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1、4 除草剂绿麦隆的研究背景 博士学位论文水溶性有机物对除草剂绿麦隆环境行为的影响及其机制研究宋宁慧指导教师 杨 红 教授 专业名称 农 药 学 研究方向 农药残留与环境毒理 答辩日期 二九年六月 EFFECT OF DISSOLVED ORGANIC MATTER ON BEHAVIOR OF HERBISIDE CHLOROTOLURON IN ENVIRONMENT AND ITS MECHANISMBy Song NinghuiSupervised by Prof. Yang Hong A THESIS Submitted toNanjing Agriculture University

2、 In Partial Fulfillment of the Requirements For the Ph.D DegreeComplete in June, 2009 Commencement in June, 2009原 创 性 声 明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者（需亲笔）签名： 年 月 日学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完

3、全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南京农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。保密，在 年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密。 （请在以上方框内打“”）学位论文作者（需亲笔）签名 年 月 日导师（ 需亲笔）签名： 年 月 日目 录摘 要 IABSTRACT IV文中缩写说明 vII第一章 水溶性有机物对农药环境行为的影响 11 引言 12 农药在环境中的行为 22.1 环境中农药的残留与检测 22.2 土壤中农药的环

4、境行为 32.2.1 土壤对农药的吸附与解吸 32.2.2 土壤中农药的迁移与淋溶 52.2.3 土壤中农药的降解与挥发 62.3 农药对植物的影响 62.3.1 植物对农药的吸收和转化 62.3.2 植物对农药的抗逆性 73 DOM对农药环境行为的影响 83.1 DOM的来源和组成 83.2 DOM对农药在土壤中行为的影响 93.2.1 DOM对农药在土壤中吸附与解吸的影响 93.2.2 DOM对农药在土壤中迁移的影响 93.3 DOM作用下农药对植物毒性的影响 103.4 DOM与农药的结合机理 114 除草剂绿麦隆的研究背景 114.1 绿麦隆的性质和使用现状 114.2 绿麦隆的作用机

5、制 134.3 绿麦隆的环境行为 134.3.1 绿麦隆在土壤中的行为 134.3.2 作物对绿麦隆的吸收和转化 145 问题和展望 146 论文研究思路和目标 15第二章 除草剂绿麦隆的分析方法研究 251 引言 252 材料与方法 262.1 供试材料 262.2 仪器设备 262.3 试验方法 262.3.1 高效液相色谱检测条件 262.3.2 标准溶液的配置 272.3.3 绿麦隆在环境样品中的残留分析试验 272.3.4 DSC法测定绿麦隆原药的纯度试验 283 结果与讨论 293.1 绿麦隆在环境样品中的残留分析 293.1.1 标准曲线的绘制 293.1.2 样品的提取和净化

6、303.1.3 方法的准确度和精密度 333.1.4 方法的比较 343.2 绿麦隆原药纯度的测定 343.2.1 试验条件的选择 343.2.2 DSC和HPLC两种测定方法的比较 344 结论 37第三章 水溶性有机物对土壤中绿麦隆迁移行为的影响 391 引言 392 材料与方法 402.1 供试材料 402.2 仪器设备 402.3 试验方法 412.3.1 水溶性有机物的提取 412.3.2 绿麦隆在土壤中的吸附与解吸 412.3.3 DOM对绿麦隆在土壤中吸附与解吸的影响 412.3.4 土柱淋溶试验 422.3.5 土壤薄层层析试验 422.3.6 样品中绿麦隆的定量分析 433

7、结果与讨论 433.1 DOM对绿麦隆在土壤中吸附动力学的影响 433.2 DOM对绿麦隆在土壤中吸附的影响 443.3 DOM对绿麦隆在土壤中解吸的影响 453.4 DOM对土壤中绿麦隆淋溶性的影响 463.5 DOM对土壤中绿麦隆迁移行为的影响 494 结论 50第四章 绿麦隆对小麦幼苗生物学反应的研究 531 引言 532 材料与方法 542.1 供试材料 542.2 仪器设备 542.3 试验方法 542.3.1 植物的培养和处理 542.3.2 小麦组织中绿麦隆含量的测定 552.3.3 植物生长量的测定 552.3.4 小麦组织中TBARS含量测定 552.3.5 小麦叶片中叶绿素

