分子生物学教案内容实验.docx
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分子生物学教案内容实验
讲次
1
日期
2013-11-11
节次
1-2,3-4节
授课内容
实验一实验基础仪器设备及基本技能
授课学时
2
教学目的
通过板书、实物演示、操作等教学方式，让学生初步学习和掌握分子生物学实验的基本知识和基本技能，了解分子生物学实验常用仪器设备，熟悉常用仪器设备、耗材。
教学重点
分子生物学实验的基本技术和技能，分子生物学实验中常用的仪器设备使用方法及注意事项。
教学难点
分子生物学实验中常用的仪器设备使用方法及注意事项。
教具和
媒体使用
黑板教学
教学方法
讲授法、操作演示法
教
学
过
程
课程介绍5分钟
新课讲授90分钟
1.分子生物学实验规程
2.分子生物学实验设备
1）温度控制系统：
冰箱：
4℃、-20℃、-70℃--样品、试剂和材料等的保存
2）恒温培养箱：
细菌平板的培养
3）恒温空气摇床；菌体的培养
4）灭菌器:
培养基、试剂、耗材等的灭菌
5）PCR仪：
PCR扩增、保温实验等
6）恒温水浴及微量加热器：
保证实验温度的恒定
7）电泳仪：
电泳时提供电压和电流
8）电泳槽：
核酸或蛋白质的电泳定性分析时的凝胶支架
9）凝胶成像系统：
电泳结果的定性和定量分析
10）紫外分析仪：
电泳结果的定性分析
11）台式高速冷冻离心机：
样品的分离
12）分光光度计：
样品的定量测定
13）超净工作台：
提供洁净工作环境
14）pH计：
精确的pH值测定
15）移液器；液体试剂的精确取量
16）制冰机：
保证操作过程中温度的恒定
总结5分钟
思考题
1、完成一篇分子生物学实验安全预案。
讲次
2
日期
2013-11-13
节次
1-2,3-4节
授课内容
实验二实验准备及实验规范训练
授课学时
2
教学目的
学会分子生物学常用仪器设备的使用方法和试剂的配制方法，配制实验三所需的药品
教学重点
分子生物学常用仪器设备的使用方法和试剂的配制方法
教学难点
配制实验三所需的药品
教具和
媒体使用
黑板教学
教学方法
讲授法、实验操作法
教
学
过
程
上节课程总结5分钟
新课学习90分钟
1.分子生物学实验仪器训练
学生以小组为单位，操作分子生物学主要实验仪器。
2.分子生物学基本技术
2.1实验规范训练－仪器的操作
要求：
1仪器在未经培训前，不得擅自使用
2严格按操作规程使用仪器，
3有些仪器必须有教师在场时才能使用，并由教师操作
4违反规定的使用者，造成的后果由使用者承担
2.2实验规范训练－量程的选择
1天平
2烧杯、量筒、容量瓶、试剂瓶－－不同规格
3量程的选择－移液器
2.3实验规范－实验操作
1详细记录和分析实验结果并按时提交实验报告
2实验中一定要处处用心、勤动手，多问为什么
3仔细操作和观察
4保留好每一步的实验样品，在确准的情况下才能当废液扔掉
3.配制试剂：
蛋白酶K购自美国Promega公司；Tris、EDTA、SDS、Tris饱和酚、三氯甲烷、无水乙醇、硼酸、冰乙酸等均购自北京及其他国内外化学试剂公司。
提取DNA所用相关溶液的配制（试剂的配制若无特别要求，均以蒸馏水为溶剂，高压灭菌条件为121℃（1.034×105Pa）、25min）：
⑴1MTris.CL（pH8.0）：
称Tris121.1g,溶于800ml蒸馏水中，用磁力搅拌器搅拌，用浓HCl调pH至8.0，定容至1000ml，分装后高压灭菌。
⑵0.5MEDTA（pH8.0）：
称186.1gEDTA溶于800ml蒸馏水中，用NaOH调pH至8.0，加水定容至1000ml，高压灭菌。
⑶0.5MNaCL：
5.844gNaCL溶于双蒸水中，定容至200ml,高压灭菌。
⑷SDS（10％）：
在900ml水中溶解100g电泳级SDS，加热至68℃助溶，用盐酸调pH至7.2,加水定容至1000ml，过滤膜过滤，室温保存，无需灭菌。
⑸组织DNA提取液配方：
1MTris.CL（pH8.0）5ml，0.5MEDTA（pH8.0）20ml，0.5MNaCL20ml，10%SDS10ml，双蒸水45ml。
⑹蛋白酶K（20mg/ml）：
200mg蛋白酶K溶于10ml双蒸水，以1ml分装，20℃冻存。
总结5分钟
思考题
1、完成训练过程，记录仪器使用心得。
2、配制试剂中出现何问题？
如何处理？
讲次
3
日期
2013-11-18
2013-11-20
节次
1-4节
授课内容
实验三组织基因组DNA的提取
授课学时
4
教学目的
掌握动物总DNA的抽提方法和基本原理。
教学重点
动物总DNA的抽提技术和基本原理。
教学难点
动物总DNA抽提的基本原理。
