脉冲场凝胶电泳.docx

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脉冲场凝胶电泳

脉冲场凝胶电泳（PFGE实验原理、操作步骤和注意事项

【实验原理】

大分子DNA（一般长度超过20kb，在某些情况下，超过40kb在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。

此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别（也称“极限迁移率”，不能分离。

脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10～2000kb之间的DNA片段。

这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显着地依赖于分子大小，DNA越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。

反之，较小的DNA移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。

在许多实用的PFGE方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法（FIGE。

通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳（FIGE设备能把大小范围在10～2000kb的DNA片段分开。

FIGE也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb。

【仪器、材料与试剂】

1.制备DNA样品所需材料

1TEN缓冲液LTris，；LNaCl；LEDTA。

2Seaplaque琼脂糖（EC缓冲液中浓度为2%。

3EC缓冲液（6mol/LTris，；lmol/LNaCl；%

4ESP缓冲液LEDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，lmg/mL蛋白酶K。

5溶葡萄球菌素（5mg/mL。

6RNase（10mg/mL。

7胶模（由常规琼脂糖凝胶制得或购买成品。

8苯甲基横酰氟（PMSFmL于乙醇中。

μg/mL溴化乙锭

2.分离、纯化大的DNA片段所需材料

1紫外递质。

210mg/mLtRNA。

35mol/LNaCl。

4苯酚/氯仿。

53mol/LNaAc，。

695%乙醇。

3.设备

1TBE缓冲液。

2SeakemHGT琼脂糖。

3WideMini-SubCell凝胶电泳设备。

4变速泵或蠕动泵（Bio-RedLaboratory。

5IBIFIJI600HV程序性开关设备。

6缓冲液冷却循环器（Fotodyne，NewBritain，WI或MiniChiller（Bio-RadLaboratory。

【实验步骤】

1.脉冲电场凝胶电泳的DNA样品的制备

为避免大分子DNA在提取过程中断裂，细胞需在琼脂糖凝胶块中进行原位裂解，在本实验中，我们使用金黄色葡萄球菌（StapHylococcus

aureus作为例子。

1取100mL对数生长期金黄色葡萄球菌细胞于4℃，5000g离心5min。

2用20mLTEN缓冲液冲洗沉淀，同样条件离心5min。

之后用10mLEC缓冲液使细胞悬浮。

3取细胞样品与相同体积含2%SeaPLaque琼脂糖的EC

缓冲液迅速混合混匀并等分流溶液至封闭的模块中于4℃凝固，混合前加热至琼脂糖熔解并冷却至50℃。

4对于每一个菌株，需要15～20个凝胶块，将它们放至含有30～45μg/mLRNase（50mL的10mg/mL的

RNase的10mLEC

缓冲液中，于37℃振摇过夜。

5去掉裂解缓冲液，换为10mLESP缓冲液于50℃轻度振摇温育48h。

6将凝胶块放在10mL含有174μg/mL苯甲基磺酰氟（PMSF的TE缓冲液中，室温温育4h（2h换液一次，以灭活ESP中的蛋白酶K。

7用TE清洗琼脂块6h（2h换液一次，置于TE中4℃保存。

2.限制酶消化

提高PFGE的分辨率取决于100～1000kb片段电泳结果的重复率，它与酶切关系密切，可在琼脂糖凝胶块中使用合适的内切酶消化。

（生物秀实验频道

125μL10×反应缓冲液，30U限制酶，加双蒸水至250μL混匀。

2取一个凝胶块置其中，合适温度下温育过夜（按内切酶要求后，用TE缓冲液洗涤并贮存。

3.应用PFGE对样品DNA进行分析

1用×TBE缓冲液制备一个%SeakemHGT琼脂糖凝胶，胶的厚度尽量与样品凝胶块相符。

若用WideMinisubCell

进行电泳的话，50mL该溶液即可。

2胶凝后，小心移去样品梳。

将凝胶块用小刀切成与加样孔一致的大小，将样心地插入加样孔，避免产生气泡。

（若样品在溶液中，以l:

1

的比率与50℃2%Seaplaque琼脂糖相混合，迅速注入加样孔中。

3把胶放入电泳槽内，加缓冲液，刚好覆盖胶的表面即可，缓冲液事先14℃冷却。

4将电泳槽和一个连着稳压电源的程序性开关设备相连。

打开电源，调节蠕动泵到适当流速（5～10mL/rain或打开变速泵至40。

5通过计算机启动极性转换程序。

大于50kb的限制性片段在和正向和反向的电脉冲下得以分离，时间一般为或更长。

小于50kb

的限制性片段在正向和反向的电脉冲（比率为2:

