4 除草剂绿麦隆的研究背景.docx

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4除草剂绿麦隆的研究背景

博士学位论文

水溶性有机物对除草剂绿麦隆环境行为

的影响及其机制研究

宋宁慧

指导教师

杨红教授

专业名称

农药学

研究方向

农药残留与环境毒理

答辩日期

二○○九年六月

EFFECTOFDISSOLVEDORGANICMATTERONBEHAVIOROFHERBISIDECHLOROTOLURONINENVIRONMENTANDITSMECHANISM

By

SongNinghui

SupervisedbyProf.YangHong

ATHESIS

Submittedto

NanjingAgricultureUniversity

InPartialFulfillmentoftheRequirements

ForthePh.DDegree

CompleteinJune,2009

CommencementinJune,2009

原创性声明

本人郑重声明：

所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。

除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。

对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。

本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。

学位论文作者（需亲笔）签名：

年月日

学位论文版权使用授权书

本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。

本人授权南京农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。

保密□，在年解密后适用本授权书。

本学位论文属于不保密□。

（请在以上方框内打“√”）

学位论文作者（需亲笔）签名年月日

导师（需亲笔）签名：

年月日

目录

摘要I

ABSTRACTIV

文中缩写说明vII

第一章水溶性有机物对农药环境行为的影响1

1引言1

2农药在环境中的行为2

2.1环境中农药的残留与检测2

2.2土壤中农药的环境行为3

2.2.1土壤对农药的吸附与解吸3

2.2.2土壤中农药的迁移与淋溶5

2.2.3土壤中农药的降解与挥发6

2.3农药对植物的影响6

2.3.1植物对农药的吸收和转化6

2.3.2植物对农药的抗逆性7

3DOM对农药环境行为的影响8

3.1DOM的来源和组成8

3.2DOM对农药在土壤中行为的影响9

3.2.1DOM对农药在土壤中吸附与解吸的影响9

3.2.2DOM对农药在土壤中迁移的影响9

3.3DOM作用下农药对植物毒性的影响10

3.4DOM与农药的结合机理11

4除草剂绿麦隆的研究背景11

4.1绿麦隆的性质和使用现状11

4.2绿麦隆的作用机制13

4.3绿麦隆的环境行为13

4.3.1绿麦隆在土壤中的行为13

4.3.2作物对绿麦隆的吸收和转化14

5问题和展望14

6论文研究思路和目标15

第二章除草剂绿麦隆的分析方法研究25

1引言25

2材料与方法26

2.1供试材料26

2.2仪器设备26

2.3试验方法26

2.3.1高效液相色谱检测条件26

2.3.2标准溶液的配置27

2.3.3绿麦隆在环境样品中的残留分析试验27

2.3.4DSC法测定绿麦隆原药的纯度试验28

3结果与讨论29

3.1绿麦隆在环境样品中的残留分析29

3.1.1标准曲线的绘制29

3.1.2样品的提取和净化30

3.1.3方法的准确度和精密度33

3.1.4方法的比较34

3.2绿麦隆原药纯度的测定34

3.2.1试验条件的选择34

3.2.2DSC和HPLC两种测定方法的比较34

4结论37

第三章水溶性有机物对土壤中绿麦隆迁移行为的影响39

1引言39

2材料与方法40

2.1供试材料40

2.2仪器设备40

2.3试验方法41

2.3.1水溶性有机物的提取41

2.3.2绿麦隆在土壤中的吸附与解吸41

2.3.3DOM对绿麦隆在土壤中吸附与解吸的影响41

2.3.4土柱淋溶试验42

2.3.5土壤薄层层析试验42

2.3.6样品中绿麦隆的定量分析43

3结果与讨论43

3.1DOM对绿麦隆在土壤中吸附动力学的影响43

3.2DOM对绿麦隆在土壤中吸附的影响44

3.3DOM对绿麦隆在土壤中解吸的影响45

3.4DOM对土壤中绿麦隆淋溶性的影响46

3.5DOM对土壤中绿麦隆迁移行为的影响49

4结论50

第四章绿麦隆对小麦幼苗生物学反应的研究53

1引言53

2材料与方法54

