一株产红色素真菌的初步鉴定及色素提取与稳定性研究本科论文.docx

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一株产红色素真菌的初步鉴定及色素提取与稳定性研究本科论文

学科分类号180

本科毕业论文

题目一株产红色素真菌的初步鉴定及色素提取与稳定

性研究

姓名学号

院（系）化学与生命科学学院

专业生物资源科学年级2011级

指导教师职称副教授

二

二○一五年五月

二

贵州师范学院本科毕业论文诚信声明

本人郑重声明：

所呈交的本科毕业论文，是本人在指导老师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，成果不存在知识产权争议，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。

对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明。

本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。

本科毕业论文作者签名：

年月日

目录

摘要1

Abstract2

引言3

1菌株的鉴定5

1.1材料、试剂与仪器5

1.2方法6

1.3结果与分析6

1.4小结与讨论７

2色素提取工艺的研究７

2.1材料、试剂与仪器７

2.2方法８

2.3结果与分析10

2.4小结与讨论13

3色素稳定性的研究13

3.1材料、试剂与仪器13

3.2方法14

3.3结果与分析15

3.4小结与讨论20

结语20

参考文献21

致谢24

附录25

摘要

真菌色素是一种极具应用潜力的食用色素。

本文针对一株产红色素的真菌A11625M，对菌株进行了鉴定、色素提取工艺和色素稳定性方面的研究。

实验结果表明：

该菌株通过形态学鉴定为酒红拟青霉（Paecilomycesvinaceus）。

菌株所产红色素，其最大吸收波长为510nm；色素提取时，以鲜菌丝直接浸提，最佳提取剂为丙酮，提取时间为240min，提取温度为30℃；提取时对菌丝进行超声波破碎预处理有助于色素的提取。

该色素在中性和弱酸弱碱条件下的稳定性较好；温度对色素稳定性的影响较小；糖类对色素稳定性的影响不明显；金属离子Mg2+、Cu2+、Na+、K+、Fe3+、Zn2+、Fe2+、Ca2+对色素稳定性的影响较小；过氧化氢对色素稳定性的影响较大，亚硫酸钠对色素稳定性的影响较小，抗坏血酸能提高色素的稳定性。

关键词：

真菌；红色素；鉴定；提取；稳定性

Abstract

Fungalpigmentswerepotentialresourcefornaturalfoodcolorant.Inthisarticle,anunknownfungusstainA11625M,whichcanproduceredpigment,wasstudiedonitsidentification,pigmentextractionandthepigmentstability.TheresultsshowedthatthestrainwasidentifiedasPaecilomycesvinaceusbymorphologicalcharacter.Themaximumabsorptionwavelenghofthepigment,whichproducedbythestrain,was510nm.Freshmyceliumwasmoresuitableforpigmentextractionthandrymycelium,thebestextractionsolventwasacetone,andtheoptimalextractiontimewas240minutes,theoptimalextractiontemperaturewas30℃.Inaddition,crushingthemyceliumcouldbehelpfulforpigmentextraction.Thepigmentwasstableinneutral,weaklyacidicandalkalescentcondition.Temperaturehadlittleeffectonthestabilityofthepigment.Carbohydratehadnoinfluenceonthepigment.Metallicions,suchasMg2+,Cu2+,Na+,K+,Fe3+,Zn2+,Fe2+,Ca2+hadlittleinfluenceonthepigment;H2O2influencedthepigmentsignificantly;TheNa2SO3hadlittleinfluenceonthepigment;Theascorbicacidcouldimprovethestabilityofthepigment.

Keywords:

Redpigment;fungus;identification;extraction;stability

引言

（1）天然色素概况

色素也叫着色剂，是改变物品反射或者透射光颜色的物质。

根据不同的用途可分为染料、颜料、食用色素[1]。

食用色素是一类用于食品着色、改变食品色泽的食品添加剂，分为天然色素和合成色素两大类[2]。

合成色素是指人工化学合成得到的有机色素，具有色彩鲜艳、着色力强、性质稳定、价格便宜、可大规模生产等特点。

但是合成色素大多数属于煤焦色素或苯胺色素，会引起人体中毒、致泻以及致癌作用。

因此，现在世界各国己严格的限制使用多种合成色素，美国由1960年允许使用的35种，仅剩下7种；我国也从以前的24种减少到8种，并指定由专门的生产厂家生产[3,4]。

