第十章单克隆抗体技术doc.docx

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第十章单克隆抗体技术doc

第十章单克隆抗体技术

（Monoclonalantibodytechnique）

一、原理

B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。

B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。

将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。

这种技术即称为单克隆抗体技术。

制备单克隆抗体的方法是用缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转化酶或胸腺嘧啶核苷酸酶的瘤细胞变异株与脾脏的B细胞融合。

采用HAT选择性培养基（培养基中加次黄嘌呤HyPoxanthineH，氨基喋呤AminoopterinA及胸腺嘧啶核苷ThymidineT），在这种选择性培养基中，由于变异的瘤细胞不具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶或胸腺嘧啶核苷激酶，所以不能利用培养基中的次黄嘌呤或胸腺嘧啶核苷而合成DNA。

而只能利用谷酰胺与尿核苷酸单磷酸合成DNA，这一途径又被氨基喋呤所阻断，所以未融合的瘤细胞不可避免也要死亡。

融合的杂交瘤细胞由于脾淋巴细胞具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶，可以通过次黄嘌呤合成DNA，克服氨基喋呤的阻断，因此杂交瘤细胞大量繁殖而被筛选出来。

B淋巴细胞在一般培养基中不能长期生长，一般于二周内均死亡。

单克隆抗体与常规抗体相比有如下优点：

①单一特异性，与一个抗原决定簇反应；②可重复性，能够提供完全一样的抗体制剂；③一经制出，可无限量地供应；④生产单克隆抗体，不一定需要纯的抗原；⑤能查出混合物中存在的用常规方法查不出的少量成分。

单克隆抗体与常规的血清抗体的性质比较，见表10-1。

表10-1单克隆抗体与常规抗血清的性质比较

性质

常规血清抗体

单克隆抗体

抗体含量

少μg/ml

多mg/ml

无关的Ig

多

少或几乎无

其它血清蛋白

有

少，培养物上清常有10％胎牛血清

Ag-Ab结合

免疫原的全部成分的全部抗原决定簇

免疫原中的一种成分的一个抗原决定簇

特异性亲和力的重复性

不同批号间有变化

无变化

与其它抗原的交叉反应

与带有共同抗原决定簇的抗原有部分交叉

一般无。

结合到共同决定簇则是完全的

免疫球蛋白的种类与亚类

完全是混合的

只是一种或几种

免疫球蛋白的物理性质

典型光谱

抗体的单一性质

二、动物的选择与免疫

（一）动物的选择

目前应用最广的是小白鼠和大白鼠，尤以小白鼠为好。

就品系而言以Balb/c小白鼠应用最广，因为所有的小白鼠骨髓瘤系均从Balb/c小白鼠系诱导出来。

Balb/c系小白鼠必须用纯系的，雌雄均可，以8~12周龄为宜。

大白鼠也可，能产生较多量的单克隆抗体。

现在已经在小鼠杂交瘤的基础上，发展了小鼠－大鼠，小鼠－人以及人－人杂交瘤技术。

（二）免疫

一般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。

免疫程序、剂量和方法是关系到是否能得到所需要的单克隆抗体的关键之一。

正常小鼠脾脏含有能产生各种不同抗体的B淋巴细胞，一只纯种小白鼠估计能产生1.0×107~5.0×107种不同的抗体。

因此一只正常的小白鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤融合，只能有千万分之一的机会获得某一种特定抗体。

所以为了提高得到某种杂交瘤的机会，必须加强免疫，使产生特异性抗体的B淋巴细胞大量增加。

B淋巴细胞的不同发育阶段对获得阳性杂交瘤也有很大影响。

有人认为处在转化时期的B淋巴细胞可能更易于融合，而免疫以后7~8天，虽然是抗体产生的高峰时期，但形成有活力的杂交瘤细胞的可能反而减少。

故一般认为加强免疫后的第三天应杀鼠取脾做细胞融合。

1．可溶性抗原（蛋白质）以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为0.3ml～0.6ml，间隔３～５周再同样注射一次，１０天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。