教具和
媒体使用
黑板教学
教学方法
讲授法、实验操作法
教
学
过
程
上节课程总结5分钟
新课学习190分钟
一、实验目的：
二、实验原理：
十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate，简称SDS）等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。
再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸（DNA、RNA）水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。
上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得动物物总DNA溶液。
三、实验材料：
猪皮肤组织
四、主要仪器
低温冰箱，冷冻高速离心机（美国），移液器，制冰机
五、步骤：
用眼科手术剪将约0.3g组织块剪碎，置于1.5ml离心管里，干燥20min
加入500l组织DNA提取液
加入蛋白酶K至终浓度为150g/ml，充分混匀，55℃消化12-24h
（以组织样消化完全，呈透明状为宜）
加入等体积的Tris饱和酚，缓慢颠倒离心管10min使溶液的两相充分混匀，
4℃12000rpm，离心10min
转移上清至另一离心管中，重复上一步骤1～2次。
教
学
过
程
转移上清至另一离心管中，再分别用等体积的苯酚:
氯仿（1:
1），氯仿，
4℃12000rpm，离心10min
转移上清至另一离心管中，加入1/10体积的3MNaAc（pH5.2）和2倍体积的冰冻无水乙醇沉淀DNA，温柔的上下颠倒几次
将DNA沉淀挑出，置于1.5ml离心管。
将DNA自然晾干（注意不能太干，否则不易溶解）后溶入适量1×TE或超纯水中备用。
（TE较超纯水要更好，可以使DNA更稳定）
总结、分析5分钟
思考题
作业
1、完成实验报告，基因组DNA提取过程中各组分的作用是什么？
2、本实验操作的关键点是什么？
讲次
4
日期
2013-11-21
节次
1-2，3-4节
授课内容
实验四琼脂糖凝胶电泳
授课学时
2
教学目的
通过本实验掌握琼脂糖凝胶电泳技术的基本原理和操作技术。
教学重点
琼脂糖凝胶电泳技术的基本原理和操作技术。
教学难点
琼脂糖凝胶电泳技术的基本原理
教具和
媒体使用
黑板教学
教学方法
讲授法、实验操作法
教
学
过
程
上节课程总结5分钟
讲授25分钟
一、实验目的
二、实验原理
琼脂糖凝胶电泳的原理：
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。
DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。
不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。
琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。
溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外照射下发射荧光。
EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA的含量成正比。
用肉眼观察，可检测到5ng以上的DNA。
但是EB有致畸和致癌性，本实验中用与EB相似功能但未发现致畸和致癌性的GoldView作为核酸染料。
三、实验材料及相关试剂
基因组DNA，琼脂糖，50XTAE，上样缓冲液
四、主要实验仪器：
电泳仪、水平电泳槽、微波炉、紫外分析仪。
五、实验步骤
（1）制胶（以30mL为例）
a.称取0.24g琼脂糖，加入30ml的1XTAE缓冲液（pH8.0），摇匀。
b.微波炉上加热，至琼脂糖完全溶解；
教
学
过
程
c.用凝胶将制胶板两端封好，插入适当的梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃），加入适量核酸染料，倒入制胶板中，在室温下冷却凝固（约30~45min）；
d.将制胶板置于电泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。
（2）点样
（3）电泳
打开电源开关，调节电压至130V，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约20分钟后即可观察。
（4）观察
将电泳好的胶置于紫外分析仪，可见到绿色核酸条带，根据条带粗细，可粗略估计该基因组DNA的浓度。