天然色素一般是从动植物组织中提取和微生物发酵获得[5]。

与合成色素相比安全性相对较高，着色色调比较自然，毒副作用小，而且一些天然色素本身就具有一定的营养价值和药理作用[6]。

但是，天然色素的着色强度较弱，对光、热、pH值及氧化的敏感性较高，在大多数情况下，其成本比合成色素的成本高，且有些天然色素有异味、异臭，并且生产受到植物种类、地理、区域及季节的影响，供应量不稳定[6]。

随着现代食品工业的发展，人们越来越关注食品添加剂的安全问题。

由于相当一部分合成色素对人类的健康产生一定的毒副作用，天然色素的开发与应用已成为必然趋势。

真菌色素作为天然色素的一类，安全性可靠，色泽自然，并兼有营养作用和保健作用而备受人们的青睐[7]。

（2）真菌色素的发展现状

真菌能够分泌化学稳定性高、化学结构及色调多样的色素。

生产天然色素的真菌主要包括大型真菌和丝状真菌，能合成和分泌各种醌类、酸类、酮类以及一些含氮化合物色素[5-10]。

真菌色素是微生物色素中研究和应用最多的一类色素，特别是一些丝状真菌，它是天然色素的一大来源[25]。

丝状真菌中已获得高产色素的类群有红曲霉、青霉、虫草和拟青霉中的一些种。

其中，以红曲霉的研究最为广泛，在我国和日本等东南亚地区有着悠久的应用历史，但其同时伴随产生毒素桔霉素。

另外一些不产毒素的青霉，如产紫青霉（Penicillium．PurpurogenumFleroff）及附球菌（Epicoccumspp．）等研究报道较多[11-14]。

对于拟青霉产色素方面的研究只有少数几个种。

YounJeungCho等[15,16]研究了营养条件和通气量对蝉拟青霉（Paecilomycessinclairii）菌丝体和红色素产生的影响；AliAsaff等[17]研究了金属离子对玫烟色棒束孢（Isariafumosorosea）产色素的影响；PalanivelVelmurugan等[18]研究了光对粉质棒束孢（I．farinosa）产色素的影响。

（3）真菌红色素的概况

自然界中微生物资源非常丰富，很多微生物在生长过程中能够生成不同颜色和结构的色素，其中以黑色素、红曲色素、类胡萝卜素和天然蓝色素等研究最为广泛[19,20]。

红色素是天然色素中的一类，天然红色素一般被分为胡萝卜素、花色苷、黄酮、醌、叶琳、多酚等几类，但有关真菌红色素的研究甚少[21,22]。

刘小娟等[22]通过对菌株的筛选，得到一株高产红色素真菌，进行菌种鉴定，确认菌株属于串珠镰刀菌（Fusariummomiliforme）；王丽娟等[23]从油菜根系土壤中分离得到一株产红色素真菌，通过鉴定，确认菌株属于绳状青霉（Penicilliumfuniculosum）；谭友莉等[24]研究了三角叶黄连内生真菌产物红色色素的稳定性；陈立立等[25]从银杏枝条分离出的内生真菌，能产生大量的红色素，经鉴定该菌属于产紫青霉（Penicilliumpurpurogenum）；PalanivelVelmurugan等[26]研究了从五种丝状真菌中提取天然色素作为皮革染料，其中产红色素的真菌就有紫红曲霉（Monascuspurpureus）。

