学位论文果蝇精巢fasⅲ基因原核表达载体的构建.docx

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学位论文果蝇精巢fasⅲ基因原核表达载体的构建

果蝇精巢fasⅢ基因原核表达载体的构建

毕业设计（论文）原创性声明和使用授权说明

原创性声明

本人郑重承诺：

所呈交的毕业设计（论文），是我个人在指导教师的指导下进行的研究工作及取得的成果。

尽我所知，除文中特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或组织已经发表或公布过的研究成果，也不包含我为获得及其它教育机构的学位或学历而使用过的材料。

对本研究提供过帮助和做出过贡献的个人或集体，均已在文中作了明确的说明并表示了谢意。

作者签名：

　　　　　日　期：

指导教师签名：

　　　　　日　　期：

使用授权说明

本人完全了解大学关于收集、保存、使用毕业设计（论文）的规定，即：

按照学校要求提交毕业设计（论文）的印刷本和电子版本；学校有权保存毕业设计（论文）的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢利为目的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。

作者签名：

　　　　　日　期：

学位论文原创性声明

本人郑重声明：

所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。

除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。

对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。

本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。

作者签名：

日期：

年月日

学位论文版权使用授权书

本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。

本人授权　　　　大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。

涉密论文按学校规定处理。

作者签名：

日期：

年月日

导师签名：

日期：

年月日

注意事项

1.设计（论文）的内容包括：

1）封面（按教务处制定的标准封面格式制作）

2）原创性声明

3）中文摘要（300字左右）、关键词

4）外文摘要、关键词

5）目次页（附件不统一编入）

6）论文主体部分：

引言（或绪论）、正文、结论

7）参考文献

8）致谢

9）附录（对论文支持必要时）

2.论文字数要求：

理工类设计（论文）正文字数不少于1万字（不包括图纸、程序清单等），文科类论文正文字数不少于1.2万字。

3.附件包括：

任务书、开题报告、外文译文、译文原文（复印件）。

4.文字、图表要求：

1）文字通顺，语言流畅，书写字迹工整，打印字体及大小符合要求，无错别字，不准请他人代写

2）工程设计类题目的图纸，要求部分用尺规绘制，部分用计算机绘制，所有图纸应符合国家技术标准规范。

图表整洁，布局合理，文字注释必须使用工程字书写，不准用徒手画

3）毕业论文须用A4单面打印，论文50页以上的双面打印

4）图表应绘制于无格子的页面上

5）软件工程类课题应有程序清单，并提供电子文档

5.装订顺序

1）设计（论文）

2）附件：

按照任务书、开题报告、外文译文、译文原文（复印件）次序装订

指导教师评阅书

指导教师评价：

一、撰写（设计）过程

1、学生在论文（设计）过程中的治学态度、工作精神

□优□良□中□及格□不及格

2、学生掌握专业知识、技能的扎实程度

□优□良□中□及格□不及格

3、学生综合运用所学知识和专业技能分析和解决问题的能力

□优□良□中□及格□不及格

4、研究方法的科学性；技术线路的可行性；设计方案的合理性

□优□良□中□及格□不及格

5、完成毕业论文（设计）期间的出勤情况

□优□良□中□及格□不及格

二、论文（设计）质量

1、论文（设计）的整体结构是否符合撰写规范？

□优□良□中□及格□不及格

2、是否完成指定的论文（设计）任务（包括装订及附件）？

□优□良□中□及格□不及格

三、论文（设计）水平

1、论文（设计）的理论意义或对解决实际问题的指导意义

□优□良□中□及格□不及格