一个月后可以经静脉（尾静脉）给予无佐剂抗原0.2ml～0.4ml，３～４天后，杀死小鼠取脾做融合用。

　２.颗粒性抗原如抗原来源方便，可以不加佐剂而增加免疫次数，缩短间隔时间。

例如用羊红血球免疫小白鼠，以１％浓度每只皮下注射０.２ml，每周２次，共免疫５～８次，取脾前３天，再免疫一次即可。

有人认为最后一次免疫剂量要大，大到近于免疫耐受的程度更好。

三、细胞的选择

（一）脾细胞

1．材料

（1）免疫过的血清抗体滴度高的Balb/c鼠。

（2）1640培养液

（3）2.5％FCS－1640营养液

2．操作方法

（1）拉颈或用CO2处死小白鼠。

（2）将小鼠放于70％酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在无菌条件下取脾。

（3）把脾放入5ml含有2.5％FCS的1640液中，冰浴下轻轻洗去脾上的红血球。

（4）用镊子轻轻挤压脾，做成脾细胞悬液，用毛细管将悬液移入小试管中。

（5）直立小试管3min，使大块的结缔组织下沉，把细胞悬液移入离心管中。

（6）以2.5％FCS—1640充满离心管，并以400g离心7min～10min（与此同时应开始制备骨髓细胞）。

（7）把沉淀用约10ml的新鲜培养液再悬浮。

（8）重复⑹、⑺步骤。

（9）计算细胞，以台盼兰染色用相差显微镜检查，活细胞数应高于80％为合格。

（二）骨髓瘤细胞

骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白，这样的瘤细胞融合后，可能影响或降低所分泌抗体的滴度，所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞。

选择骨髓瘤细胞的条件：

①该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系，以便两者的组织相容性抗原一致；②骨髓瘤细胞必须是静息状态，不产生γ球蛋白或不分泌到细胞外；③骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度,最好106个细胞/ml；④生长速度快，繁殖时间短。

目前常用的Balb/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有：

①S194/5XXO·BU·1；②SP2／0—Ag14（简称SP2）；③P2—X？

—Ag8·6·5·3（简称653）；④FO

以653最为常用，它是由矿物油4－甲基－15烷（Pristane，降植烷）诱发出来的一种浆细胞瘤（MinerolOilplasmacytoma，MOPC）并经过培育形成一株8-氮鸟嘌呤有抵抗力的亚系。

骨髓瘤细胞一般由有关单位直接引入，保存于-195℃液氮罐中，试验时复苏、增殖、传代即可。

由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态，很容易脱落，因此不需要胰酶处理。

为了防止出现返祖现象，在融合前，可将培养基内加入15μg/ml8－氮鸟嘌呤。

取约1×107～6×107对数生长期（即培养15h～20h）的骨髓瘤细胞，在室温离心（400g）10min，沉淀以2.5％FCS—1640液再悬浮并计数。

（三）饲养细胞

在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞（Feedercell）。

在细胞融合和单克隆的选择过程中，就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体，因此在这一过程中必须使用饲养细胞。

许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞，如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等，常选用腹腔渗出细胞，其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞。

应用腹腔渗出细胞的好处是：

一方面做饲养细胞，另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片，为融合细胞的生长造成良好的环境。

腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠。

也可以是其他种类的小鼠，如C57鼠，昆明小白鼠等。

1．材料

（1）小鼠（Balb/c或C57小白鼠）若干只。

（2）11.6％蔗糖溶液（经10磅30min高压灭菌）。

2．操作方法

（1）拉颈处死小鼠。

（2）70％酒精浸泡消毒10min。

（3）用手术剪将小鼠腹部剪开一小口，剥开皮肤，露出腹腔。

（4）用注射器将4ml11.6％蔗糖溶液注入腹腔，用手指轻揉1min仍用该注射器回抽腹腔液体，加入离心管。

（5）1000r／min离心10min。

（6）取上清，以HAT选择培养液将细胞制成悬液。

台盼蓝染色计数活细胞，使每毫升含40万个活细胞。

（7）以1ml吸管将细胞种入微量培养皿，每孔0.05ml，含2万个细胞，放入CO2培养箱培养，即可供细胞融合和克隆化之用。

如果在融合后发现在培养孔中饲养细胞数量少，则可以在细胞换液时再加入一些。

四、细胞融合

（一）融合剂

细胞融合的方法有物理法，如电融合、激光融合，化学融合法和生物融合法，如仙台病毒，此处例举化学融合法中的一种即聚乙二醇融合法。

聚乙二醇（PEG），在分子量为200～700时，呈无色、无臭的粘稠状液体，分子量大于1000时，呈乳白色蜡状固体，能溶于水、乙醇及其他许多有机溶剂，对热稳定，与许多化学药品不起作用。

