尼克酸维生素PP又称烟酸的测定方法.docx

1、尼克酸维生素PP又称烟酸的测定方法尼克酸(维生素PP-又称烟酸)的测定方法尼克酸（维生素PP，又称烟酸）的测定方法（1） 此处介绍微生物法、比色法以及复合维生素制剂中的烟酰胺测定方法（分光光度法） 一、微生物法 1.原理 一种微生物生长必需某一些维生素，Lactobacillus arabinosus的生长需要尼克酸。尼克酸是指具有尼克酸生物学活性的吡啶3-羧酸及其衍生物的总称。它是白色晶体，是维生素中最稳定的一种，对酸、碱、热、光及弱氧化剂都很稳定，微溶于冷水，易溶于热水及乙醇。其检出限为10ng。 2.适用范围 本方法来源自AOAC和国标GB12395-90。适用于食物及饲料中的尼克酸的检

2、测。 3.仪器 （1） 电热恒温培养箱(370.5) （2） 无菌室（紫外灯消毒） （3） 电热手提式压力蒸汽消毒器（121，高压30min） （4） 液体快速混合器 （5） 离心机（3000转，10min） （6） 碱式滴定管 （7） 硬质玻璃试管 4.试剂 所用试剂皆为分析纯；所用水皆为蒸馏水 4.1 标准溶液的配制 （1） 尼克酸标准储备液（0.1mg/ml）：准确称取50.0mg已干燥恒重并储于五氧化二磷干燥器中的尼克酸标准，以25%乙醇溶液溶解并定容至500ml，于冰箱中保存。 （2） 尼克酸标准中间液（1ug/m）：吸取1.00ml尼克酸标准储备液，置于100ml容量瓶中，用25%

3、乙醇溶液定容，混匀，于冰箱中保存。 （3） 尼克酸标准工作液（0.1ug/m）：临用时吸取5.00ml尼克酸标准中间液，置于50ml容量瓶中，用水定容，混匀。 4.2 其它试剂的配制 （1） 0.5mol/L硫酸：于2000ml烧杯中加入700ml水，加入28ml H2SO4，用水稀释至1000ml。 （22） 琼脂培养基： 无水葡萄糖 1g 醋酸钠 1g 蛋白胨 0.8g 酵母提取物干粉 0.2g 甲盐溶液 0.2ml 乙盐溶液 0.2ml 琼脂 1.2g 混合，加水至100ml，加热至琼脂完全溶化，以溴麝香草酚蓝为外指示剂，用盐酸趁热调PH至6.8，尽快倒入试管中，每管35ml，加塞棉塞，

4、于压力蒸汽消毒器中121灭菌10min，取出后竖直试管，冷至室温后保存于冰箱中。 4.3菌种的制备与保存 （1） 菌种的制备与保存：以阿拉伯乳酸杆菌Lactobacillus arabinosus 17-5 ATCC No.8014 简称 Lact.A?纯菌种接入2个或多个琼脂培养基管中，在370.5恒温箱中保温16-24小时，取出于冰箱中保存，至多不超过两周。保存数周以上的菌种，不能立即用作制备接种液之用，一定要在使用前每天转种一次，连续2-3天，方可使用，否则生长不好。 （2） 种子培养液的制备：加5ml 0.1ug/ml 的尼克酸标准应用液于尖头试管中，加入5ml基本培养基，塞好棉塞，于

5、压力蒸汽消毒器内（高压锅）121下消毒10min，取出，置于冰箱中，此管可保存数周之久。 5.操作步骤 5.1样品制备：取含尼克酸约5-50ug的均匀样品于100ml三角瓶中，加0.5mol/LH2SO450ml。放入高压蒸汽锅121下水解30min，取出，于水中冷却，用10mol/LNaOH和0.5mol/LH2SO4调PH值至4.5，用溴甲酚绿做指示剂。将三角瓶内的溶液转移到100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至100ml，滤纸过滤，保存滤液于冰箱内备测（保存期不超过36小时）。 *用0.5mol/L硫酸水解，可以断开尼克酸和其它物质结合的键，使尼克酸游离出来。 *观察溴甲酚绿至草绿色为终点，