2.1供试材料54

2.2仪器设备54

2.3试验方法54

2.3.1植物的培养和处理54

2.3.2小麦组织中绿麦隆含量的测定55

2.3.3植物生长量的测定55

2.3.4小麦组织中TBARS含量测定55

2.3.5小麦叶片中叶绿素含量的测定55

2.3.6小麦组织中脯氨酸含量的测定55

2.3.7小麦叶片中O2·-和H2O2含量的测定55

2.3.8小麦抗氧化酶活力的测定56

2.3.9聚丙烯酰胺凝胶电泳56

2.4统计分析57

3结果与讨论57

3.1小麦组织中绿麦隆的含量57

3.2绿麦隆对小麦生长量的影响58

3.3绿麦隆对小麦组织中TBARS含量的影响58

3.4绿麦隆对小麦叶片中叶绿素含量的影响60

3.5绿麦隆对小麦组织中脯氨酸含量的影响61

3.6绿麦隆对小麦叶片中O2·-和H2O2含量的影响62

3.7绿麦隆对小麦组织中抗氧化酶活力的影响64

3.8绿麦隆对小麦SOD、POD、CAT同工酶酶谱的影响66

4结论67

第五章水溶性有机物对绿麦隆诱导小麦氧化胁迫的影响71

1引言71

2材料与方法72

2.1供试材料72

2.2仪器设备72

2.3试验方法72

2.3.1水溶性有机物的提取72

2.3.2植物的培养和处理72

2.3.3小麦组织中绿麦隆含量的测定73

2.3.4小麦组织中TBARS含量测定73

2.3.5小麦抗氧化酶活力的测定73

2.3.6小麦基因Cu/Zn-SOD和GST的RT-PCR半定量分析73

3结果与讨论74

3.1DOM作用下小麦组织中绿麦隆的含量74

3.2DOM作用下绿麦隆对小麦组织中TBARS含量的影响75

3.3DOM作用下绿麦隆对小麦组织中抗氧化酶活性的影响76

3.4DOM和绿麦隆作用下小麦组织中基因的RT-PCR半定量分析80

4结论81

参考文献81

第六章水溶性有机物与绿麦隆结合特征的研究83

1引言83

2材料与方法84

2.1供试材料84

2.2仪器设备84

2.3试验方法84

2.3.1水溶性有机物的提取84

2.3.2DOM元素组成和灰分测定84

2.3.3DOM与绿麦隆结合物的制备84

2.3.4DOM及其与绿麦隆结合物的结构分析84

3结果与讨论85

3.1DOM的理化性质85

3.2DOM及其与绿麦隆结合物的红外光谱分析86

3.3DOM及其与绿麦隆结合物的荧光光谱分析89

3.4E4/E6值变化特征91

4结论91

参考文献91

全文结论93

论文不足之处95

论文创新点97

攻读博士学位期间发表的学术论文目录99

致谢101

水溶性有机物对除草剂绿麦隆环境行为的影响及其机制研究

摘要

化学农药的广泛应用，不可避免地产生了农药残留问题。

存在于食品、饲料、水、土壤、空气等环境中的农药残留，给人类健康和生态环境带来一定的危害，农药的环境污染与治理已成为一个全球性问题。

农业土壤中残留农药的解吸、运移及其生物毒性严重影响生态环境及农产品安全质量，其环境行为受到广泛关注。

水溶性有机物（dissolvedorganicmatter，DOM）普遍存在于土壤和水环境中，是陆地-水生态系统中最为活跃的组分，对土壤和水体中污染物的运移起到载体的作用。

DOM与农药相互关系的研究对揭示农药在植物根-土、土-水界面的传输机理，阻控土壤中农药对植物与地表水和地下水的污染，以及更科学地对农药的生态风险进行评价具有十分重要的意义。

本论文以农业上常用的有机物料（污水污泥和水稻秸秆）为DOM的提取原料，以除草剂绿麦隆研究对象，通过一系列的物理化学、光谱学和生物学等试验，研究了农业土壤中水溶性有机物对农药绿麦隆环境行为的影响，并对有关的机理进行了探讨。

用差示扫描量热法（DSC）研究了绿麦隆纯度的测定方法，测定最佳条件为升温速率0.5Kmin-1，样品量2～3mg，保护气流速20mLmin-1。

用本方法测定绿麦隆原药的纯度为98.35%，相对标准偏差（RSD）为0.034%。

测定结果与已知纯度相符。

并将测定结果与高效液相色谱（HPLC）法进行了比较。

该法具有操作简便，样品用量少，准确度和精密度均较高等优点。

建立了测定土壤、小麦和水体中除草剂绿麦隆残留量的分析方法。

采用丙酮超声提取，ENVI-Florisil固相萃取小柱分离、净化，测定土壤和小麦叶和根中绿麦隆残留量，LC-18固相萃取小柱分离和富集水中绿麦隆残留量。

结果表明：

HPLC法检测绿麦隆的线性范围为0.25～16mgL–1，相关系数R2=0.9992。

本研究的检出限为2.0×10-10g，最低检测浓度为0.0125mgL-1。

土壤的加标回收率为93.6～101.2%，相对标准偏差为3.5～4.6%；小麦叶的加标回收率为89.7～98.7%，相对标准偏差为3.8～5.1%；小麦根的加标回收率为90.3～96.1%，相对标准偏差为3.4～4.8%;水样的加标回收率为92.6～99.9%相对标准偏差为1.2～3.9%。

