尼克酸维生素PP又称烟酸的测定方法.docx

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尼克酸维生素PP又称烟酸的测定方法

尼克酸（维生素PP-又称烟酸）的测定方法

尼克酸（维生素PP，又称烟酸）的测定方法

（1）

   此处介绍微生物法、比色法以及复合维生素制剂中的烟酰胺测定方法（分光光度法）

一、微生物法

1.原理

   一种微生物生长必需某一些维生素，Lactobacillusarabinosus的生长需要尼克酸。

尼克酸是指具有尼克酸生物学活性的吡啶3-羧酸及其衍生物的总称。

它是白色晶体，是维生素中最稳定的一种，对酸、碱、热、光及弱氧化剂都很稳定，微溶于冷水，易溶于热水及乙醇。

其检出限为10ng。

2.适用范围

  本方法来源自AOAC和国标GB12395-90。

适用于食物及饲料中的尼克酸的检测。

3.仪器

（1）电热恒温培养箱（37±0.5℃）

（2）无菌室（紫外灯消毒）

（3）电热手提式压力蒸汽消毒器（121℃，高压30min）

（4）液体快速混合器

（5）离心机（3000转，10min）

（6）碱式滴定管

（7）硬质玻璃试管

4.试剂

所用试剂皆为分析纯；所用水皆为蒸馏水

4.1标准溶液的配制

（1）尼克酸标准储备液（0.1mg/ml）：

准确称取50.0mg已干燥恒重并储于五氧化二磷干燥器中的尼克酸标准，以25%乙醇溶液溶解并定容至500ml，于冰箱中保存。

（2）尼克酸标准中间液（1ug/m）：

吸取1.00ml尼克酸标准储备液，置于100ml容量瓶中，用25%乙醇溶液定容，混匀，于冰箱中保存。

（3）尼克酸标准工作液（0.1ug/m）：

临用时吸取5.00ml尼克酸标准中间液，置于50ml容量瓶中，用水定容，混匀。

4.2其它试剂的配制

（1）0.5mol/L硫酸：

于2000ml烧杯中加入700ml水，加入28mlH2SO4，用水稀释至1000ml。

（22）琼脂培养基：

无水葡萄糖1g 醋酸钠1g 蛋白胨0.8g 酵母提取物干粉0.2g 甲盐溶液0.2ml

                   乙盐溶液0.2ml 琼脂1.2g

   混合，加水至100ml，加热至琼脂完全溶化，以溴麝香草酚蓝为外指示剂，用盐酸趁热调PH至6.8，尽快倒入试管中，每管3～5ml，加塞棉塞，于压力蒸汽消毒器中121℃灭菌10min，取出后竖直试管，冷至室温后保存于冰箱中。

4.3菌种的制备与保存

（1）菌种的制备与保存：

以阿拉伯乳酸杆菌�Lactobacillusarabinosus17-5ATCCNo.8014简称Lact.A?

纯菌种接入2个或多个琼脂培养基管中，在37±0.5℃恒温箱中保温16-24小时，取出于冰箱中保存，至多不超过两周。

保存数周以上的菌种，不能立即用作制备接种液之用，一定要在使用前每天转种一次，连续2-3天，方可使用，否则生长不好。

（2）种子培养液的制备：

加5ml0.1ug/ml的尼克酸标准应用液于尖头试管中，加入5ml基本培养基，塞好棉塞，于压力蒸汽消毒器内（高压锅）121℃下消毒10min，取出，置于冰箱中，此管可保存数周之久。

5.操作步骤

5.1样品制备：

取含尼克酸约5-50ug的均匀样品于100ml三角瓶中，加0.5mol/LH2SO450ml。

放入高压蒸汽锅121℃下水解30min，取出，于水中冷却，用10mol/LNaOH和0.5mol/LH2SO4调PH值至4.5，用溴甲酚绿做指示剂。

将三角瓶内的溶液转移到100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至100ml，滤纸过滤，保存滤液于冰箱内备测（保存期不超过36小时）。