1下得以分离，时间为3～5h。

6在μg/mL溴化乙锭中进行染色并拍照。

4.分离、纯化大的DNA片段

1凝胶染色、分析后，在目的带前（靠近正极处切一个左右的槽，注入%Seaplaque琼脂糖，使之凝固。

2重新打开极性转换开关，用紫外递质检测DNA的迁移，当目的带进入Seaplaque凝胶中时，关闭开关，切下目的带，移至EP管中。

3加入2μL的tRNA，30μL5mol/LNaCl，370μL蒸馏水，在65～70℃之间，化胶并保

温10min。

4苯酚/氯仿500μL抽提两次。

5用倍体积95%乙醇和1/10体积NaAc（3mol/L，于-70℃10min沉淀水相。

再用70%乙醇洗两次并将沉淀溶于TE

缓冲液中。

【注意事项】

1.换缓冲掖时尽可能小心不要碰坏琼脂凝胶。

是一个强烈的蛋白酶共价抑制剂，即有毒又挥发，操作时应在通风橱中进行。

3.用蛋白酶K包埋的材料时50℃温育时间很长（24～48h，有些学者提出如此长时间不必要（Mortimeret

，且可能造成高分子质量DNA降解。

在实验中可视情况而定。

4.琼脂糖凝胶块在TE中4℃可存放数年，如在LEDTA中可存放更长时间。

5.一些高压电源并不适合脉冲电场凝胶电泳，因为这些电源设计时均带有保护电路，它可以检测到负载的突然降低并且引发外加电源自动关闭。

6.由于电压较高，就会产生热量，为了保证温度为14℃，需要一些冷却设备（缓冲液冷却循环器或MiniChiller。

此外，把电泳系统放在一个敞口的冰盒中也可保持恒温。

PFGE（脉冲场凝胶电泳）标准操作规程（SOP

目的：

运用PFGE方法对20Kb至数Mb的DNA进行分子分型

背景知识：

这个试验是公认的操作繁琐，至少要2天，而且每一步操作对结果的好坏都有很大影响，因此，一个严格、标准的操作方法是十分十分必要的。

主体内容：

一、胶块的制备

1、在Falcon2054管上标记样品名称和空白对照，分别加入约2ml细胞悬

浊液（CSB；

2、在eppendorf管上标记好对应样品的名称；

3、在模具上标记好对应样品的名称；

4、用CSB湿润接种环，从培养皿上刮取适量细菌，均匀悬浊于CSB中，

用bioMerieuxVitekcolorimeter测其OD值，并调整至~。

如果OD值大于，加入CSB稀释；如果OD值小于，增加菌量提高其浓度。

5、取400μl细菌悬浊液于相应的eppendorf管中，置于37℃水浴中孵

育5分钟。

将剩余的细菌悬浊液置于冰上直到胶块制备好放在水浴摇床中。

6、从水浴箱中取出eppendorf管，每管加入20μl蛋白酶K（储存液浓度为

20mg/ml混匀，使其终浓度为ml。

7、制备好1%SeakemGold：

1%SDS，放于56℃水浴箱中。

8、在eppendorf管中加入400μl的1%SeakemGold：

1%SDS，用枪头轻轻

混匀。

9、将混合物加入模具，避免气泡产生，在室温下凝固10-15分钟。

注意事项：

（1用后的接种环要放在指定的废弃物容器中。

（2细胞悬浊液、蛋白酶K要置于冰上。

（3在混合细胞悬浊液和1%SeakemGold：

1%SDS时要避免气泡的产生。

（4混合物加入模具时不能产生气泡。

（5在加1%SeakemGold：

1%SDS的过程中1%SeakemGold：

1%SDS要一直放在56℃水浴箱中。

二、细胞的裂解

1、在50ml的screw-captube上做好标记。

2、配制细胞裂解液（CLB：

每5ml细胞裂解液加入25μl蛋白酶K（20mg/ml，使其终浓度为ml，然后颠倒混匀。

注意：

蛋白酶K要置于冰上，配制好的细胞CLB也要置于冰上。

3、每个管子加入5ml蛋白酶K/CLB混合液。

4、如果想使胶块平齐，可以用刀片削去模具表面多余的部分。

（1可重复利用的模具：

打开模具，用小铲的宽头部分将胶块移入相应的screw-cap管中。

（2一次性模具：

撕掉模具下面的胶带，用小铲将胶块捅进相应的screw-cap管中，将模具、胶带、小铲放入废弃物容器中。

5、保证胶块在液面下而不在管壁上。

6、将管子放在54℃水浴摇床中孵育2小时，转速约170转/分钟。

7、将纯水和TE放在50℃水浴摇床中预热。

三、洗胶块

1、从水浴摇床中拿出screw-cap管，盖上绿色的screened-cap。