6、说明溶液PH值到了4.5. 调PH值至4.5可以除去样品中刺激和抑制细菌生长的物质，如：淀粉、脂肪酸及磷脂。许多蛋白质的等电点也在PH4.5，所以此PH值也可用来沉淀蛋白质。 5.2接种液的制备：使用前一天，将阿拉伯乳酸杆菌菌种由储备菌种管移种于已消毒的种子培养液中，可同时制备两管，在370.5的恒温箱中培养16-24小时。取出离心10分钟（3000rpm）倾去上部液体，用已消毒的生理盐水淋洗2次，再加10ml消毒过的生理盐水，将离心管置于液体快速混合器上混合，使菌种成为混悬体，将此液倒入已消毒的注射器内，立即使用。 5.3样品标准曲线的测定：3组试管各加0，0.5，1.0，1.5，2.0，2

7、.5和3.0ml工作液，每管加水稀释至5ml，再加5ml基本培养基，混匀，加棉塞。 （待续）尼克酸（维生素PP，又称烟酸）的测定方法（4）5.4试样的测定：在试管中分别加入1，2，3，4ml样液，加水稀释至5ml，再加入5ml基本培养基，用棉塞塞住试管，将制备好的标准曲线和试样测定管放入高压锅（121）高压10min，冷至室温备用。 5.5接种和培养：每管种一滴接种液，于370.5恒温箱中培养72小时 *注意：接种后用振荡器振荡混匀试管中的液体。 5.6滴定：从恒温箱中取出后，将试管中培养液倒入50ml三角瓶中，用5ml0.004%溴麝香草酚蓝分二次淋洗试管，洗液倒入该三角瓶中，以0.1mol

8、/L氢氧化钠溶液滴定，呈绿色即为终点，此时PH约6.8，绘制尼克酸标准工作曲线，用测定管得到的值，在标准曲线上查到测定管内所含尼克酸的量。 * 水解液的PH值调至6.8是为了不同的试剂加入基本培养基时，不致改变基本培养基的PH值。（此乳酸菌生长的适宜PH值为6.8） 6.计算 以尼克酸标准系列的不同微克数为横坐标，滴定所需0.1mol/L氢氧化钠 毫升数为纵坐标，作为标准曲线。 X=（CV/m）F（100/1000） X-样品中尼克酸的含量，mg/100g； C-每毫升样品中尼克酸含量的平均值，ug/ml； V-样品水解液定容总体积，ml； F-样品试液的稀释倍数； m-试样质量，g； 100

9、/1000-折算成每100g样品中尼克酸含量，mg。 7.举例 取一螺旋藻样品1.004g（m），处理后定容为100ml（V），从中取1ml稀释至25ml（F），取1，2，3，4ml入试管中，加入水和培养基，高压消毒，培养，滴定，测量根据曲线分别得出四管C值为0.037，0.073，0.110，0.136，所以四管平均值为C=（0.037+0.073/2+0.110/3+0.136/4）/4=0.036。代入方程式为： X=（CV/m）F（100/1000）=（0.036100/1.004）25（100/1000）=8.96（mg/100g） 因此得出每100克螺旋藻中含8.96毫克尼克酸。

10、8.注意事项 （1） 当管中尼克酸的量少于0.05或多于0.3ug，即超过标准曲线范围时所得到的数值不能用于计算。 （2） 3mol/L盐酸的配制方法：取250ml浓盐酸，加入750ml蒸馏水，共配成1L 3mol/L的盐酸 （3） 试管应先用洗衣粉清洗后，用水冲净，再放入酸缸中浸泡1天左右，捞出后再用自来水和蒸馏水清洗干净，凉干，方可再用。 完尼克酸（维生素PP，又称烟酸）的测定方法（5）二、比色法 1.原理 烟酸和烟酰胺于Ph=4.5下用稀NH4OH提取，再与CNBr溶液与10对氨基苯磺酸反应，测其比色值。 2.适用范围 选自AOAC；适用范围：适用于药物、食物和饲料 3.仪器设备 （1）