2、论文的观念是否有新意？

设计是否有创意？

□优□良□中□及格□不及格

3、论文（设计说明书）所体现的整体水平

□优□良□中□及格□不及格

建议成绩：

□优□良□中□及格□不及格

（在所选等级前的□内画“√”）

指导教师：

（签名）单位：

（盖章）

年月日

评阅教师评阅书

评阅教师评价：

一、论文（设计）质量

1、论文（设计）的整体结构是否符合撰写规范？

□优□良□中□及格□不及格

2、是否完成指定的论文（设计）任务（包括装订及附件）？

□优□良□中□及格□不及格

二、论文（设计）水平

1、论文（设计）的理论意义或对解决实际问题的指导意义

□优□良□中□及格□不及格

2、论文的观念是否有新意？

设计是否有创意？

□优□良□中□及格□不及格

3、论文（设计说明书）所体现的整体水平

□优□良□中□及格□不及格

建议成绩：

□优□良□中□及格□不及格

（在所选等级前的□内画“√”）

评阅教师：

（签名）单位：

（盖章）

年月日

教研室（或答辩小组）及教学系意见

教研室（或答辩小组）评价：

一、答辩过程

1、毕业论文（设计）的基本要点和见解的叙述情况

□优□良□中□及格□不及格

2、对答辩问题的反应、理解、表达情况

□优□良□中□及格□不及格

3、学生答辩过程中的精神状态

□优□良□中□及格□不及格

二、论文（设计）质量

1、论文（设计）的整体结构是否符合撰写规范？

□优□良□中□及格□不及格

2、是否完成指定的论文（设计）任务（包括装订及附件）？

□优□良□中□及格□不及格

三、论文（设计）水平

1、论文（设计）的理论意义或对解决实际问题的指导意义

□优□良□中□及格□不及格

2、论文的观念是否有新意？

设计是否有创意？

□优□良□中□及格□不及格

3、论文（设计说明书）所体现的整体水平

□优□良□中□及格□不及格

评定成绩：

□优□良□中□及格□不及格

教研室主任（或答辩小组组长）：

（签名）

年月日

教学系意见：

系主任：

（签名）

年月日

摘要：

果蝇fasⅢ基因是蛋白编码类基因，在精巢中fasⅢ基因主要在hubcell中表达，本实验运用基因克隆技术，以PET28a质粒为载体，选用BamHI、HindⅢ两种酶做双酶切，将目的基因fasⅢ导入质粒载体PET28a，从而构建原核表达载体PET28a-fasⅢ，再将重组质粒转化到大肠杆菌TOP10中，实现fasⅢ基因的原核表达。

实验所用质粒载体用卡那抗性（Kanr）标记，只有转化成功的大肠杆菌才能在涂有卡那霉素的LB培养基中生长。

最终目的是实现fasⅢ蛋白的原核表达与纯化，为以后制备多克隆抗体奠定基础。

关键词：

基因克隆；fasⅢ基因；原核表达载体；原核表达；

TheconstructionoffasIIIprokaryoticexpressionvectors

ziweiFei，Collegeoflifescience

Abstract:

DrosophilaFasgeneisproteincodinggeneintestis,mainlyexpressedinhubcell.Inthisexperiment,bymeansofgenecloningtechnique,thetargetgeneFasIIIwasinsertedintotheplasmidvectorPET28awhichwasdigestedbytwoenzymesofBamHIandHindⅢ.soastoconstructtheprokaryoticexpressionvectorPET28a-fasⅢ,thentherecombinantplasmidwastransformedintoEscherichiacoliTOP10,achieveFasIIIgeneprokaryoticexpression.Theplasmidvectorwasmarkedwithkanamycinresistant（Kanr）,OnlywastransformedsuccessfullyEscherichiacolicangrowinLBmediumwhichwascoatedwithkanamycin.TheultimateaimistorealizetheprokaryoticexpressionandpurificationofFasIIIprotein,forthefuturelaythefoundationforpreparingpolyclonalantibody.