用作细胞融合剂的聚乙二醇一般选用分子量为4000者，常用浓度为50％，pH8.0～pH8.2（用10％NaHCO3调整），分子量小的PEG，融合效应差，又有毒性，分子量过大，则粘性太大，不易操作。

50％浓度，pH偏碱时融合效应最高。

也有采用30%～50％浓度的PEG加上10％二甲亚砜。

不同批号的PEG，即使分子量相同，但融合率却有明显差异，选用时必须注意。

每批都必须进行细胞毒性试验后方可应用。

要买高纯度的，一般选供气相色谱用的PEG。

（二）融合过程

融合的方法很多，常用的有转动法和离心法。

融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为1:

1至10:

1不等。

3:

1或5:

1最为常用。

1．试剂与材料

（1）供融合用的脾细胞及骨髓瘤细胞。

（2）1640培养液100ml。

（3）完全1640液100ml。

（4）2.5％FCS－1640液50ml。

（5）HAT培养液100ml。

（6）50％PEG：

取分子量4000，高纯度的（日本进口或Serva）PEG10g放入25ml瓶中高压灭菌，使用前用预热于40℃的1640液10ml等量（W/V）混合，以酚红检查pH，一般不必调pH。

如pH有改变，可用HCl或NaHCO3调整。

（7）10ml和50ml的灭菌沉淀管或瓶。

（8）40孔塑料培养盘。

2．操作方法

⑴准备好脾细胞。

⑵在50ml沉淀管中混合108脾细胞和107小鼠骨髓瘤细胞，并加入50ml2.5％FCS－1640液。

⑶室温400g离心3min，使细胞沉淀。

⑷移去上清液。

⑸轻敲管底部，使沉淀流动，把沉淀管放于40℃水浴中，使其达融合温度。

⑹加预热至40℃的50％PEG0.8ml，用1ml吸管缓慢滴加，边加边摇沉淀管，肉眼观察可见有颗粒出现，滴加过程要求持续2min。

⑺加1ml1640液，边加边摇动，持续1min。

⑻重复⑺一次。

⑼加1ml1640液，边加边摇动，持续0.5min。

⑽重复⑼一次。

⑾加1640液15ml。

⑿室温，400g离心1min，使细胞沉淀。

⒀去上清，轻敲管底部，加25ml含有HAT的完全1640液。

⒁往已于前一日种有饲养细胞的40孔塑料培养盘中滴加融合的细胞液，每孔1滴（约0.05ml）。

⒂轻摇后，放入5％CO2饱和湿度的37℃温箱中培育。

⒃第3、6、9、10日换入含HAT的完全1640培养液。

注意轻轻吸取上清液，勿将固定于孔底的细胞吸出，根据需要加入适量的饲养细胞。

⒄于第12、15日加入含有HAT的完全1640培养液。

在每次换液前用倒置显微镜观察，大约在10天左右就可观察到杂交瘤细胞生长出来。

大多数杂交瘤细胞在10~20天内出现，但也有在1个月左右才能出现的。

杂交瘤细胞出现后，吸取上清液，检查抗体。

⒅对继续生长的杂交瘤细胞进行增殖传代。

在传代过程中，依情况取消HAT液和完全1640液而代之以10%FCS－1640液。

同时保存于液氮和进行克隆化，在这期间每代都要检查抗体，以防止产生抗体细胞的变异和丢失。

（三）细胞融合的关键

1．技术上的误差常常导致融合的失败。