实验操作55分钟
总结、分析10分钟
思考题
作业
完成实验报告，对本组实验操作关键点及结果进行分析？
讲次
5
日期
2013-11-25
2013-11-27
节次
1-4节
授课内容
实验五PCR扩增及检测
授课学时
4
教学目的
通过本实验掌握PCR反应的基本原理，PCR的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术检测PCR产物。
教学重点
学习PCR的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术检测PCR产物。
教学难点
PCR的基本操作技术
教具和
媒体使用
黑板教学
教学方法
讲授法、实验操作法
教
学
过
程
讲授新课25分钟
一、实验目的
二、实验原理
PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段，即通过引物延伸而进行的重复双向DNA合成。
基本原理及过程如下：
PCR循环过程中有三种不同的事件发生：
（1）模板变性；
（2）引物退火；（3）热稳定DNA聚合酶进行DNA合成。
1．变性：
加热使模板DNA在高温下（94-95℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。
2．退火：
在体系温度降至37-65℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，使引物与模板链3’端结合，形成部分双链DNA，即退火阶段。
3．延伸：
体系反应温度升至中温72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5’到3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。
上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。
从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍。
典型的PCR反应体系由如下组分组成：
DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成的DNA引物、耐热DNATaq聚合酶。
教
学
过
程
三、实验材料及相关试剂
基因组DNA，基因特异性引物，PCR扩增相关试剂，等
四、实验仪器
PCR仪，电泳仪、水平电泳槽、紫外分析仪、电炉
五、实验步骤
1．模板DNA：
实验二所得基因组DNA。
2．PCR操作（在冰上操作）：
（1）PCR反应混合液的配制：
反应体系25µL,在无菌的0.2mL离心管中按下列操作程序加样：
反应物
体积/µL
ddH2O
18.2
10xBuffer
2.5
2.5mmol/LdNTP
2
10pM上游引物
1
10pM下游引物
1
DNATaq聚合酶
0.3
（2）将PCR管放到PCR热循环仪中，按下列程序开始循环：
94℃4min（预变性）94℃30sec,~60℃30sec,72℃30sec72℃8min
30个循环
3.PCR产物检测
实验操作170分钟
总结、分析5分钟
思考题
作业
1．PCR反应液中主要成分是哪些？
在PCR反应过程中各起什么作用？
2．用PCR扩增目的基因，要想得到特异性产物需注意哪些事项？
讲次
6
日期
2013-12-2
2013-12-4
节次
1-3,7节
授课内容
实验六SSCP技术分析基因多态性
授课学时
4
教学目的
掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理及操作技术，学会用SSCP技术进行基因分型。
教学重点
聚丙烯酰胺凝胶电泳的分析基因多态性的原理及操作技术，基因分型
教学难点
聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，基因分型
教具和
媒体使用
黑板教学
教学方法
讲授法、实验操作法
教
学
过
程
讲授新课40分钟
一、实验目的掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理及操作技术，学会用SSCP技术进行基因分型。
二、实验原理聚合酶链反应-单链构象多态性分析（SingleStrandConformationPolymorphismAnalysisofPolymeraseChainReactionProducts,PCR-SSCP）是近年来发展起来的一种基因分析方法。