轻轻倒掉

CLB。

在实验台上轻磕管底使胶块落在管底。

注意：

把管倒置在吸水纸上，使管内液体被尽量排除干净。

随后的操作中也如此。

2、每管中加入15ml预热的纯水。

3、确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上，放回50℃水浴摇床中，摇10分钟。

4、倒掉水，用纯水再洗一次。

、

5、倒掉水，加入15ml预热的TE，在50℃的水浴摇床中摇15分钟。

6、倒掉TE，用TE重复洗三次，每次10－15分钟。

7、倒掉TE，加入10mlTE，放在4℃冰箱保存备用。

注意：

要确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上。

四、胶块内DNA的酶切

1、在eppendorf管上标记好相应的样品及H9812的名称。

2、按照下面的比例配制缓冲液H的稀释液，混匀。

试剂μl/胶块μl/10胶块

纯水180μl1800μl

BufferD20μl200μl

总体积200μl2000μl

注意：

缓冲液要置于冰上。

3、在每个eppendorf管中加入200μl缓冲液H的稀释液。

4、小心从TE中取出胶块放在干净的培养皿上。

5、用刀片切下2mm宽的胶块放入eppendorf管中。

确保胶块在液面下面。

将剩余的胶块放回原来的TE中。

6、用同样的方法处理标准株H9812的胶块。

7、将管子放在37℃水浴中孵育10-15分钟。

8、在用稀释缓冲液孵育的过程中，按照以下的比例配制酶切缓冲液，混匀。

试剂μl/胶块μl/10胶块

纯水175μl1750μl

BufferD20μl200μl

酶（10U/μl5μl50μl

总体积200μl2000μl

注意：

（1将酶置于冰上，用后立即放在－20℃保存。

（2用枪头吸出缓冲液H，避免损伤胶块。

9、每管加入200μl混合液，轻轻在实验台上磕管子的底部，确保胶块在液面的下面。

10、在37℃水浴中孵育至少2小时。

五、加样

（一将胶块直接粘在梳子齿上

1、调整梳子的高度，使梳子齿与胶槽的底面相接触。

用水平仪调整胶槽使

其水平。

2、从37℃水浴中取出胶块，平衡到室温。

3、用枪头吸出酶切混合液，避免损伤或吸出胶块。

4、每管加入200μl×TBE。

5、把梳子平放在胶槽上，把胶块加在梳子齿上。

如果用的是10个齿的梳

子，把标准菌株H9812加在第1、5、10个齿上。

6、用吸水纸的边缘吸去胶块附近多余的液体，在室温下风干约3分钟。

7、把梳子放入胶槽，确保所有的胶块在一条线上，并且胶块与胶槽的底面

相接触。

从胶槽的下部中央缓慢到入100ml熔化的在55℃－60℃平衡的1％SKG。

避免气泡的生成；如果有，用枪头消除。

在室温下凝固30分钟左右。

8、记录加样顺序。

（二将胶块直接加在加样孔内

1、调整梳子的高度，使梳子齿与胶槽的底面有一定间距。

用水平仪调整胶

槽使其水平。

2、把梳子放入胶槽，从胶槽的中央缓慢倒入100ml熔化的在55℃－60℃平

衡的1％SKG。

避免气泡的生成；如果有，用枪头消除。

在室温下凝固30分钟左右。

3、小心拔出梳子。

4、从37℃水浴中取出胶块，平衡到室温。

5、用枪头吸出酶切混合液，避免损伤或吸出胶块。

6、每块胶加入200μl×TBE平衡。

7、用小铲将胶块加入加样孔。

8、用溶化的胶封闭加样孔。

注意：

a可以在加样孔中加入×TBE，利用毛细作用将胶块沉在加样孔底，尽量避免气泡形成。

b记录加样顺序。

六、电泳

1、确保电泳槽是水平的。

如果不水平，调整槽底部的旋钮。

注意：

不要触

碰电极。

2、加入×TBE,关上盖子。

3、打开主机和泵的开关，确保泵设在－70（这时缓冲液的流速约1L/分钟

和缓冲液在管道中正常循环。

4、打开冷凝机，确保预设温度在14℃（缓冲液达到该温度通常需要20分钟左右。

5、打开胶槽的旋钮，取出凝固好的胶，用吸水纸清除胶四周和底面多余的胶，小心的把胶放入电泳槽，关上盖子。

6、设置电泳参数。

7、记录电泳初始电流（通常120－145ma。

8、结束电泳：

关机顺序为：

冷凝机－泵－主机。

七、图像的获取

