冠心病气虚血瘀证大鼠模型的建立.docx

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冠心病气虚血瘀证大鼠模型的建立

冠心病气虚血瘀证大鼠模型的建立

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用疲劳跑步运动复合左冠状动脉前降支高位结扎的方法建立冠心病气虚血瘀证病证结合大鼠模型。

该实验选用Wistar雄性大鼠，随机分为假手术组（JSS）、单纯结扎冠脉组（DZ）、疲劳跑步运动复合结扎冠脉组（PZ）。

DZ组进行单纯冠脉结扎；PZ组利用小动物跑台进行为期2周的跑步运动造成疲劳模型，在此基础上进行冠脉结扎，术后以1次/2d的频率维持28d的力竭跑步；于术后28～31d观察大鼠宏观体征，分别采集大鼠超声心动检测指标、呼吸幅度对大鼠冠心病气虚血瘀证的主症进行评价；采集空场实验相关指标、力竭运动时间、足底图像色彩饱和度对兼症进行评价；采集舌面色彩饱和度对舌象进行评价；采集脉搏搏动幅度对脉象进行评价。

同时对血液流变学、凝血功能等指标进行检测。

结果显示，术后第28天开始，PZ组大鼠主症、兼症、舌象、脉象均符合冠心病气虚血瘀证证候表现，结合相关病理性检测结果证明以疲劳跑步运动复合左冠状动脉前降支高位结扎的方法在大鼠体内可以成功建立冠心病气虚血瘀证病证结合模型。

　　[关键词]冠心病；病证结合；气虚血瘀证；大鼠；动物模型

　　[Abstract]ToestablishQideficiencyandbloodstasissyndrometypecoronaryheartdiseasemodelsbyfatiguerunningexerciseandhighligationofleftanteriordescendingcoronaryartery（LAD），maleWistarratswereselectedandrandomlydividedintoshamoperationgroup（JSS），coronaryligationgroup（DZ），fatiguerunningexercise+coronaryligationgroup（PZ）CoronaryligationalonewasdoneinDZgroup；whiletheratsinPZgrouphadrunningexerciseinontheanimaltreadmillsystemfor2weekstoestablishfatiguemodels，andthencoronaryligationwasdonebasedonthemodelsTheexhaustedrunningwasmaintainedfor28daysatthefrequencyof1time/2daysafteroperationTwentyeighttothirtyonedaysaftertheoperation，alltheratswereobservedformacroscopicphysicalsigns，andultrasonicechocardiographyindexesandbreathingextentoftheratswerecollectedtoevaluatethemainsymptomsofratswithQideficiencyandbloodstasissyndrometypecoronaryheartdisease；relatedindexesofopenfieldtest，exhaustiverunningtime，andcolorimetricanalysisdataonimagesofplantarwerecollectedtoevaluatetheaccompaniedsymptoms；colorimetricanalysisdataonlingualsurfacewascollectedtoevaluatethetonguecharacteristics；pulsedistensiondatawascollectedtoevaluatethepulsecondition，andmeanwhile，bloodrheologyandcoagulationfunctionwerealsodetectedFromthe28thdaypostoperatively，themainsymptoms，accompaniedsymptoms，tonguecharacteristicsandpulseconditionsofratsinPZgroupconformedtothesymptomsofcoronaryheartdiseaseandQideficiencyandbloodstasissyndromeCombinedwithrelatedpathologicalresults，thestudyrevealedthatQideficiencyandbloodstasissyndrometypecoronaryheartdiseasemodelscouldbesuccessfullyestablishedbyfatiguerunningexerciseandhighligationofleftanteriordescendingcoronaryarteryfortherats

　　[Keywords]coronaryheartdisease；diseasesyndromecombination；Qideficiencyandbloodstasis；rat；animalmodel　　233超声心动检测方法术后第29天，利用异氟烷维持大鼠麻醉状态后[维持大鼠心率在（350±20）bpm]，对大鼠胸部左侧锁骨至肋骨下缘进行备皮处理。