其基本原理为：
将PCR扩增产物变性为单链，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外，更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。
在非变性条件下，DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象。
这种构象由DNA单链碱基决定，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用（主要为氢键）来维持。
相同长度的DNA单链其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率也不同。
PCR产物变性后，单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，靶DNA中含单碱基置换，或数个碱基插入或缺失等改变时，因迁移率变化会出现泳动变位，从而可将变异DNA与正常DNA区分开。
由此可见，PCR-SSCP分析技术是一种DNA单链凝胶电泳技术，它根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。
该技术已被广泛用于癌基因和抗癌基因变异的检测、遗传病的致病基因分析以及基因诊断、基因制图等领域。
三、试剂准备
1.PCR相关试剂
2.30％聚丙烯酰胺（29：
1）：
丙烯酰胺29g、甲叉双丙烯酰胺1g，溶于100mlddH2O中，4℃保存。
3.10％过硫酸胺配制方法：
1g过硫酸胺，溶于10mlddH2O中，4℃保存（可用数周）。
4.TEMED（N，N，N，N’，N’-四甲基乙二胺）
5.5×TBE缓冲液：
Tris碱54g、硼酸27.5g、0.5MEDTA（pH8.0）20ml，加ddH2O至1000ml。
6.变性上样液：
95%甲酰胺、0.03%二甲苯青、0.05%溴酚蓝、20mMEDTA（pH8.0）
教
学
过
程
四、操作步骤
1.非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：
清洗制胶用的玻璃板并用蒸馏水冲洗干净，晾干，使用时安装电泳板
（注：
安装时把胶条在蒸馏水中润湿可以起到封闭玻璃板和胶条间缝隙的作用）
↓
在100ml小烧杯内加入适量（表4-1）的40％的丙烯酰胺、5×TBE、10%的过硫酸铵、TEMED和水，混匀后迅速灌胶
↓
当胶灌至离玻璃板上沿1cm时停止灌胶，插入梳子，室温聚合30min左右，
多余的丙烯酰胺4℃保存，随时观察凝胶聚合情况再补加丙烯酰胺
↓
凝胶聚合好后，拔掉梳子，立即用1×TBE冲洗点样孔
↓
向电泳槽中加入1×TBE，200V预电泳20min，同时准备点样
↓
2lPCR产物置于PCR管中，加8lSSCP变性缓冲液，98℃变性10min
↓
迅速冰浴10min，上样
↓
接通电源，电压160V～180V，16℃下电泳12～15h
（S1～S18在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的最佳条件见表4-3）
2.银染观察电泳结果：
电泳结束后关上电泳仪，小心取出凝胶，用去离子水快速洗胶1遍
↓
置于20%乙醇中固定15min
↓
用去离子水快速洗胶1遍
↓
用1％硝酸氧化3min
↓
用去离子水快速洗胶1遍
↓
用0.1％硝酸银染色30min
↓
用去离子水快速洗胶1遍
↓
用去离子水快速洗胶1遍
↓
用500ml显色液（加入针尖大的一粒硫代硫酸钠，400l甲醛）显色
↓
待条带清晰后，倒去显色液，用去离子水快速洗胶1遍
↓
用4％醋酸停显
↓
保鲜膜封好保存或拍照
五、注意事项
1、核酸片段的大小：
用于SSCP分析的核酸片段越小，检测的敏感性越高。
对于<200bp的片段，SSCP可发现其中70％的变异；对于300bp左右的片段则只能发现其中50％的变异；而＞500bp的片段，则仅能检出10％～30％的变异，因此，<300bp，尤其是150bP左右的核酸片段更适于SSCP分析。
对于大于400bp的PCR产物就需要设法进一步处理，可以用限制性酶消化PCR产物，产生小于400bp的DNA片段，再进行SSCP分析。
2、低浓度变性剂:
凝胶中加入低浓度的变性剂，如5％-10％甘油、5％尿素或甲酸胺、10％二甲亚砜（DMSO）或蔗糖等有助于提高敏感性，可能是因为轻微改变单链DNA的构象，增加分子的表面积，降低单链DNA的泳动率。
但有些变异序列却只能在没有甘油的凝胶中被检出。
3、电泳温度：