1、取出胶，放在盛放400mlEB溶液的托盘内（EB储存液浓度为10mg/ml，

1：

10,000稀释，即在400ml水中加入40μl储存液。

注意：

EB是致畸剂。

储存在棕色瓶中的EB稀释液可以用3-5次。

废弃的EB溶液应妥善处理。

2、将托盘放在摇床上摇25-30分钟。

3、放掉电泳槽中的TBE，用1-2L纯水清洗电泳槽，并倒掉液体。

4、戴上手套将用后的EB溶液小心倒入做有标记的棕色瓶中，在托盘中加

入400-500ml纯水，放在摇床上脱色60-90分钟，如果可能每20-30分钟换一次纯水。

5、用GelDoc2000拍摄图像。

注意：

如果背景干扰分析，可进一步脱色30-60分钟。

6、转换成*.1sc文件用于处理分析。

八、数据的分析

图像的读取

电泳图像通常用BIO-RAD的GELDOC2000或其它成像系统来获取。

其它可以替代的成像设备，只要具有CCD相机，可以提供IBM兼容的未压缩的TIFF图像，且分辨力≥768x640像素，能够用BioNumericssoftware（AppliedMaths,Inc.软件与PulseNet数据库中其它图像进行对比分析，也可以运用。

运用GELDOC2000的简单说明：

QUANTITYONE软件

1、点击QUANTITYONE按钮打开该软件。

2、点击菜单FILE→GELDOC。

注意：

需要10－20秒打开窗口。

3、打开抽屉，把胶放在台板上。

胶已经经过EB或GEL-STAR染色并经过充分脱色。

用黑色胶框把胶放在合适的位置。

关上抽屉门。

图像的获取

1、按下EPI-LIGHT按钮打开白光。

2、把胶放在调准网格线内，使胶的加样孔和调准网格线的最上面一条蓝线对齐。

3、保证调准网格线和过饱和按钮被选中。

4、改变镜头的MIDDLERING以调整图像的大（顺时针小（逆时针，使图像占据整个窗口。

如果需要，挪动胶在台板上的位置。

胶的加样孔、下边界和左右边界在屏幕上都应该可以看到。

5、如果需要，按BOTTOMRING以调整相机的焦距。

注意：

焦距的调整只可以偶尔用之，不可用于每一块胶。

可以用尺子帮助调整焦距。

6、按下EPI-LIGHT关掉白光，按下UV按钮打开透射紫外光。

7、点击AUTOEXPOSE以确定大概的曝光时间。

当图像出现在窗口时，AUTOEXPOSE自动关闭而MANUALEXPOSE被激活。

8、点击MANUALEXPOSE的↑↓按钮，调整曝光时间。

而调整饱和度时，点击箭头或TURNTHETOPRING以降低光量（如果图像过饱和，图像显现红色。

注意：

如果出现对话框“曝光可以在－360秒之间波动”，则需通过改变相机的像素以调整饱和度。

调整饱和度使样品条带没有红色很重要，因为这会影响BIONUMERICS软件对胶图像的分析。

而胶加样孔的过饱和属于正常现象。

9、当图像调整的比较满意时，按下FREEZE按钮停止曝光过程。

按下UV按钮关掉紫外光（如果开门时UV灯打开，它会自动关闭。

图像的输出

1、保存图像（*.1sc：

FILE→SAVE。

确保选择正确的路径。

文件默认的名字包括日期、时间和用户。

可以改变文件名。

2、打印文件：

FILE→PRINT→VIDEOPRINT，也可以直接点击屏幕上的PRINT按钮。

3、转为*.TIFF格式：

FILE→EXPORTTOTIFFIMAGE→EXPORT，选择正确的路径。

4、关闭QUANTITYONE程序：

FILE→EXIT。

5、取出胶放在染色盒内。

用软麻布擦掉台板表面多余的液体，用水或70％的异丙醇洗干净。

试剂储存液的配制

1、

gTrisbase溶于650-700ml纯水中，加入80ml6NHCl*，在室温下调pH至，加水终体积至1000ml，高压灭菌。

或者gTris-HCl溶于800ml纯水中，在室温下调pH至，加水终体积至1000ml，高压灭菌。

2、10NNaOH*

400gNaOH小心溶于800ml纯水中，冷却到室温，加灭菌的纯水使终体积至1000ml。

3、MEDTA,pH*

溶于800ml纯水中，加入50ml10NNaOH调pH至，加水终体

积至1000ml，分成数份，高压灭菌。

4、20%SodiumDodecylSulfate（SDS*十二烷基硫酸钠－用于E.coliO157:

