还小，似乎做平行都没什么意义了。

图9积分时间对统计分子量结果的影响

因此我觉得：

a．在评价结果重复性时应该使用峰位分子量而不是统计的平均分子量，因为统计分子量的数据还多了一项数据处理这一人为因素影响的不确定性。

b．同一系统下测定分子量的误差主要是保留时间的变动，应该是和体系稳定性有较大关系。

体系变动引起的保留时间变动是有一定范围的，因此如果适合样品分子量测定的色谱柱分子量范围越窄其变动同样保留时间引起的分子量变动的绝对值也越小。

因此对测定通用性和精密度这对矛盾的不同侧重决定了色谱柱型号的选择。

5.3标定周期问题

相比一般液相色谱，GPC标样很贵。

上面说过我买的是一次性标样可以用10次，要是每次做样都标定，很快就没了。

所以当初打算用完一次性的以后，再买国产单标自己配。

咨询做GPC的同行，没有一个准确说法，不过我遇到的都不是每次做标定的。

有的说一月一次，有的说觉得有问题再标定，还有一个夸张到装机时标定过一次以后就没再标定，也不清楚到底是重复性好不需要经常标定，还是因为标样价格贵舍不得标定。

基于如此，我本来打算将一份样品留下来作为质控标样，当分子量相差太多时才做标定，相差范围暂定±5%。

现在发现我的样品可能随着时间长会有所降解，因此还是想有机会买一瓶国产的聚苯乙烯单标做为质控样比较好。

5.4谱图最后的负峰

我的图最后有3个负峰，比分子量最小的峰（分子量几百）还要晚，资料中色谱图也有这样的峰。

培训老师说是溶剂的原因，边上的同行引用资料的说明说第一个大的负峰是溶剂中的稳定剂，后面是压力降。

我觉得并不对，因为稳定剂分子量不会比溶剂低，应该在溶剂峰之前，我用的是氯仿跟四氢呋喃不同，不需要稳定剂。

还有我不知道压力降引起负峰是折光检测器的特征还是GPC的特征，这就待以后我GPC用紫外检测器或普通液相色谱体系用折光检测器来验证了，如果谁做过这方面工作或对此有见地，请指教。

氯仿GPC图

结语

以前我认为仪器是解决问题的工具，只有在不断折腾的各种玩法下发挥其特长才是最好的用法，所以才准备写个玩法系列。

正相做过了，凝胶完成了，还怎么玩？

曾经想过来打算把戴安的离子色谱和安捷伦拼起来，电导检测器装在安捷伦液相后面或者紫外检测器加在离子色谱后面，那个需要考虑不同仪器之间的匹配，还是需要花点力气和时间的。

但是现在单位形势发生变化，仪器成了太上皇，只要出问题就要找仪器负责人的碴，连什么部件坏了都搞不清楚就能开出罚单，在这种情况下，只有什么都不做，才是安全的，因此玩法系列也只能就此结束了，过去的经历是我不可多得的宝贵财富，希望以后在这看到有机会折腾的同仁写的好文，让我有纸上谈兵的机会。