一般认为保持凝胶内温度恒定是SSCP分析最关键的因素，温度有可能直接影响DNA分子内部稳定力的形成及其所决定的单链构象，从而影响突变的检出。
室温下电泳适于大多数情况，但由于在电泳时温度会升高，为确保电泳温度相对恒定，应采取以下措施：
减少凝胶厚度，降低电压，有效的空气冷却或循环水冷却等。
4、凝胶浓度及厚度：
凝胶浓度很重要，一般使用5％～8％的凝胶，凝胶浓度不同，突变带的相对位置也不相同，如果在进行未知突变种类的SSCP分析时，最好采用两种以上凝胶浓度，这样可以提高突变种类的检出率。
凝胶的厚度对SSCP分析也很重要，凝胶越厚，背景越深，在上样量较多的前提下，尽量使凝胶越薄越好。
5、假阴性：
一般认为，如没有污染，PCR－SSCP分析不存在假阳性结果，但可能出现假阴性结果，后者是由于点突变引起的空间构象变化甚微，迁移率相差无几所致，尤其是点突变发生在扩增片段的两端时。
如果有阳性和阴性对照，结果可以重复确定的突变带是可信的，如果没有阳性对照，应经测序来确定其是否为突变带。
由于PCR－SSCP的不足之处主要是可能检出假阴性结果。
应通过设置阳性对照，摸索电泳条件，假阴性结果在很大程度上是可以避免的。
但对未知基因变异的检测，假阴性结果就难以百分之百地消除。
6、结果分析：
单链凝胶电泳时，互补单链迁移率不同，一般形成两条单链带。
PCR产物进行单链凝胶电泳之前，通过加热变性产生单链。
如变性不彻底，残留双链亦可形成一条带．因此，PCR－SSCP分析结果至少显示三条带。
实验操作150分钟总结、分析10分钟
思考题
作业
简述聚丙烯酰胺凝胶电泳分析基因多态性的原理？
讲次
7
日期
2013--12-5/9
节次
1-4节
授课内容
实验七目的DNA片段的纯化
授课学时
4
教学目的
掌握从琼脂糖凝胶中回收DNA。
教学重点
从琼脂糖凝胶中回收DNA的技术。
教学难点
提高琼脂糖凝胶中回收DNA纯度和回收率的关键步骤。
教具和
媒体使用
黑板教学
教学方法
讲授法、实验操作法
教
学
过
程
讲授新课25分钟
一、实验目的掌握从琼脂糖凝胶中回收DNA。
二、实验原理琼脂糖凝胶具有分子筛作用，通过琼脂糖凝胶电泳把PCR产物进行分离，然后在紫外灯下切取目的片段，用胶回收试剂盒进行纯化。
三、实验材料
PCR产物，eppendorf管，离心管架，1000ul、200ul枪头，一次性滤膜（0.22um），大量碎冰，胶回收试剂盒。
四、实验仪器设备
微量移液器（20μl,200μl,1000μl），高压蒸汽消毒器（灭菌锅），离心机，恒温水浴锅，冰箱等。
五、操作步骤
①向胶块中加入3倍体积的溶胶液，50℃水浴10min（依据凝胶溶解情况可以适当延长或缩短时间），并不断温和的翻转离心管以充分混匀胶块；
②胶块完全溶解后，待胶溶解液降至室温（以提高吸附柱对DNA的吸附能力）转入吸附柱中（加入后室温静置1min左右，以提高吸附柱的吸附能力），12000rpm离心1min，弃去收集管中的废液；
③加入700l漂洗液，12000rpm离心30s，弃去收集管中的废液；
④加入500l漂洗液，12000rpm离心30s，弃去废液；
⑤将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去残留的漂洗液；
⑥将吸附柱置于室温或50℃干燥箱数分钟，彻底晾干（以防止残留的漂洗液影响回收效率和DNA质量）；
⑦将吸附柱放入一新的离心管，加入35l洗脱液，（洗脱液在65～70℃中预热，以提高洗脱效率），室温放置2min，12000rpm离心1min。
⑧如果需回收更多DNA，可将上一步离心得到的溶液重新步骤⑦。
⑨琼脂糖凝胶电泳检测回收的DNA片段。
实验操作170分钟
总结、分析5分钟
思考题
作业
从琼脂糖凝胶中回收DNA注意事项有哪些？
如何提高回收效率？
讲次
8
日期
2013-12-11/12
2013-12-18/19
节次
1-4节,1-2节
授课内容
实验八DNA重组
授课学时
6
教学目的
把体外重组的DNA引入受体细胞，使受体菌具有新遗传性，并从中选择出重组子。
教学重点
掌握重组DNA技术及重组子鉴定的方法和原理
教学难点
重组子鉴定的原理
教具和
媒体使用
黑板教学
教学方法
讲授法、实验操作法
教
学
过
程
讲授新课40分钟
一、实验目的把体外重组的DNA引入受体细胞，使受体菌具有新遗传性，并从中选择出重组子。
二、实验原理外源DNA与载体的连接就是DNA重组，由DNA连接酶完成的。
pGMD-19T的LacZ基因区域当有DNA片段插入时，LacZ基因失活，转化进入大肠杆菌
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