*用0.5mol/L硫酸水解，可以断开尼克酸和其它物质结合的键，使尼克酸游离出来。

*观察溴甲酚绿至草绿色为终点，说明溶液PH值到了4.5.调PH值至4.5可以除去样品中刺激和抑制细菌生长的物质，如：

淀粉、脂肪酸及磷脂。

许多蛋白质的等电点也在PH4.5，所以此PH值也可用来沉淀蛋白质。

5.2接种液的制备：

使用前一天，将阿拉伯乳酸杆菌菌种由储备菌种管移种于已消毒的种子培养液中，可同时制备两管，在37±0.5℃的恒温箱中培养16-24小时。

取出离心10分钟（3000rpm）倾去上部液体，用已消毒的生理盐水淋洗2次，再加10ml消毒过的生理盐水，将离心管置于液体快速混合器上混合，使菌种成为混悬体，将此液倒入已消毒的注射器内，立即使用。

5.3样品标准曲线的测定：

3组试管各加0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0ml工作液，每管加水稀释至5ml，再加5ml基本培养基，混匀，加棉塞。

（待续）

尼克酸（维生素PP，又称烟酸）的测定方法（4）

5.4试样的测定：

在试管中分别加入1，2，3，4ml样液，加水稀释至5ml，再加入5ml基本培养基，用棉塞塞住试管，将制备好的标准曲线和试样测定管放入高压锅（121℃）高压10min，冷至室温备用。

5.5接种和培养：

每管种一滴接种液，于37±0.5℃恒温箱中培养72小时

*注意：

接种后用振荡器振荡混匀试管中的液体。

5.6滴定：

从恒温箱中取出后，将试管中培养液倒入50ml三角瓶中，用5ml0.004%溴麝香草酚蓝分二次淋洗试管，洗液倒入该三角瓶中，以0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定，呈绿色即为终点，此时PH约6.8，绘制尼克酸标准工作曲线，用测定管得到的值，在标准曲线上查到测定管内所含尼克酸的量。

*水解液的PH值调至6.8是为了不同的试剂加入基本培养基时，不致改变基本培养基的PH值。

（此乳酸菌生长的适宜PH值为6.8）

6.计算

以尼克酸标准系列的不同微克数为横坐标，滴定所需0.1mol/L氢氧化钠毫升数为纵坐标，作为标准曲线。

X=（C×V/m）×F×（100/1000）

X--样品中尼克酸的含量，mg/100g；

C--每毫升样品中尼克酸含量的平均值，ug/ml；

V--样品水解液定容总体积，ml；

F--样品试液的稀释倍数；

m--试样质量，g；

100/1000--折算成每100g样品中尼克酸含量，mg。

7.举例

取一螺旋藻样品1.004g（m），处理后定容为100ml（V），从中取1ml稀释至25ml（F），取1，2，3，4ml入试管中，加入水和培养基，高压消毒，培养，滴定，测量根据曲线分别得出四管C值为0.037，0.073，0.110，0.136，所以四管平均值为C=（0.037+0.073/2+0.110/3+0.136/4）/4=0.036。