通过标准批量平衡法、土柱淋溶法和土壤薄层层析法，研究了两种来源DOM对除草剂绿麦隆在土壤中的吸附-解吸与迁移行为的影响。

试验结果表明，DOM能明显抑制土壤对绿麦隆的吸附，增强土壤中绿麦隆的解吸，促进绿麦隆在土壤中的迁移。

在所研究的绿麦隆和DOM浓度范围内，来源于水稻秸秆的DOM（ST）比来源于污泥DOM（SL）作用显著，而且DOM浓度越高影响越显著。

说明农业土壤中水溶性有机物能明显活化土壤中的除草剂绿麦隆，增强其活动性。

采用土培盆栽试验研究了土壤中绿麦隆对小麦幼苗毒性的影响。

结果表明，在5～25mgkg-1绿麦隆浓度范围内，小麦组织中绿麦隆的含量与绿麦隆土壤处理的浓度呈正相关。

而小麦的叶长、根长和叶根干重，叶绿素含量等指标与外源绿麦隆的浓度呈负相关。

小麦组织中丙二醛的含量在低浓度绿麦隆处理时显著升高，在10mgkg-1绿麦隆处理下达到最高值，但在更高浓度的农药胁迫中又逐渐降低。

随着绿麦隆浓度的增加，小麦叶、根中的脯氨酸、O2·-和H2O2含量呈显著升高，引起植物的氧化胁迫。

为消除活性氧引发的氧化损伤，植物在长期的自然选择中形成了一套有效的活性氧清除酶促机制。

酶促保护系统包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）。

绿麦隆胁迫使小麦叶、根中抗氧化酶POD、SOD和APX活性均显著升高，在10～15mgkg-1绿麦隆处理下达到较高水平，在20mgkg-1处理下酶活力水平又呈下降趋势。

而小麦叶中CAT活性却受到不同程度抑制，且随着绿麦隆浓度的加大逐渐降低。

经小麦SOD、POD和CAT同工酶酶谱检测发现这种诱导作用导致小麦组织中酶的表达量增加并且诱导了新的同工酶带产生。

研究了DOM作用下绿麦隆对小麦幼苗的毒性影响。

在10mgkg-1绿麦隆和两种来源的50mgDOCkg-1DOM作用条件下，处理期为4d时，DOM使小麦叶和根中的绿麦隆含量减小。

处理期为10d时，DOM使小麦叶和根中的绿麦隆含量增大。

在不同的时间段，DOM可使绿麦隆胁迫下小麦叶和根中MDA含量，表明DOM缓解了植株的氧化损伤。

绿麦隆胁迫下使小麦SOD、POD、CAT和GST活力显著增高，DOM降低了绿麦隆诱导SOD和CAT的活力，但进一步提高了POD和GST的活性。

说明DOM可能通过提高POD和GST的活性，增强对H2O2的清除能力，提高了植株的抗氧化能力。

使用RT-PCR半定量分析对SOD和GST酶活性变化进行了验证，结果表明，DOM可以缓解绿麦隆对小麦幼苗的毒性。

采用元素分析、荧光和红外光谱学技术研究DOM与农药的相互作用。

试验结果表明，与来源于污泥DOM相比，来源于水稻秸秆DOM中H/C值和灰分含量较低，说明来源于水稻秸秆DOM中含有更多的有机组分和不饱和结构。

荧光光谱发现DOM发射和激发光谱波峰的位置都比较靠近土壤富啡酸波峰的波长（450～460nm），说明两种DOM中腐殖类物质主要为土壤富啡酸。

红外光谱发现，DOM与绿麦隆结合物在4000～3000cm-1、1300～1500cm-1和900～600cm-1的吸收峰发生偏移，表明DOM与绿麦隆结合作用机制是π-π相互作用和氢键及分配和疏水等作用。