例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。

这必然要失败的。

２．融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。

五、抗体检测及杂交瘤细胞的选择

（一）抗体检测

用检测抗体的方法从杂交细胞中筛选出生产指定抗体的杂交株是很重要的。

检测抗体的方法很多，从沉淀反应到放射免疫测定。

由于细胞培养液中的抗体浓度通常是很低的，而且传统的检测方法多是以多价抗原与多克隆抗血清相反应。

杂交瘤产生的抗体则是单克隆的，所以并不是每项方法都能适用。

一定要选择敏感的、快速的、一次又能检测多份样品的方法。

常用的检测方法如下：

１．试管溶血反应检测法

（1）材料：

①杂交瘤细胞，换液后至少两天才收取培养液；②绵羊红血球，洗涤三次后，配成1％悬液；③豚鼠补体，无菌采取补体，以pH7.2PBS稀释成20％溶液，分装小瓶，于﹣40℃保存。

使用时以补体和压积红血球5:

1（V/V）的量进行吸收，4℃30min，然后2000r/min离心10min，去红血球，取上清液备用；④0.01Mol/LpH7.2PBS液。

（2）操作方法：

①在小试管中，加入0.1ml杂交瘤细胞用过的培养液，再加入0.1mlpH7.2的PBS液，然后倍比稀释至一定的稀释度；②加入0.1ml补体和1％绵羊红血球0.1ml，混匀后置37℃水浴1h；③观察结果，以绵羊红血球完全溶解的杂交瘤细胞培养液的最高稀释倍数为抗体的溶血效价。

2．斑点检测法抗红血球表面的单克隆抗体与浇灌在琼脂板的红血球结合，进而结合补体，而发生溶血斑点，对着光源用肉眼即可判定。

（1）材料：

①绵羊红血球，处理同试管法，最后配成25％红血球悬液；②新鲜豚鼠血清（同试管法处理）；③琼脂糖，配成0.6％PBS液，水浴中溶化；④0.01Mol/LpH7.2PBS液；⑤兔抗羊红血球抗体。

（2）操作方法：

①将溶化的0.6％琼脂糖倒入一试管中，置45℃～48℃水浴中；②加0.1ml25％红血球悬液，0.1ml豚鼠补体，迅速混匀，倾注一干净载玻片上；③凝固后，在凝胶表面固定区域滴加2ml待测样品，标准阳性血清和对照试液；④待溶液全部渗入凝胶后，置湿盘；⑤37℃温育1h～2h，观察并判定结果。

强阳性（+++）中等阳性（++）

弱阳性（+）阴性（﹣）

必要时可置室温过夜，再判定一次。

3．膜荧光检测法

（1）材料：

①培养液HEM或RPMI－1640；②荧光试剂：

异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗小鼠免疫球蛋白；③50％甘油缓冲液：

1份甘油加1份体积0.05Mol/LpH7.2PBS液混合即成；④荧光显微镜、载玻片、盖玻片、吸管等。

（2）操作方法：

①用培养液洗涤二次细胞，悬浮成2.0×107／ml；②50µl细胞悬液加50μl培养上清液混合，置4℃30min，用培养液洗涤3次，1000r/min离心；③以50µlFITC—抗小鼠免疫球蛋白重新悬浮压积细胞，水浴30min～60min；④用冷培养液洗3次细胞，重新悬浮；⑤取一滴细胞悬液滴在玻片上，复盖片，用甘油缓冲液封固，置荧光显微镜下观察。