11、 容量瓶，100ml （2） 锥形瓶，250ml （3） 电热板 （4） 高压釜（121，30min） （5） 离心管，5ml （6） 漏斗 （7） 通风橱 （8） 酸式滴定管 比色计（药物430-450nm，谷物470nm） 4.试剂 所用试剂皆为分析纯；所用水皆为蒸馏水 4.1尼克酸标准溶液 （1） 尼克酸标准储备液（100g/ml）：将50mgUSP烟道参比标准（贮于P2O5干燥器中，放于暗处保存。） （2） 标准中间液（10g/ml）：取少量贮备液放置至室温。用蒸馏水将10.0ml贮备液稀释至100ml。 （3） 标准工作液（4g/ml）：将恢复至室温的贮备液2.0ml用蒸馏水稀释至5

12、0ml。 4.2其它试剂 （1） 稀氢氧化铵溶液：5mlNH4OH用H2O稀释至250ml （2） 稀盐酸：V+V=1+5 （3） 磷酸缓冲液（pH8）：将60gNa2HPO47H2O和10gKH2PO4溶于蒸馏水中并稀释至200ml。 （4） 溴化氢溶液（10%，通风橱中制备）：将370ml H2O温热至40，并加入40gCNBr。振荡至溶解冷却并稀释至400ml。溶液在冰箱保存。 *CNBr剧毒，切勿与皮肤接触，必须在通风橱中操作。 （5） 10%对氨基苯磺酸溶液：按每次1ml将NH4OH加到20g对氨基苯磺酸和170ml蒸馏水的混合液中，直至酸溶解为止。用盐酸与蒸馏水溶液（1：1）调节p

13、H至4.5，采用溴甲酚绿指示剂指示。稀释至200ml。 *注：因为溶液有颜色会影响最后结果，所以稀释结束后溶液应几乎无色 （6） 55%对氯基苯磺酸溶液：在55g对氨基苯磺酸中加入27ml蒸馏水和27mlNH4OH，振摇至溶解。（必要时加温）。用NH4OH或5NHCl调pH为7，再用蒸馏水稀释至100ml。（保存在暗处） （待续） 尼克酸（维生素PP，又称烟酸）的测定方法（6）5.操作步骤 5.1样品制备 （1） 药物：将药品研碎，溶于蒸馏水中，稀释定容。取10mL样品于锥形瓶中，加入10mLHCl，在电热板上加热蒸发至约2mL，冷却，加入25-50mL蒸馏水，用40%NaOH或KOH溶液调节

14、pH值至2.5-4.5。过滤，弃去10mL处液，转移至容量瓶中定容，使溶液含尼克酸约4g/mL。 *注：溶液的尼克酸含量应在50-200g/mL （2） 非谷类食品及饲料：称取约28g样品，加入0.5mol/L H2SO4200mL，混匀，在高压釜中121加热半个小时。冷却，用10mol/LNaOH调节pH值至4.5，以溴甲酚绿作外指示剂，用蒸馏水稀释至250mL，过滤。取17g（NH4）2SO4于50mL容量瓶中，吸取40mL样品液，用H2O稀释定容，强力振摇。过滤，混匀，取1mL作比色测定用。如果样品中尼克酸含量为16mg/1b。最终液浓度3.2g/mL。 移取40mL标准工作液至盛有17

15、g （NH4）2SO4的50mL容量瓶中，用蒸馏水稀释定容，此液含尼克酸3.2g/mL。 *注：加入H2SO4主要是为了去除样品中的蛋白及其它杂质，以防其对测量结果造成影响 （3）谷类产品：随同样品做1试剂空白和5个浓度的工作标准液。 分别将1.5gCa（OH）2放入7个锥形瓶中，移入0、5、10、15、20、25mL标准中间液和2.5g样品（含100g烟酸），加入蒸馏水至90mL，振摇混匀。高压121下2小时。趁热混匀，冷却至40，转移至100mL容量瓶中，稀释定容。 从容量瓶移50mL上清液至离心管中，冰浴15min或置于冰箱中2小时。离心15min，吸取20mL上清液至盛有8g（NH4）2SO4和2mL磷酸盐缓冲液的离心管中。振荡溶解并温热至55-60。离心5min，过滤。 5.2操作程序 （1）药物制剂和非谷类食物和饲料：假如10%的对氨基苯磺酸溶液，CNBr溶液，在通风橱中用酸式滴定管滴入，用标准工作液，如下表制备各管： 试剂 标准空白 样品空白 标准溶液（mL） 1.0 1.0 H2O（mL） 5.0 5.0 稀NH4OH（mL