8、含量的测定 552.3.6 小麦组织中脯氨酸含量的测定 552.3.7 小麦叶片中O2- 和H2O2含量的测定 552.3.8 小麦抗氧化酶活力的测定 562.3.9 聚丙烯酰胺凝胶电泳 562.4 统计分析 573 结果与讨论 573.1 小麦组织中绿麦隆的含量 573.2 绿麦隆对小麦生长量的影响 583.3 绿麦隆对小麦组织中TBARS含量的影响 583.4 绿麦隆对小麦叶片中叶绿素含量的影响 603.5 绿麦隆对小麦组织中脯氨酸含量的影响 613.6 绿麦隆对小麦叶片中O2- 和H2O2含量的影响 623.7 绿麦隆对小麦组织中抗氧化酶活力的影响 643.8 绿麦隆对小麦SOD、POD

9、、CAT同工酶酶谱的影响 664 结论 67第五章 水溶性有机物对绿麦隆诱导小麦氧化胁迫的影响 711 引言 712 材料与方法 722.1 供试材料 722.2 仪器设备 722.3 试验方法 722.3.1 水溶性有机物的提取 722.3.2 植物的培养和处理 722.3.3 小麦组织中绿麦隆含量的测定 732.3.4 小麦组织中TBARS含量测定 732.3.5 小麦抗氧化酶活力的测定 732.3.6 小麦基因Cu/Zn-SOD和GST的RT-PCR半定量分析 733 结果与讨论 743.1 DOM作用下小麦组织中绿麦隆的含量 743.2 DOM作用下绿麦隆对小麦组织中TBARS含量的影

10、响 753.3 DOM作用下绿麦隆对小麦组织中抗氧化酶活性的影响 763.4 DOM和绿麦隆作用下小麦组织中基因的RT-PCR 半定量分析 804 结论 81参考文献 81第六章 水溶性有机物与绿麦隆结合特征的研究 831 引言 832 材料与方法 842.1 供试材料 842.2 仪器设备 842.3 试验方法 842.3.1 水溶性有机物的提取 842.3.2 DOM元素组成和灰分测定 842.3.3 DOM与绿麦隆结合物的制备 842.3.4 DOM及其与绿麦隆结合物的结构分析 843 结果与讨论 853.1 DOM的理化性质 853.2 DOM及其与绿麦隆结合物的红外光谱分析 863.

11、3 DOM及其与绿麦隆结合物的荧光光谱分析 893.4 E4/E6值变化特征 914 结论 91参考文献 91全文结论 93论文不足之处 95论文创新点 97攻读博士学位期间发表的学术论文目录 99致谢 101水溶性有机物对除草剂绿麦隆环境行为 的影响及其机制研究摘 要化学农药的广泛应用，不可避免地产生了农药残留问题。存在于食品、饲料、水、土壤、空气等环境中的农药残留，给人类健康和生态环境带来一定的危害，农药的环境污染与治理已成为一个全球性问题。农业土壤中残留农药的解吸、运移及其生物毒性严重影响生态环境及农产品安全质量，其环境行为受到广泛关注。水溶性有机物 （dissolved organic

12、 matter，DOM）普遍存在于土壤和水环境中，是陆地-水生态系统中最为活跃的组分，对土壤和水体中污染物的运移起到载体的作用。DOM与农药相互关系的研究对揭示农药在植物根-土、土-水界面的传输机理，阻控土壤中农药对植物与地表水和地下水的污染，以及更科学地对农药的生态风险进行评价具有十分重要的意义。本论文以农业上常用的有机物料（污水污泥和水稻秸秆）为DOM的提取原料，以除草剂绿麦隆研究对象，通过一系列的物理化学、光谱学和生物学等试验，研究了农业土壤中水溶性有机物对农药绿麦隆环境行为的影响，并对有关的机理进行了探讨。用差示扫描量热法（DSC）研究了绿麦隆纯度的测定方法，测定最佳条件为升温速率0.

13、5 K min-1，样品量23 mg，保护气流速20 mL min-1。用本方法测定绿麦隆原药的纯度为98.35 %，相对标准偏差（RSD）为0.034 %。测定结果与已知纯度相符。并将测定结果与高效液相色谱（HPLC）法进行了比较。该法具有操作简便，样品用量少，准确度和精密度均较高等优点。建立了测定土壤、小麦和水体中除草剂绿麦隆残留量的分析方法。采用丙酮超声提取，ENVI-Florisil 固相萃取小柱分离、净化，测定土壤和小麦叶和根中绿麦隆残留量，LC -18 固相萃取小柱分离和富集水中绿麦隆残留量。结果表明：HPLC法检测绿麦隆的线性范围为0.2516 mg L1，相关系数R2 = 0.