（4）选题目的和研究内容

我国天然红色素主要来源于植物，但受到生长周期、地理位置、提取工艺等条件的限制，导致天然红色素的产量及质量不稳定。

而微生物的生长周期短，生长环境易于控制，提取工艺简单且产品质量能得到保证。

因此，采用微生物发酵生产天然色素将逐渐成为天然色素来源的主流。

本课题以一株产红色素的未知真菌作为研究菌，通过对菌株的鉴定、提取工艺、稳定性等三个方面的探索，旨在为红色素的进一步开发与利用提供参考。

（1）通过对该菌株进行形态学鉴定和分子系统学方法分析，确定其归属。

（2）提取工艺的研究，通过实验获得适用于该色素提取的工艺条件。

（3）色素稳定性的研究，为其开发应用提供基础参考。

1菌株的鉴定

1.1材料、试剂与仪器

1.1.1供试菌株

真菌菌株A11625M，贵州大学真菌资源研究所提供。

1.1.2主要仪器

分析天平、显微镜、生化培养箱、高压蒸汽灭菌锅、水浴锅、电泳仪、制冰机、生物安全柜、高速离心机、振荡器、微量移液枪、电泳槽、基因扩增仪。

1.1.3试剂

引物、Taq酶、dNTPs等购自上海生物工程公司；棉蓝、蔗糖、琼脂。

1.2方法

在查氏培养基、PDA固体培养基上25℃培养14d，观察记载菌落特征并用显微镜观察、通过肉眼观察菌落和显微镜观察，微观产孢结构进行形态鉴定。

挑取培养基上新鲜菌丝，用DNA提取试剂盒提取其总DNA。

采用通用引物ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和ITS5（5′-GGTGAGAGATTTCTGTGC-3′）进行PCR扩增，扩增产物送上海鼎安生物科技有限公司进行测序，得到的序列于NCBI中进行BLAST比对分析，并下载相近序列，用MEGA5.0软件通过MaximumParsimony（MP）法构建系统发育树。

1.3结果与分析

1.3.1菌株形态学鉴定

查氏培养基上，25˚C，14d，菌落直径达40mm左右，绒毛状，白色，表面可见红色素分泌到培养基周围，边缘整齐，圆形；背面酒红色至红褐色。

菌丝透明，光滑，1-3μm；分生孢子梗无或简单，瓶梗单生或2-3个轮生，细柱状至棒状，6-12×1-2μm；分生孢子单生，透明至半透明，短椭圆形，2-4×1-2.5μm，呈长链（图1.1）。

菌株形态结构和菌落特征与文献报道的酒红拟青霉（P.Vinaceus）[27]描述基本一致，故该菌株从形态上鉴定为酒红拟青霉（P.Vinaceus）。

图1.1菌株菌落与产孢结构

注：

图中a、b为菌落的正面和背面，c为产孢结构。

Fig.1.1Coloniesandconidiogenousstructureofthestrain

Note:

aandbwerethesurfaceandreverseofcolonies,cwasconidiogenousstructure.

1.3.2菌株分子学鉴定

对该株菌株进行DNA提取、PCR扩增和测序，从GenBank中进行BLAST下载相似度大于90%的部分种的ITS序列以及一些拟青霉属的ITS序列，用MEGA5.0软件进行多序列对比排序，并用MP法构建系统发育树（图1.2）。

从树图看出菌株A11625M以73%的支持率与青霉属的一些种聚成一支，但其又与拟青霉属中的一些种有一定的亲缘关系。

图1.2菌株和相似属的一些种基于rDNAIITS-5.8S-ITS2序列采用MP法构建的系统发育树

Fig.1.2PhylogenetictreebasedonanalysisofrDNAITS-5.8S-ITS2sequencesofbacterialstrainandsomerelatedspeciesbyMP

1.4小结与讨论

按现代分类学的观点，拟青霉（PaecilomycesBainier）是一类有丝分裂孢子真菌（mitosporicfungi）和无性型真菌（anamorphicfungi）的形式属[28]，由Bainier于1907年以宛氏拟青霉（PaecilomycesvariotiiBainier）为模式种而建立。

此属相当数量的种都属于边缘种，与曲霉（Aspergillus），青霉（PenicilliumFr.），帚霉（ScopulariopsisBainier）以及粘霉属（GliocladiumCorda）等属相近[28]。

所以拟青霉属中的一些种的分类地位还需进一步的明确。

该菌株在形态上，尤其是产孢结构特征为典型的拟青霉形态特征，故形态学鉴定为酒红拟青霉（P.Vinaceus），但通过ITS序列的分子系统学鉴定结果与青霉属一些种的亲缘关系更近。