在左室长轴及胸骨旁短轴各切面进行二维扫查，选用左室短轴切面M超测量计算左室收缩末内径（LVIDs），左室舒张末内径（LVIDd），左室收缩末容积（LVsVol），左室舒张末容积（LVdVol），射血分数（EF），短轴缩短率（FS），各项指标均连续测量3个周期，取平均值。

　　234大鼠呼吸幅度、脉搏幅度检测术后第29天，利用2%异氟烷维持大鼠麻醉状态后，利用MouseOx小动物无创脉搏血氧仪对大鼠呼吸幅度、脉搏幅度进行检测。

记录每只动物连续10个有效数据，取平均值。

　　235大鼠空场实验相关指标检测术后第30天进行，空场实验室保持安静，室内暗光，实验人员位置以操作角度无法观测到箱中实验动物为准。

空场测试箱直径80cm，高50cm，内壁与底部涂黑。

实验前，将动物在测定房间中适应10min。

实验开始时捏住大鼠尾巴距根部1/2处放入测试箱底部中心，显示器中观察动物10min内活动情况，每次测定结束后将动物排泄物清理干净，并用75%乙醇擦拭箱底驱散气味。

实验结束后利用软件进行录像分析。

描绘动物运动轨迹，测量动物运动距离、平均速度、运动时间。

　　236大鼠力竭运动时间测定术后第30天将大鼠放进小动物实验跑台（跑台速度25m?

min-1，电击强度15mA）进行力竭跑步测试。

以大鼠3s内被连续电击5次仍无法跑步为标准判断是否力竭。

记录时间。

　　237大鼠血液流变学、凝血功能检测各组大鼠在术后第31天，禁食24h后腹腔注射35%水合氯醛（10mL?

kg-1）麻醉，腹主动脉取血3mL，加入肝素化抗凝试管中，立刻进行血液流变学测定。

腹主动脉取血3mL，38%柠檬酸钠抗凝，常温1800×g离心10min，进行凝血酶时间（TT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）、纤维蛋白原（FIB）含量检测，操作步骤按照说明书进行。

　　238大鼠心肌MASSON染色心脏切片脱蜡至水，经过天青石蓝、Mayer氏苏木素、丽春红苦味酸、1%淡绿等染色后，再脱水，树胶封固。

显微镜下观察，胶原纤维染为蓝色，胞核染为蓝黑色，肌纤维染为红色。

　　239大鼠心肌HE染色大鼠心肌组织放于4%多聚甲醛固定24h，石蜡包埋，切片（5μm），苏木精伊红染色，光学显微镜下观察心肌结构。

　　24统计学方法

　　统计软件采用SPSS200进行统计。

实验获得的各数据以±s表示。

若数据符合正态分布方差齐用LSD检验反之用Tamhane′sT2检验。

P<005表示差异有统计学意义。

　　3结果

　　31大鼠术后3d心电图检测及术后28d一般状态

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g后第3天单纯高位结扎组、疲劳运动复合高位结扎组大鼠心电图中出现异常Q波，假手术组大鼠心电图正常；术后28d单纯高位结扎组、疲劳运动复合高位结扎组大鼠精神萎靡，被毛枯黄失去光泽，活动度降低，喜欢聚拢在一起，嗜睡，对外界刺激反应迟钝，稀便；假手术组大鼠状态正常。

疲劳运动复合高位结扎组大鼠与假手术组大鼠比较，体重下降，存在统计学差异（P<005）；疲劳运动复合高位结扎组大鼠与单纯高位结扎组大鼠比较，体重有所下降，但不存在统计学差异；单纯高位结扎组大鼠与假手术组大鼠比较，体重有所下降，但不存在统计学差异，见表2。

　　32大鼠足底、舌面图片分析

　　术后28d观察单纯高位结扎组、疲劳运动复合高位结扎组大鼠鼻尖、口唇、掌心、舌面与假手术组大鼠比较，均发生不同程度的变紫变暗，见表3。

本研究着重记录大鼠右侧后肢足底及舌面的R，G，B值，单纯高位结扎组、疲劳运动复合高位结扎组大鼠与假手术组大鼠比较，足底R，G，B值均显著降低（P<001）；疲劳运动复合高位结扎组大鼠与单纯高位结扎组大鼠比较，足底R，G值有所降低，但不存在统计学差异。