14、9992。本研究的检出限为 2.010 - 10 g，最低检测浓度为 0.0125 mg L-1。土壤的加标回收率为 93.6101.2 %，相对标准偏差为 3.54.6 %；小麦叶的加标回收率为 89.798.7 %，相对标准偏差为 3.85.1 %；小麦根的加标回收率为 90.396.1 %，相对标准偏差为 3.44.8 %; 水样的加标回收率为 92.699.9 % 相对标准偏差为 1.23.9 %。通过标准批量平衡法、土柱淋溶法和土壤薄层层析法，研究了两种来源DOM对除草剂绿麦隆在土壤中的吸附-解吸与迁移行为的影响。试验结果表明，DOM能明显抑制土壤对绿麦隆的吸附，增强土壤中绿麦隆的解

15、吸，促进绿麦隆在土壤中的迁移。在所研究的绿麦隆和 DOM 浓度范围内，来源于水稻秸秆的 DOM（ST） 比来源于污泥 DOM（SL）作用显著，而且DOM浓度越高影响越显著。说明农业土壤中水溶性有机物能明显活化土壤中的除草剂绿麦隆，增强其活动性。采用土培盆栽试验研究了土壤中绿麦隆对小麦幼苗毒性的影响。结果表明，在525 mg kg-1绿麦隆浓度范围内，小麦组织中绿麦隆的含量与绿麦隆土壤处理的浓度呈正相关。而小麦的叶长、根长和叶根干重，叶绿素含量等指标与外源绿麦隆的浓度呈负相关。小麦组织中丙二醛的含量在低浓度绿麦隆处理时显著升高，在10 mg kg-1绿麦隆处理下达到最高值，但在更高浓度的农药胁迫

16、中又逐渐降低。随着绿麦隆浓度的增加，小麦叶、根中的脯氨酸、O2- 和H2O2含量呈显著升高，引起植物的氧化胁迫。为消除活性氧引发的氧化损伤，植物在长期的自然选择中形成了一套有效的活性氧清除酶促机制。酶促保护系统包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）。绿麦隆胁迫使小麦叶、根中抗氧化酶POD、SOD和APX活性均显著升高，在1015 mg kg-1绿麦隆处理下达到较高水平，在20 mg kg-1处理下酶活力水平又呈下降趋势。而小麦叶中CAT活性却受到不同程度抑制，且随着绿麦隆浓度的加大逐渐降低。经小麦SOD、POD和CAT同工酶酶谱检测发现这种诱导作用导致

17、小麦组织中酶的表达量增加并且诱导了新的同工酶带产生。研究了DOM作用下绿麦隆对小麦幼苗的毒性影响。在10 mg kg-1绿麦隆和两种来源的50 mg DOC kg-1DOM作用条件下，处理期为4 d时，DOM使小麦叶和根中的绿麦隆含量减小。处理期为10 d时，DOM使小麦叶和根中的绿麦隆含量增大。在不同的时间段，DOM可使绿麦隆胁迫下小麦叶和根中MDA含量，表明DOM缓解了植株的氧化损伤。绿麦隆胁迫下使小麦SOD、POD、CAT和GST活力显著增高，DOM降低了绿麦隆诱导SOD和CAT的活力，但进一步提高了POD和GST的活性。说明DOM可能通过提高POD和GST的活性，增强对H2O2的清除能

18、力，提高了植株的抗氧化能力。使用RT-PCR半定量分析对SOD和GST酶活性变化进行了验证，结果表明，DOM 可以缓解绿麦隆对小麦幼苗的毒性。 采用元素分析、荧光和红外光谱学技术研究DOM与农药的相互作用。试验结果表明，与来源于污泥DOM相比，来源于水稻秸秆DOM中H/C值和灰分含量较低，说明来源于水稻秸秆DOM中含有更多的有机组分和不饱和结构。荧光光谱发现DOM发射和激发光谱波峰的位置都比较靠近土壤富啡酸波峰的波长（450460 nm），说明两种DOM中腐殖类物质主要为土壤富啡酸。红外光谱发现，DOM与绿麦隆结合物在40003000 cm-1、13001500 cm-1和 900600 cm

