PCR实验室SOP.docx
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PCR实验室SOP
【】ABI7500型核酸扩增荧光检测仪使用、维护、校准程序-LAB-SOP-FZSW-011
分子生物操作手册
版本号:
B
修订号:
0
文件标题:
ABI7500型核酸扩增荧光检测仪使用、维护、校准程序
发布日期:
文件编号:
LAB-SOP-FZSW-011
生效日期:
编写人:
审核人:
发布部门:
中心主任:
批准人:
其他:
页码:
第1页,共4页
1.目的:
确保ABI7500仪器的正确使用及正常运行
2.适用范围:
美国应用生物系统公司生产的ABI7500实时荧光定量PCR仪
3.运行环境:
电源:
推荐配备合适的UPS或稳压器。
通风:
仪器的通风应该没有阻挡。
温度:
推荐实验室配备空调,温度应该控制在10~30℃之间。
湿度:
20-80%;对于潮湿的省份,推荐实验室配备除湿机。
空间:
易于操作,安全。
4.操作程序:
4.1开关机程序:
开机顺序:
先开电脑,待电脑完全启动后再开启定量PCR仪主机,等主机面板上的绿灯亮后即可打开ABI7500系统软件,进行实验。
关机顺序:
确认实验已经结束后,首先关闭ABI7500系统软件,然后关掉定量PCR仪主机的电源,最后关闭电脑。
4.2创建绝对定量反应板文件:
4.2.1依次选择Start>Programs>AppliedBiosystems7500>AppliedBiosystems7500SDSSoftware(
),以启动SDS软件;或在桌面双击AppliedBiosystems7500SDSSoftware(
)图标。
4.2.2选择File(文件)>New(新建)。
4.2.3在NewDocumentWizard(新建文件向导)窗口中,从Assay(实验)下拉列表中选择AbsoluteQuantification(StandardCurve)(绝对定量,标准曲线)。
接受Container(反应板类型)与Template(模板)字段中的默认设置(即分别为96-WellClear(空白96孔板)与BlankDocument(空白反应板))。
4.2.4在DefaultPlateName(默认反应板名)字段中输入反应板文件名,或接受默认文件名。
4.2.5单击Next>(下一步>)。
4.2.6选择要添加到反应板文件的探针。
A)单击以选择一个探针。
(按住Ctrl键单击可选择多个探针。
)如果在DetectorManager(探针管理器)列表中未列出探针,请创建探针。
B)单击Add>>(添加>>)。
探针即被添加到反应板文件。
C)单击Next>(下一步>)。
4.2.7为每个反应孔指定探针与任务。
A)单击一个反应孔(或对于重复选择一组反应孔)以选取它(们)。
B)单击探针名,为反应孔选定探针。
C)单击Task(任务)栏的下边,以指定探针任务。
D)为包含标准样本的反应孔输入量值。
E)单击Use(使用)。
所选反应孔中显示探针任务与颜色。
F)单击Finish(完成)。
SDS软件即创建反应板文件。
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4.2.8输入样本名。
A)单击或选择View(视图)>WellInspector(反应孔设定)。
B)单击一个反应孔或拖动鼠标选取多个重复反应孔。
C)输入样本名。
D)如果必要,更改PassiveReference(阳性参比荧光)设置。
(默认情况下,选择ROX™荧光。
)
E)重复步骤b至d,直到您为反应板上的所有反应孔均指定好样本名与阳性参比荧光。
4.2.9在Setup(设定)选项卡上,检查并核对每个反应孔的信息。
4.3设置热循环条件并开始运行反应板
4.3.1选择Instrument(仪器)选项卡。
默认情况下,显示两步法反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法中PCR步骤的标准PCR条件。
4.3.2验证以下各项:
A)如果您使用两步法RT-PCR–则已设置默认的PCR热循环条件。
B)如果您使用“中山大学达安基因股份”的试剂–请按以下循环条件设置:
93℃2分钟→1个循环;93℃45秒→55℃60秒→40个循环。
C)SampleVolume(样本体积)为50µL。
D)9600Emulation选项选取。
4.3.3选择File(文件)>SaveAs(另存为),为绝对定量反应板文件输入一个文件名,然后单击Save(保存)。
4.3.4将反应板装入仪器中。
4.3.5单击Start(开始)。
在仪器运行PCR程序期间,Instrument(仪器)选项卡上会显示实时状态信息,并报告荧光信号强度。
程序运行结束后,状态值与按钮变为灰色,而且Analysis(分析)按钮(
)变为可用状态,并显示信息提示您程序是否成功运行。
程序运行期间生成的所有数据都保存到步骤4.3.3中指定的绝对定量反应板文件中。
4.4设置分析参数
4.4.1选择AmplificationPlot(扩增图谱)选项卡,然后从Data(数据)下拉列表中选择DeltaRnvsCycle(∆Rn随循环变化)。
4.4.2选择要在图谱上显示的反应孔。
(如果不作选择,图谱将显示为空白。
)
4.4.3从Detector(探针)下拉列表中,选择一个探针。