代入方程式为：

X=（C×V/m）×F×（100/1000）=（0.036×100/1.004）×25×（100/1000）=8.96（mg/100g）

因此得出每100克螺旋藻中含8.96毫克尼克酸。

8.注意事项

（1）当管中尼克酸的量少于0.05或多于0.3ug，即超过标准曲线范围时所得到的数值不能用于计算。

（2）3mol/L盐酸的配制方法：

取250ml浓盐酸，加入750ml蒸馏水，共配成1L3mol/L的盐酸

（3）试管应先用洗衣粉清洗后，用水冲净，再放入酸缸中浸泡1天左右，捞出后再用自来水和蒸馏水清洗干净，凉干，方可再用。

完

尼克酸（维生素PP，又称烟酸）的测定方法（5）

二、比色法

1.原理

烟酸和烟酰胺于Ph=4.5下用稀NH4OH提取，再与CNBr溶液与10％对氨基苯磺酸反应，测其比色值。

2.适用范围

选自AOAC；适用范围：

适用于药物、食物和饲料

3.仪器设备

（1）容量瓶，100ml

（2）锥形瓶，250ml

（3）电热板

（4）高压釜（121℃，30min）

（5）离心管，5ml

（6）漏斗

（7）通风橱

（8）酸式滴定管

比色计（药物430-450nm，谷物470nm）

4.试剂

所用试剂皆为分析纯；所用水皆为蒸馏水

4.1尼克酸标准溶液

（1）尼克酸标准储备液（100μg/ml）：

将50mgUSP烟道参比标准（贮于P2O5干燥器中，放于暗处保存。

）

（2）标准中间液Ι（10μg/ml）：

取少量贮备液放置至室温。

用蒸馏水将10.0ml贮备液稀释至100ml。

（3）标准工作液Π（4μg/ml）：

将恢复至室温的贮备液2.0ml用蒸馏水稀释至50ml。

4.2其它试剂

（1）稀氢氧化铵溶液：

5mlNH4OH用H2O稀释至250ml

（2）稀盐酸：

V+V=1+5

（3）磷酸缓冲液（pH＝8）：

将60gNa2HPO4·7H2O和10gKH2PO4溶于蒸馏水中并稀释至200ml。

（4）溴化氢溶液（10%，通风橱中制备）：

将370mlH2O温热至40℃，并加入40gCNBr。

振荡至溶解冷却并稀释至400ml。

溶液在冰箱保存。

*CNBr剧毒，切勿与皮肤接触，必须在通风橱中操作。

（5）10%对氨基苯磺酸溶液：

按每次1ml将NH4OH加到20g对氨基苯磺酸和170ml蒸馏水的混合液中，直至酸溶解为止。

用盐酸与蒸馏水溶液（1：

1）调节pH至4.5，采用溴甲酚绿指示剂指示。

稀释至200ml。

*注：

因为溶液有颜色会影响最后结果，所以稀释结束后溶液应几乎无色

（6）55%对氯基苯磺酸溶液：

在55g对氨基苯磺酸中加入27ml蒸馏水和27mlNH4OH，振摇至溶解。

（必要时加温）。

用NH4OH或5NHCl调pH为7，再用蒸馏水稀释至100ml。

（保存在暗处）

（待续）

尼克酸（维生素PP，又称烟酸）的测定方法（6）

5.操作步骤

5.1样品制备

（1）药物：

将药品研碎，溶于蒸馏水中，稀释定容。

取10mL样品于锥形瓶中，加入10mLHCl，在电热板上加热蒸发至约2mL，冷却，加入25-50mL蒸馏水，用40%NaOH或KOH溶液调节pH值至2.5-4.5。

过滤，弃去10mL处液，转移至容量瓶中定容，使溶液含尼克酸约4μg/mL。

*注：

溶液的尼克酸含量应在50-200μg/mL

（2）非谷类食品及饲料：

称取约28g样品，加入0.5mol/LH2SO4200mL，混匀，在高压釜中121℃加热半个小时。

冷却，用10mol/LNaOH调节pH值至4.5，以溴甲酚绿作外指示剂，用蒸馏水稀释至250mL，过滤。

取17g（NH4）2SO4于50mL容量瓶中，吸取40mL样品液，用H2O稀释定容，强力振摇。

过滤，混匀，取1mL作比色测定用。

如果样品中尼克酸含量为16mg/1b。

最终液浓度3.2μg/mL。

移取40mL标准工作液Π至盛有17g（NH4）2SO4的50mL容量瓶中，用蒸馏水稀释定容，此液含尼克酸3.2μg/mL。

*注：

加入H2SO4主要是为了去除样品中的蛋白及其它杂质，以防其对测量结果造成影响

（3）谷类产品：

随同样品做1试剂空白和5个浓度的工作标准液。

分别将1.5gCa（OH）2放入7个锥形瓶中，移入0、5、10、15、20、25mL标准中间液Ι和2.5g样品（含100μg烟酸），加入蒸馏水至90mL，振摇混匀。

高压121℃下2小时。

趁热混匀，冷却至40℃，转移至100mL容量瓶中，稀释定容。

从容量瓶移50mL上清液至离心管中，冰浴15min或置于冰箱中≥2小时。

离心15min，吸取20mL上清液至盛有8g（NH4）2SO4和2mL磷酸盐缓冲液的离心管中。

振荡溶解并温热至55-60℃。

离心5min，过滤。

5.2操作程序

（1）药物制剂和非谷类食物和饲料：

假如10%的对氨基苯磺酸溶液，CNBr溶液，在通风橱中用酸式滴定管滴入，用标准工作液Π，如下表制备各管：

试剂标准空白样品空白

标准溶液（mL）1.01.0

H2O（mL）5.05.0

稀NH4OH（mL