因此该菌株的归属尚需进一步利用多基因组序列来明确。

2色素提取工艺的研究

2.1材料、试剂与仪器

2.1.1供试菌株

真菌菌株A11625M，贵州大学真菌资源研究所提供。

2.1.2主要仪器

岛津UV-2450紫外分光光度计、分析天平、水浴锅、生化培养箱、摇床、生物超净台。

2.1.3试剂

蔗糖、丙酮、甲醇、无水乙醇、95%乙醇均为国产分析纯。

2.2方法

将活化的菌种接种于PDA液体培养基中，摇瓶培养10d，再静置培养20d，将液面菌丝取出，吸去表面水分，收集待用。

2.2.1吸收光谱扫描

称取0.20g菌丝，加入50mL丙酮中浸提4h。

取色素提取液于200nm-900nm波长范围内进行波长扫描，绘制吸收光谱图。

2.2.2色素浓度与吸光度关系

称取0.20g菌丝，加入100mL丙酮中浸提4h，以1mL色素提取液为取样梯度，从1—10mL共取10个梯度样品，各样品以丙酮补至总体积10mL，于510nm波长处测定其吸光度。

2.2.3色素提取剂与提取时间选择

称取菌丝5组各0.20g，分别加入100mL丙酮、无水乙醇、甲醇、95%乙醇、蒸馏水中浸提，每隔30min取样一次，于510nm波长处测定其吸光度。

2.2.4色素提取温度选择

称取菌丝5组各0.2g，分别加入100mL丙酮，在4℃、20℃、30℃、40℃、50℃温度下浸提，在60、120、180和240min时分别取样，冷却至室温后，于510nm波长处测定其吸光度。

2.2.5菌丝不同处理方法对色素提取的影响

称取菌丝3组各0.20g，A组菌丝加入100mL丙酮中直接浸提，B组菌丝用研钵研磨后加入100mL丙酮中浸提，C组菌丝用超声波细胞破碎仪处理1min后加入100mL丙酮中浸提，在60、120、180和240min时分别取样，于510nm波长处测定其吸光度。

2.2.6菌丝干燥对色素提取的影响

称取菌丝2组各0.2g，A组菌丝加入100mL丙酮中直接浸提，B组菌丝于干燥箱中完全干燥后加入100mL丙酮中浸提，在30、60、90、120和150min时分别取样，于510nm波长处测定其吸光度。

2.3结果与分析

2.3.1色素吸收光谱

图2.1色素吸收光谱

Fig.2.1Absorptionspectrumofpigment

通过波长扫描，色素在可见光区的最大吸收峰的波长为510nm。

波长扫描图如图2.1。

2.3.2色素浓度与吸光度关系

图2.2色素相对浓度与吸光度关系

Fig.2.2Relationshipbetweenrelativeconcentrationofpigmentanditsabsorbance

以色素提取液的相对浓度百分比为横坐标，以510nm波长处的吸光度为纵坐标，对色素相对浓度与吸光度作图，如图2.2，其回归方程为y=0.0566x－0.0113，R2=0.9971。

其中，y为510nm下的吸光度，x为色素相对浓度。

回归方程表明：

色素相对浓度与吸光度在此实验条件下的测定范围内呈良好的线性关系。

2.3.3色素提取剂与提取时间选择

图2.3不同提取剂与提取时间对色素提取效果

Fig.2.3Effectofdifferentextractionandextractiontimeonpigmentextraction

丙酮、甲醇、无水乙醇、95%乙醇、蒸馏水五种提取剂对色素提取效果如图2.3。

实验结果表明：

最佳提取剂为丙酮，在提取时间为240min时已达到最大的提取效果。

2.3.4色素提取温度选择

温度对色素提取效果的影响，如图2.4。

实验结果表明：

最佳色素提取温度为30℃。

图2.4温度对色素提取的影响

Fig.2.4Effectoftemperaturetonpigmentextraction

2.3.5菌丝不同处理方法对色素提取的影响

图2.5菌丝不同处理方法对色素提取的影响

Fig.2.5Effectofdifferentmyceliumprocessingmethodonpigmentextraction

菌丝直接浸提、研磨后提取和超声波细胞破碎后提取对色素提取影响，如图2.5。

实验结果表明：

对菌丝进行破碎处理有助于色素的提取，缩短提取时间，其中以超声波细胞破碎为好。

2.3.6菌丝干燥对色素提取的影响

菌丝干燥对色素提取的影响，如图2.6。

菌丝完全干燥后提取的色素量下降极其明显，因此在红色素提取时应以鲜菌丝提取为宜。

图2.6鲜菌丝与干菌丝的色素提取效果

Fig.2.6Effectoffreshmyceliumanddrymyceliumonpigmentextraction

2.4小结与讨论

通过对菌株所产色素的提取。

结果表明：

色素的最大吸收波长为510nm；色素提取时，最佳提取剂为丙酮，提取时间为240min，提取温度为30℃，提取时用鲜菌丝和对菌丝进行超声波破碎预处理有助于色素的提取。