单纯高位结扎组、疲劳运动复合高位结扎组大鼠与假手术组大鼠比较，舌面R，G，B值均显著降低（P<001）；疲劳运动复合高位结扎组大鼠与单纯高位结扎组大鼠比较，足底G，B值有所降低，但不存在统计学差异。

　　33大鼠超声心动图检测

　　术后第29天，单纯高位结扎组、疲劳运动复合高位结扎组大鼠与假手术组大鼠比较，EF，FS显著下降（P<001），LVIDd，LVIDs，LVd，LVs显著上升（P<001）；疲劳运动复合高位结扎组大鼠与单纯高位结扎组大鼠比较，EF，FS显著下降（P<001），LVIDs和LVs显著上升（P<005），LVd上升但不存在统计学差异，见表4。

　　34大鼠呼吸幅度、脉搏幅度检测

　　术后第29天单纯高位结扎组、疲劳运动复合高位结扎组大鼠与假手术组大鼠比较，呼吸幅度、脉搏幅度显著下降（P<001）；疲劳运动复合高位结扎组大鼠与单纯高位结扎组大鼠比较，呼吸幅度、脉搏幅度显著下降（P<001），见表5。

　　35大鼠空场实验相关指标、力竭运动时间检测结果

　　术后第30天，单纯高位结扎组大鼠与假手术组大鼠比较，运动距离、爬壁次数、力竭运动时间显著下降（P<005，P<001），平均速度、运动时间下降但不存在统计学差异；疲劳运动复合高位结扎组大鼠与假手术组大鼠比较，运动距离、平均速度、运动时间、爬壁次数、力竭运动时间显著下降（P<005，P<001）；疲劳运动复合高位结扎组大鼠与单纯高位结扎组大鼠比较，运动距离、平均速度、运动时间、爬壁次数、力竭运动时间下降，但不存在统计学差异，见表6。

　　36大鼠血液流变学检测

　　术后第31天，单纯高位结扎组、疲劳运动复合高位结扎组大鼠与假手术组大鼠比较，在低切变率、高切变率下的全血黏度显著升高（P　　37大鼠凝血功能检测

　　术后第31天，单纯高位结扎组、疲劳运动复合高位结扎组大鼠与假手术组大鼠比较，PT，APTT，FIB降低，TT升高，但不存在统计学差异；疲劳运动复合高位结扎组大鼠与单纯高位结扎组大鼠比较PT，FIB降低，APTT，TT升高，但不存在统计学差异，见表8。

　　38大鼠心肌Masson染色

　　假手术组大鼠心肌染色以红色的心肌细胞为主，心肌组织分布均匀，结构清晰，细胞排列整齐，

　　4讨论

　　本实验室在建立各类动物模型的探索过程当中，逐步形成了“病证结合动物模型拟临床”这一概念。

原则上首先在实验动物的选择上应尽量选择与人类接近或相似的动物[8]，在冠心病气虚血瘀证动物模型的建立当中，因为心血管系统与人类颇为相似所以小型猪是最为适合的实验动物，但由于实验动物价格较为昂贵，并且在实际应用过程中推广起来有一定难度，所以本研究选用大鼠作为实验动物。

其次选用无创或微创的手段获取有价值的实验数据[8]。

本研究在造模的手术方法中，选取了创伤最小（皮肤切口15cm），手术过程时间最短（约30s）的方法，尽量减小对原有胸腔稳定环境的破坏。

最后动物模型的建立方法应最大可能符合疾病实际的发展过程[8]，由于大鼠具有抵抗动脉粥样硬化形成的能力，在大鼠身上模拟冠脉粥样硬化又有一定难度，所以目前大鼠冠心病心衰模型的建立方法主要有注射异丙肾上腺素[9]、脑垂体后叶素[9]、麦角新碱[10]、冠脉结扎[11]等方法。