SDS软件显示所选探针与反应孔的图谱。
4.4.4为探针设置基线。
1)在AnalysisSettings(分析设置)下边,选择ManualBaseline(手动设置基线)。
2)在Start(cycle)(开始循环)与End(cycle)(结束循环)字段中输入相应的值,确保扩增曲线的增长从EndCycle(结束循环)值之后的循环处开始。
4.4.5为探针设置阈值。
1)在AnalysisSettings(分析设置)下边,选择ManualCt(手动Ct)。
2)用鼠标拖动阈值设置条,直到阈值位于:
•背景的上边
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•扩增曲线的平台期与线性增长期的下边
•扩增曲线的指数增长期之内
SDS软件调整阈值,并于分析之后在Threshold(阈值)字段中显示此值。
4.4.6重复步骤4.4.3至4.4.4,为实验分析中的所有剩余探针设置适当的基线与阈值。
4.4.7单击Analysis(分析)>Analyze(执行分析),以使用调整后的基线与阈值设置重新分析数据。
4.5分析并查看绝对定量数据
4.5.1Plate(反应板)选项卡:
显示每个反应孔的结果数据,包括:
•每个反应孔的样本名、探针任务与颜色。
•计算值-量值(默认值)、∆Rn或Ct。
选择Analysis(分析)>Display(显示)以选择要显示的值。
4.5.2Spectra(光谱)选项卡:
显示所选反应孔的荧光光谱。
•用鼠标指针点击并拖动Cycle(循环)滑块上的指示器,可查看每一循环的光谱。
•Cycle#(循环次数)文本框中显示滑块指示器的当前位置。
4.5.3Component(成分)选项卡:
显示整个PCR运行期间所选反应孔的每种荧光的完整光谱表现。
每次只能显示第一个选取的反应孔。
4.5.4AmplificationPlot(扩增图谱)选项卡:
在三个AmplificationPlot(扩增图谱)上,您可查看特定样本的扩增后荧光信号读取情况。
•AmplificationPlot(扩增图谱)上显示所选反应孔中的所有样本。
•Rnvs.Cycle(Linear)(Rn随循环变化,线性)视图:
显示校正后报告荧光强度(Rn)荧光随循环变化的曲线。
您可通过此图来识别与检查不规则扩增。
•∆Rnvs.Cycle(Log)(∆Rn随循环变化,对数)视图:
显示荧光(∆Rn)随循环数变化的曲线。
您可通过此图来识别与检查不规则扩增
•Ctvs.WellPosition(Ct值与反应孔位置关系)视图:
显示阈值循环(CT)与反应孔位置的关系变化图。
您可通过此图查找探针数据设置中不当设置的极端值。
4.5.5StandardCurve(标准曲线):
显示指定为标准的样本标准曲线。
SDS软件根据此标准曲线推断并计算出未知样本的量。
4.5.6Report(报告):
以表格方式显示所选反应孔的数据。
报告中的数据栏取决于正运行的实验分析类型。
对于绝对定量实验分析,可能包括以下数据栏:
Well(反应孔)、SampleName(样本名)、Detector(探针)、Task(任务)、Ct、StdDevCt(Ct值标准偏差)、Qty(数量)、MeanQty(平均数量)与StdDevQty(标准偏差数量)。
Qty(数量)栏中的值根据样本的标准曲线推断并计算得出。
在ReportSettings(报告设置)对话框中可设置报告显示格式与打印方式。
5.仪器维护保养
5.1每星期维护任务
•归档或备份SDS反应板文件
•使用不脱毛的布块擦拭仪器表面
5.2每月维护任务:
•执行背景校正
•执行计算机硬盘碎片整理程序
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5.3半年维护任务:
•执行纯荧光校正
•执行目标区(ROI)校正
5.4其它维护任务:
需要时执行以下维护任务,以解决遇到的问题:
•去除样本块中的污染物
•更换卤素灯
•更换仪器保险丝
6.常见的故障与处理
6.1没有标准曲线:
•在设置样本信息时,在类型中没有设置为
•在设置样本信息中的
内没有填入数值
6.2没有扩增曲线:
•PCR设置参数错误,只收集了一个循环的信号
•硬盘休眠,没有收集循环的信号
6.3基线下滑:
修改基线范围为10-20,重新分析。
6.4扩增曲线断裂:
减小基线终点,至CT值前4个循环,重新分析数据。
6.5直线扩增曲线:
探针部分降解
7.校准:
ABI7500基因扩增检测仪校准工作需由专业工程师进行,每年校正一次,另外以实验判断仪器校准状态也可为何时进行仪器校准提供信息。
通过对室内质控图的分析,及时发现系统误差的出现。
经过分析排除了试剂与人员误差后,应进行仪器状态校验实验:
7.1使用标准化试剂作为校验试剂,分别计算标准曲线的斜率、截距、相关性的控制限。
7.3每年由专业人员进行上述实验,仪器若搬动或配套仪器(如UPS等)的变动亦需进行上述实验,观察标准曲线的三个参数是否处在控制范围与103标准品是否检出。
7.4当104标准品未检出、标准曲线的三个参数超出控制范围或仅出现后者时,先排除实验的人员、试剂因素,再重复实验。
如结果依然,联系厂家进行仪器校准。
7.5当仅有104标准品未检出时,检查实验全过程。
再次上机检测104标准品两枚。
如仍未检出,则联系厂家进行仪器校准。
7.6仪器经过校准后,重复该实验,结果归入仪器档案。