着色细胞也可以在固定后观察，一滴细胞悬液，涂片、风干，用95％酒精固定10min，固定后的载玻片用PBS洗涤，盖上盖玻片，进行观察。

4．免疫球蛋白和亚类球蛋白的检测以琼脂双扩散试验法进行，此法简单易操作，特异性好。

注意必须将培养液浓缩10～50倍，否则做双向琼扩不出现沉淀线。

其检测方法为：

（1）制备各种兔抗小鼠IgG1~4、IgM1~2、IgA1~2和K、λ抗血清,也可直接购买。

（2）取5ml培养物的上清液缓慢加入0.5ml的饱和硫酸铵溶液，混匀，静置3h，离心沉淀，去上清，沉淀加0.05ml蒸馏水溶解。

（3）制成1％琼脂糖凝胶板，打孔。

中间孔加20μl浓缩上清液，周围孔加20µl特异性抗血清，以10μl正常小鼠血清作对照。

也可以采用酶联免疫吸附试验、间接血凝试验以及放射免疫等方法检测。

（二）杂交瘤细胞的选择

经HAT选择培养基培养10～14天，未经融合的骨髓瘤细胞相继死去，而杂交瘤细胞即可逐渐长成细胞集落。

停用HAT液后，改用HT培养基。

当细胞集落面积超过培养孔的1／10以上时，即可用敏感的免疫学方法检测出阳性孔。

连续三次检测逐渐升高或维持在同一水平者，则可以做克隆化，一部分则冷藏起来做长期保种用。

六、克隆化

经过抗体测定的阳性孔，可以扩大培养，进行克隆，以得到单个细胞的后代分泌单克隆抗体。

克隆的时间一般说来越早越好。

因为在这个时期各种杂交瘤细胞同时旺盛生长，互相争夺营养和空间，而产生指定抗体的细胞有被淹没和淘汰的可能。

但克隆时间也不宜太早，太早细胞性状不稳定，数量少也易丢失。

克隆化的阳性杂交瘤细胞，经过一段时期培养之后，也还会因为细胞突变或特定染色体的丢失，使部分细胞丧失产生抗体的能力，所以需要再次或多次克隆化培养。

克隆化次数的多少由分泌能力强弱和抗原的免疫性强弱而决定。

一般说，免疫性强的抗原克隆次数可少一些，但至少要3～5次克隆才能稳定。

克隆化的方法很多，包括有限稀释法、显微操作法、软琼脂平板法及荧光激活分离法等。

（一）有限稀释法

1．材料

（1）微量培养盘，盘内各孔于克隆化前一天培养小鼠腹腔细胞（即饲养细胞）每孔2万～4万。

（2）HT培养基

2．操作方法

（1）取出抗体阳性孔细胞，用HT培养液制成细胞悬液。

并取样进行台盼兰染色，计数。

（2）用HT培养液将细胞稀释成200个/ml、40个/ml、20个/ml和的悬液。

（3）用吸管将细胞悬液分别种入微量培养盘，每孔0.05ml，细胞含量分别为10个/孔、2个/孔、1个/孔和0.5个/孔。

（4）5％CO2饱和湿度，37℃培养。

（5）每天用倒置显微镜观察克隆生长情况，选择只有一个集落生长的孔，弃掉两个以上和没有细胞生长的孔。

（6）克隆大量繁殖后，布满孔底的1/3～1/2时，测培养液抗体。

（7）抗体阳性孔细胞，移到有饲养层的组织培养瓶中，并传2～4代就可以脱离饲养细胞，建成克隆株。

（二）软琼脂克隆化

借助撒在软琼脂上单个细胞定位生长，而达到克隆化，具体操作如下：

1．配2.5％的琼脂糖30ml，水浴溶化后，移入45℃水浴中。

2．将117ml完全DMEM液和3ml10倍浓度的DMEM液混合，置45℃水浴预热。

3．将琼脂糖与DMEM液混合，即为含0.5％琼脂糖的完全DMEM液，并加75×108脾细胞。

4．每块平皿加10ml，于室温中凝固。

5．DMEM中的细胞与DMEM—琼脂1:

1混合，将细胞琼脂混合物2ml铺于凝固的平板上，使其全部覆盖。

6．放入CO2箱饱和湿度，37℃培养10天。

7．用PBS配制0.6％琼脂糖，于沸水浴溶解后，置45℃，在保温情况下取一试管，迅速加入0.1ml25％羊红血球，0.2ml豚鼠补体，2.7ml0.6％琼脂糖。

8．用3ml琼脂糖—羊红血球混合液覆盖克隆。

于37℃CO2箱孵育1h~2h。

从克隆上部溶解羊红血球的溶血范围，可筛选抗羊红血球Ig。

（三）显微镜操作法

在直径6cm培养皿中，加入1ml1.0×108细胞悬液放置5％CO2饱和湿度，37℃温箱中放置30min以上，倒置显微镜下，寻找那些与周围相距甚远的单个细胞，将毛细管口（一头有直角弯头毛细管，一头连接一尺长乳胶管，用口控制液体进入）水平置放于液面上，左右微动，直到看见管口，对准细胞，吸入毛细管，将管中细胞移到预先加有2.0×104~5.0×104饲养细胞96孔板内，培养后，即可获得单个细胞形成的克隆。