H7,SalmonellaandShigellasonnei,PFGE

将20克SDS小心加入装有80ml灭菌纯水的容器中，在35°-45℃轻轻混匀溶解，定容至100ml。

5、20mg/ml蛋白酶K储存液*

100mgProteinaseK粉末溶于5ml灭菌纯水中，混匀，分装在ml离心管中，每管

500-600μl，-20℃保存备用。

6、10XTris-

MTrisbase（108g

MBoricAcid（55g

MEDTA,pH（40mlM

溶于1000ml灭菌的纯水中，高压灭菌

注意：

如果缓冲液有沉淀生成必须丢弃。

7、EthidiumBromide（EB*

10mg/mlEB的储存液用纯水1:

10,000稀释（即100ml水中加入10μl储存液，（500ml水中加50ul。

稀释液在丢弃前可以染5-6块胶。

实验试剂

注意：

用灭菌的玻璃制品、塑料制品和纯水来制备以下试剂。

1、Tris:

EDTABuffer（TE,pH*－（10mMTris-HCL:

1mMEDTA,pH

10ml1MTris-HCL,pH

2mlMEDTA,pH

用灭菌的纯水稀释到1000ml

在E.coliO157:

H7,SalmonellaandShigellasonnei,andCampylobacterjejuniPFGE－用TEBuffer于:

⑴.溶解1%SeaKemGold:

1%SDSagarose

⑵.细菌裂解后洗胶块

在L.monocytogenesPFGE－用TEBuffer于:

⑴.悬浮菌细胞

⑵.细菌裂解后洗胶块

2、CellSuspensionBuffer（CS－100mMTris-HCl:

100mMEDTA,pH

用于E.coliO157:

H7,Salmonella,andShigellasonneiPFGE

10ml1MTris-HCl,pH

20mlMEDTA,pH

用灭菌的纯水稀释到100ml

3、CellLysisBuffer（CLB－50mMTris-HCl:

50mMEDTA,pH+1%N-Lauroyl-Sarcosine,

Sodiumsalt（Sarcosyl，mlProteinaseK（用前再加入

用于裂解E.coliO157:

H7,Salmonella,Shigellasonnei,和Campylobacterjejuni25ml1MTris-HCl,pH

50mlMEDTA,pH

50ml10%Sarcosyl3

用灭菌的纯水稀释到500ml，每5mlCLB加入25μl蛋白酶K储存液（20mg/ml，使其终浓度为mg/ml.

5、TBEBuffer

200ml5XTBE用纯水稀释到2000ml或

100ml10XTBE用纯水稀释到2000ml

注意：

用来稀释5XTBE、10XTBE的纯水可以不灭菌。

6、SeaKemGoldAgarose

－做胶块；－电泳胶

报价seakemgold琼脂糖25g货号50111，1567元人民币。

可打9折。

125g货号50150，BMA，6422元。

7、无菌的超纯水

8、蛋白酶K粉末或蛋白酶K溶液（20mg/ml

6、限制性内切酶

E.coliO157:

H7,Salmonella,Shigellasonnei

－XbaI,，AvrII（同切限制内切酶BlnI，SpeI

（NotI可用于S.sonnei；但不用于E.coliO157:

H7

L.monocytogenes，－AscI,ApaI

Campylobacterjejuni,C.coli，－SmaI,KpnI

器材

1、DadeMicroscanTurbidityMeter

Spectrophotometer

bioMérieuxVitekColorimeter

－调整细胞悬浊液的浓度

2、微波炉－溶胶

3、水浴摇床

－裂解胶块中的细胞（54℃

－用水和TE（50℃洗胶块

4、56℃水浴箱－平衡和保温熔化的胶

5、25℃,30℃,37℃水浴箱－酶切

6、50℃水浴箱－加热用于洗胶块的水和TE，酶切

7、离心机。

8、最少需要两个水浴箱－一个平衡到56℃，另一个到37℃。

如果需要，温度可以上下调动。

ListeriaPFGE中胶块的ApaI酶切需30℃水浴。

耗材

1、无菌的Falcon2054（12-mmx75-mm或Falcon2057（17-mmx100-mm－用于细胞悬浊液的制备

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