19、-1的吸收峰发生偏移，表明DOM与绿麦隆结合作用机制是-相互作用和氢键及分配和疏水等作用。DOM与绿麦隆相互作用过程中可能又形成了新的结构更为复杂的物质，其多聚化和芳构化程度明显增大。因此，添加外源DOM可抑制土壤对农药绿麦隆的吸附，促进土壤中残留绿麦隆的解吸，从而增强了土壤中农药的移动性，促进了农药绿麦隆向水体的迁移和植物的吸收。DOM可以通过缓解植株的氧化损伤，提高植株的抗氧化能力来降低绿麦隆对植物的毒害作用。关键词：农药残留；绿麦隆；水溶性有机物；迁移；土壤；小麦EFFECT OF DISSOLVED ORGANIC MATTER ON BEHAVIOR OF HERBICIDE CHL

20、OROTOLURON IN ENVIRONMENT AND ITS MECHANISMABSTRACTPesticides used in agriculture have greatly improved food production. However, extensive use of pesticides in conventional agricultural practices has resulted in continuous and serious environmental pollution. Because of this, public concern over th

21、e residues of pesticides in environment, food and related commodities has increased over the last decades. Since the majority of pesticides occur in the medium of soil, the residues of pesticides constitute the major sources that not only leach to the groundwater but are uptaken by crops as well. Di

22、ssolved organic matter (DOM) is ubiquitous in soil and aqueous environment, and the most active component in terrestrial and water ecosystem. It can facilitate the mobility of contaminants in soil and water. Study on the relationship between DOM and pesticides can help us understand the transferring

23、 mechanism of pesticides on the interface between plant root and soil, soil and water. It can also help to prevent and control contaminating plant, surface water and groundwater by pesticides, and risk assessment of pesticides scientifically. Consequently, this study was carried out to explore the i

24、nfluence of DOM derived from sludge and straw on environmental behavior of pesticide (chlorotoluron) and the associated mechanisms.Differential scanning calorimetry (DSC) was used for determination of purity of chlorotoluron. The optimal testing conditions were studied and the following conditions w

25、ere selected: heating ramp of 0.5 K min-1, sample weight of 23 mg and gas flow rate of 20 mL min-1. The dereloped method was applied to the analysis of the purity of chlotoroluron, and it was found to be 98.35 %, which accord with the result obtained by HPLC. Compared with HPLC, DSC method has some

26、advantages such as less sample required, higher accuracy and shorter time.A method for determination of chlorotoluron residues in soil, wheat and water of environment was developed by SPE-HPLC. Residues in soil and wheat were extracted with acetone, followed by cleanup with ENVI-Florisil SPE column.

27、 Residues in water cleanup with LC -18 SPE column.The extracted samples were analyzed by HPLC-UVD. The correlation coefficients (R2) of this method was 0.9992, and their calibration curves were linear in the range of 0.2516 mg L1, limit of detection was 2.010-10 g, limit of quantification was 0.0125

28、 mg L1. The recoveries ranged from 93.6101.2 % for soil, 89.798.7 % for leaf of wheat, 90.396.1 % for root of wheat and 92.699.9 % for water with the RSD was 3.54.6 %, 3.85.1 %, 3.44.8 % and 1.23.9 %, respectively. Batch experiments, soil columns and soil plate were conducted the effect of DOM on he

29、rbicide chlorotoluron sorption onto soil, desorption from soils and mobility. The results indicated that DOM could markedly constrain sorption of chlorotoluron onto soil, enhance greatly desorption of chlorotoluron from soil and significantly increased the mobility in soil. As compared to sludge fro

30、m DOM, straw from DOM had a stronger effect on chlorotoluron behavior in soil. This effect could be strengthened by the high concentration of DOM. That indicated DOM could activated chlorotoluron in agriculture soil and increased its activity.The soil pot experiment was used to assess chlorotoluron-

31、induced toxicity in wheat. The wheat plants were cultured in the soils with chlorotoluron at concentrations of 025 mg kg-1. Chlorotoluron accumulation in plants was positively correlated with the external chlorotoluron concentrations, but negatively with the plant growth. Treatment with chlorotoluron induced the accumulation of O2- and H2O2 in leaves and resulted in the peroxidation of plasma membrane lipids in the plant. We measured the endogenous proline level and found that it accumulated significantly in chlorotoluron-exposed roots a