针对大鼠气虚血瘀证候模型的建立方法主要有游泳+饥饿+高脂饮食[12]、老年+阿霉素+外伤[13]、饥饿+心得安+高分子右旋糖酐[14]、甲硝基亚硝基胍+雷尼替丁+饥饱失常的综合法[15]、饥饿+疲劳+寒凉[16]、力竭游泳+皮下注射肾上腺素[17]、饥饿+高脂饮食+寒湿或+惊恐[18]。

目前冠心病气虚血瘀病证结合动物模型的建立过程中最为突出表现的问题是建立模型的干预因素无法有机结合与临床实际发病原因相脱节。

本研究遵循中医病因病机“血瘀多由日久气虚所致，血瘀进一步阻滞气机致虚”，先通过呈阶梯递增强度的跑步运动使大鼠处于疲劳状态，模拟人体生理上呈现出的疲劳状态，正气消耗开始出现气虚证的表现；在此基础上结扎大鼠冠状动脉前降支，模拟人体心肌梗死的发生，日久气虚导致心脉瘀阻；术后维持一定强度的跑步运动，继续模拟人类正气的消耗，由心肌梗死导致心力衰竭过程的发生，伴随气虚血瘀证候的出现。

　　本研究在模型评价体系的建立当中，参照临床冠心病致心力衰竭气虚血瘀证侯诊断标准：

胸痛胸闷，心悸气短，身倦乏力，面色紫暗，舌淡紫，脉弱而涩。

同时考虑到实验动物本身特点，制定大鼠冠心病气虚血瘀中医证候诊断标准如下。

主症（胸痛胸闷、心悸气短）：

用反映心脏功能的超声心动图指标诊断是否胸痛胸闷；用呼吸幅度诊断是否心悸气短。

兼症（身倦乏力、面色紫暗）：

用反映大鼠运动能力的空场实验指标、力竭运动时间诊断是否身倦乏力；由于大鼠面部图像采集以及分析存在一定困难，而大鼠足底图像方便采集且色泽变化较为明显所以用足底图像色彩饱和度来诊断是否面色紫暗。

舌象（舌淡紫）：

用舌面色彩饱和度变化来诊断是否舌色淡紫。

脉象（脉弱而涩）：

用反映大鼠脉搏搏动强度的指标来诊断是否脉弱而涩。

同时结合相关病理指标，能够对冠心病气虚血瘀证大鼠模型进行一个较为完整的疾病以及证候诊断。

　　利用西医病因病理造模方法单纯高位结扎左冠状动脉前降支建立的冠心病气虚血瘀证大鼠模型虽然在证候上表现出了心气虚证与血瘀证的相关特点，比如心功能下降，运动能力变差，掌心色彩饱和度下降等，但这种模型的建立方法均与特异的病理变化有所关联，只能够反映临床病理表现的一个方面，缺少临床病因学基础，与中医相关理论体系缺乏联系，很难完整体现出中医证候的特征，出现的病理状态并不能够与特定的中医证候对等。

相比较之下，本研究利用疲劳跑步运动结合高位结扎左冠状动脉前降支双因素复合刺激的方法建立的冠心病气虚血瘀证大鼠模型则更具有优势，模型在冠心病气虚血瘀中医证候的表现上更加显著。

　　在动物模型的评价体系中，虽然有些指标的变化并没有出现统计学差异，比如代表凝血功能的PT，APTT，TT，FIB等，但并不代表这些指标的变化不存在任何生理学意义，PT，APTT的缩短说明血液处于高凝状态，FIB的减低常见与弥散性血管内凝血消耗性低凝溶解期，TT的增高常见于弥散性血管内凝血纤溶亢进期。

临床诊断中不能轻易忽视这些指标的变化[19]，那么在动物模型的评价当中更加应该留意一些“不存在统计学差异”的指标变化所包含的生理学意义。

　　但是本研究利用疲劳运动结合高位结扎左冠状动脉前降支双因素复合刺激的方法建立的冠心病气虚血瘀证大鼠模型与人类临床上冠心病致心力衰竭气虚血瘀证实际的发展演变过程仍然存在一定的差距，研究者在日后研究过程当中，应当借助多学科交叉合作，建立更加稳定更加可靠规范化的病证结合动物模型，同时对模型的评价体系进行不断地完善。

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　　[责任编辑马超一]