（四）荧光激活分离法

用一种荧光激活细胞分类器（FluoresceinActivafedCellSorter，FACS）。

其基本原理是：

将细胞经荧光抗体染色后，经喷嘴形成单个细胞的线形液滴，在莱塞光激发下，荧光素发射荧光，此信号由光电倍增管接收，再结合细胞形态大小产生光散射信号，经电脑处理，产生信号并与预定的信号对比，根据细胞荧光强度及细胞大小不同，将细胞分成不同级别，在电场中发生偏离，而分别收集于不同容器中。

七、单克隆抗体的制备

（一）杂交瘤细胞的大量繁殖

克隆化的细胞可以在体外进行大量培养，收集上清液而获得大量的单一的克隆化抗体。

不过体外培养法得到的单克隆抗体有限，其不能超过特定的细胞浓度，且每天要换培养液。

而体内杂交瘤细胞繁殖可以克服这些限制。

杂交瘤细胞具有从亲代淋巴细胞得来的肿瘤细胞的遗传特性。

如接种到组织相容性的同系小鼠或不能排斥杂交瘤的小鼠（无胸腺的裸鼠），杂交瘤细胞就开始无限地繁殖，直至宿主死亡。

产生肿瘤细胞的小鼠腹水和血清中含有大量的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，这种抗体的效价往往高于培养细胞上清液的100~1000倍。

利用免疫抑制剂，如降植烷、液体石蜡、抗淋巴细胞血清等，可以加速和促进肿瘤的生长。

1．材料

（1）经高压灭菌的降植烷。

（2）Balb/c鼠：

5~8周龄。

（3）杂交瘤细胞：

取对数生长期的细胞。

（4）RPMI—1640培养液

（5）新生牛血清

2．操作方法

（1）于小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，注射后１～９周内种植细胞。

（2）收取对数生长期的杂交瘤细胞，用５％FCS—1640液洗涤一次，1000r/min离心10min。

（3）取样，用台盼兰染色，计活细胞数，重新用５％FCS—1640液配成1.0×107细胞/ml的悬液。

（4）给注射了降植烷的小白鼠接种杂交瘤细胞，每只腹腔注射1ml（含1.0×107个细胞/ml）。

（5）接种后10天左右时间肿瘤体积最大，此时可由腹腔抽取腹水，每隔1~3天取1次，可取10次。

血清可由腋下动脉或心脏采血后分离。

（二）单克隆抗体的提纯

1．材料

（1）20mMol/LpH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液

20mMol/LNaCl

（2）20mMol/LpH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液

40mMol/LNaCl

（3）20mMol/LpH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液

80mMol/LNaCl

（4）20mMol/LpH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液

（5）饱和硫酸铵液

（6）DEAE—纤维素柱

2．操作方法

（1）小鼠腹水用冷PBS液稀释4倍后，于1.00×105转离心30min，去沉淀。

（2）在4℃于上清中缓缓滴加饱和硫酸铵液，边加边搅拌，使溶液最终为50％硫酸铵浓度。

（3）此溶液置冰中30min~60min，然后5000r/min离心10min，去上清。

（4）将沉淀溶于Tris－HCl缓冲液（40mMol/LNaCl）中（溶液可能混浊）。

（5）装入透析袋于Tris－HCl缓冲液（20mMol/LNaCl）中透析除盐。

（6）离心去沉淀。

（7）溶液稀释（1:

100或更高倍稀释）后，于280nm测蛋白含量，估计蛋白质含量

1A280unit=0.8mg蛋白质

一般每ml腹水中，含有总蛋白约25mg~36mg。

（8）过DEAE—纤维素柱：

纤维素柱高40cm，以20mMol/LNaClTris缓冲液平衡。

透析样品以Tris缓冲液等量稀释。

样品进入柱床速度为1ml~2ml/min，以NaCl线形梯度洗脱。

大部分单克隆IgG于40mMol/L和80mMol/LNaCl洗脱，也有极少例外的单克隆抗体于120mMol/L~150mMol/LNaCl洗脱。

测O