DOM与绿麦隆相互作用过程中可能又形成了新的结构更为复杂的物质，其多聚化和芳构化程度明显增大。

因此，添加外源DOM可抑制土壤对农药绿麦隆的吸附，促进土壤中残留绿麦隆的解吸，从而增强了土壤中农药的移动性，促进了农药绿麦隆向水体的迁移和植物的吸收。

DOM可以通过缓解植株的氧化损伤，提高植株的抗氧化能力来降低绿麦隆对植物的毒害作用。

关键词：

农药残留；绿麦隆；水溶性有机物；迁移；土壤；小麦

EFFECTOFDISSOLVEDORGANICMATTERONBEHAVIOROFHERBICIDECHLOROTOLURONINENVIRONMENTANDITSMECHANISM

ABSTRACT

Pesticidesusedinagriculturehavegreatlyimprovedfoodproduction.However,extensiveuseofpesticidesinconventionalagriculturalpracticeshasresultedincontinuousandseriousenvironmentalpollution.Becauseofthis,publicconcernovertheresiduesofpesticidesinenvironment,foodandrelatedcommoditieshasincreasedoverthelastdecades.Sincethemajorityofpesticidesoccurinthemediumofsoil,theresiduesofpesticidesconstitutethemajorsourcesthatnotonlyleachtothegroundwaterbutareuptakenbycropsaswell.Dissolvedorganicmatter（DOM）isubiquitousinsoilandaqueousenvironment,andthemostactivecomponentinterrestrialandwaterecosystem.Itcanfacilitatethemobilityofcontaminantsinsoilandwater.StudyontherelationshipbetweenDOMandpesticidescanhelpusunderstandthetransferringmechanismofpesticidesontheinterfacebetweenplantrootandsoil,soilandwater.Itcanalsohelptopreventandcontrolcontaminatingplant,surfacewaterandgroundwaterbypesticides,andriskassessmentofpesticidesscientifically.Consequently,thisstudywascarriedouttoexploretheinfluenceofDOMderivedfromsludgeandstrawonenvironmentalbehaviorofpesticide（chlorotoluron）andtheassociatedmechanisms.

Differentialscanningcalorimetry（DSC）wasusedfordeterminationofpurityofchlorotoluron.Theoptimaltestingconditionswerestudiedandthefollowingconditionswereselected:

heatingrampof0.5Kmin-1,sampleweightof2～3mgandgasflowrateof20mLmin-1.Thederelopedmethodwasappliedtotheanalysisofthepurityofchlotoroluron,anditwasfoundtobe98.35%,whichaccordwiththeresultobtainedbyHPLC.ComparedwithHPLC,DSCmethodhassomeadvantagessuchaslesssamplerequired,higheraccuracyandshortertime.

Amethodfordeterminationofchlorotoluronresiduesinsoil,wheatandwaterofenvironmentwasdevelopedbySPE-HPLC.Residuesinsoilandwheatwereextractedwithacetone,followedbycleanupwithENVI-FlorisilSPEcolumn.ResiduesinwatercleanupwithLC-18SPEcolumn.TheextractedsampleswereanalyzedbyHPLC-UVD.Thecorrelationcoefficients（R2）ofthismethodwas0.9992,andtheircalibrationcurveswerelinearintherangeof0.25～16mgL–1,limitofdetectionwas2.0×10-10g,limitofquantificationwas0.0125mgL–1.Therecoveriesrangedfrom93.6～101.2%forsoil,89.7～98.7%forleafofwheat,90.3～96.1%forrootofwheatand92.6～99.9%forwaterwiththeRSDwas3.5～4.6%,3.8～5.1%,3.4～4.8%and1.2～3.9%,respectively.

Batchexperiments,soilcolumnsandsoilplatewereconductedtheeffectofDOMonherbicidechlorotoluronsorptionontosoil,desorptionfromsoilsandmobility.TheresultsindicatedthatDOMcouldmarkedlyconstrainsorptionofchlorotoluronontosoil,enhancegreatlydesorptionofchlorotoluronfromsoilandsignificantlyincreasedthemobilityinsoil.AscomparedtosludgefromDOM,strawfromDOMhadastrongereffectonchlorotoluronbehaviorinsoil.ThiseffectcouldbestrengthenedbythehighconcentrationofDOM.ThatindicatedDOMcouldactivatedchlorotoluroninagriculturesoilandincreaseditsactivity.

Thesoilpotexperimentwasusedtoassesschlorotoluron-inducedtoxicityinwheat.Thewheatplantswereculturedinthesoilswithchlorotoluronatconcentrationsof0～25mgkg-1.Chlorotoluronaccumulationinplantswaspositivelycorrelatedwiththeexternalchlorotoluronconcentrations,butnegativelywiththeplantgrowth.TreatmentwithchlorotoluroninducedtheaccumulationofO2·-andH2O2inleavesandresultedintheperoxidationofplasmamembranelipidsintheplant.Wemeasuredtheendogenousprolinelevelandfoundthatitaccumulatedsignificantlyinchlorotoluron-exposedrootsa