这些结果为该株真菌色素的进一步深入研究和开发应用提供基础的参考。

3色素稳定性的研究

3.1材料、试剂与仪器

3.1.1材料

真菌菌株A11625M，贵州大学真菌资源研究所提供。

3.1.2主要仪器

岛津UV-2450紫外分光光度计，PHS-3C型精密酸度计，分析天平、水浴锅。

3.1.3试剂

NaOH、HCl、FeSO4、NaCl、CaCl2、KCl、FeCl3、ZnCl2、MgCl2、CuSO4、H2O2、Na2SO3、抗坏血酸。

3.2方法

取0.2g浓缩物溶于50mL蒸馏水中，常温提取1h，然后单层抽滤得到色素溶液，再用50mL蒸馏水冲洗残渣，常温浸提1h，再抽滤得到提取液。

合并两次的提取液，得到质量浓度为0.002g/mL的色素溶液，待用。

3.3.1pH值对色素稳定性的影响

在PHS-3C型精密酸度计检测条件下，用0.1mol/LNaOH和0.1mol/LHCl调节色素溶液的pH值，分别配制pH值为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的色素溶液，室温放置1h后在510nm处测定吸光度，记录数值并绘图。

3.3.2金属离子对色素稳定性的影响

将溶液分装于9组具塞试管中，每组10mL，然后向其中8组中分别加入等量的浓度为0.1mol/LFe2+、Na+、Ca2+、K+、Fe3+、Zn2+、Mg2+、Cu2+，另一组加蒸馏水作对照，分别在0、24、48、72h后测定各组溶液的吸光度并绘图。

3.3.3氧化剂对色素稳定性的影响

取等量的色素溶液5份，分别加入等量的0%、5%、10%、15%、20%的H2O2溶液，放置0、1、2、3、24、48、72h后，测定其吸光度并绘图。

3.3.4还原剂对色素稳定性的影响

1）Na2SO3取等量的色素溶液5份，分别加入等量的0%、5%、10%、15%、20%的Na2SO3溶液，放置0、1、2、3、24、48、72h后，测定其吸光度并绘图。

2）抗坏血酸取等量的色素溶液5份，分别加入等量的0%、5%、10%、15%、20%的抗坏血酸溶液，放置0、24、48、72h后，测定吸光度并绘图。

3.3.5糖类对色素稳定性的影响

取等量的色素溶液3份，分别加入等量的蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉，放置0、1、2、3、24、48、72h后，测定其吸光度并绘图。

3.3.6温度对色素稳定性的影响

取红色素溶液分别在4℃、25℃、50℃、70℃、90℃温度中放置1、2、3、4、5、6、7h。

冷却至室温后定容至相同体积，在510nm处测定其吸光度并绘图。

3.3结果与分析

3.3.1pH对色素稳定性的影响

测定色素在不同pH值水溶液条件下的OD值，结果见图3.1。

图3.1pH值对色素稳定性的影响

Fig.3.1EffectofpHonthestabilityofthepigment

实验结果表明：

相对于空白对照组，色素水溶液在pH1-pH12条件下其OD值的变化百分比分别为-52.8%、-44.4%、+8.4%、-1.6%、+0.2%、-0.6%、+2.7%、+1.3%、+5.6%、+11.7%、+18.2%、+13.6%（+表示色素OD值上升，-表示OD值下降，下同）。

表明色素在强酸或强碱条件下，尤其是强酸条件下吸光度值的变化大，在中性或弱酸弱碱性条件下较稳定。

另外，不同pH条件下色素水溶液的颜色有变化（图3.2），在pH1-pH12范围内，该色素水溶液的颜色与空白组（红色）相比较，其颜色变化由橙色向深红色转变。

由不同pH下该色素溶液所呈现的颜色来看，推测该色素可能为花青素类。

图3.2不同pH条件下色素溶液

Fig3.2ThepigmentsolutionunderdifferentpHvalue

3.3.2金属离子对色素稳定性的影响

测定色素在不同金属离子水溶液中的OD值，结果见图3.3。

图3.3金属离子对色素稳定性的影响

Fig.3.3Effectofmetalionsonthe