Keywords:

Genecloning；fasⅢ；theprokaryoticexpressionvector；

prokaryoticexpression；

1前言

1.1果蝇精巢的基本特征

有两个精巢，形状为长而卷曲状的管状，图示1-2[3]显示出了精巢前端的结构。

精巢里有两类干细胞:

生殖干细胞GSC和体节干细胞SSC。

GSC有7-9个，位于精巢的顶端，与Hubcell（HC）直接接触，HC是精巢GSC微环境的重要组成部分[4]，SSC包裹在GSC周围，和HC共同构成了GSC的“niche”[5]。

同卵巢GSCs一样,精巢的GSCs也通过不对称分裂产生2个子代细胞，一个仍然处于微环境中，与HC直接接触，成为新的GSC，另一个远离微环境，发育为GB（gonialblast）细胞，走向分化。

GB细胞经四次胞质不完全分裂形成一个16cell相连的合胞体。

Fusome在GB中是圆形的，在分化的合胞体呈分支状。

每个GB或合胞体都被两个SCCs围绕着，持续调控它们的分化。

图1-2精巢前端的结构

Fig.1-2Theleading-endstructureoftesis

1.2fasⅢ基因

干细胞研究是目前国际研究前沿的热点之一，生殖干细胞GSC的研究对于干细胞维持与分化等领域，以及生殖医学及其相关疾病等的治疗都将提供有价值的资料。

果蝇具有繁殖周期短、结构相对简单、拥有成熟的遗传分析手段及丰富的遗传学资源等特点；同时鉴于果蝇生殖干细胞分裂和分化发育过程中的细胞谱系都研究得很清楚，故果蝇的精巢和卵巢是细胞和分子水平上研究干细胞生物学的理想系统。

fasⅢ基因是蛋白编码类基因，具有七个转录本，最早发现于神经细胞中，功能是以Ca2+独立的方式介导细胞粘附，在轴突发展、指导和束状的神经系统的发展发挥作用。

果蝇精巢中fasⅢ基因主要在hubcell中表达[1]，利用fasIII基因的表达蛋白制备多克隆抗体，进行抗原抗体免疫荧光反应，可以确定Hub细胞的位置[2]，从而有利于对果蝇精巢干细胞的研究。

1.3载体（Vectors）

广义上通常把能携带外源基因进入受体细胞的运载工具叫载体。

在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体[6]。

1、基因工程对载体的要求：

（1）具有对受体细胞的可转移性，可提高载体导入受体细胞的效率。

（2）具有与特定受体细胞相适应的复制原点或整合位点，使得外源基因可在受体细胞中大量繁殖或稳定遗传。

（3）具有多种单一的核酸酶切位点（多克隆位点），可用于外源基因的插入，同时不影响载体的扩增和繁殖。

（4）具有合适的选择标记，便于重组DNA分子的检测。

（5）具有较好的安全性，不能任意转移，避免基因的非控制性扩散，给人类造成危害。

本实验选用的PET28a为质粒载体，长度为5369bp。

1.4抗菌素的抗性工作原理

卡那霉素（kanamycin，Kan）杀菌原理：

通过与70S核糖体结合，导致mRNA发生错读。

杀死细菌。

细菌抗性原理：

Kanr编码的氨基糖苷磷酸转移酶，对卡那霉素进行修饰，阻断其与核糖体结合作用。

2实验材料与方法

2.1实验材料

2.1.1实验仪器

表2.1实验仪器及厂家

Table2.1Experimentalinstrumentsandmanufacturers

仪器名称nameofapparatus

生产厂家manufacturers

恒温水浴锅HH-2

江苏金坛市宏华仪器厂

双人单面净化工作台SW-CJ-2FD

苏州净化设备有限公司

高速冷冻离心机

Eppendorf

DNA扩增仪Lcycler

电热恒温培养箱

上海博讯实业有限公司医疗设备厂

立式压力蒸汽灭菌器

上海申安医疗器械厂

气浴恒温振荡器SH2-82A

金坛市宏华仪器厂

智能电热鼓风干燥箱

上海成顺仪器仪表有限公司

2.1.2实验试剂

限制性核酸内切酶：

BamHIHindⅢ

10×KBuffer通用Buffer

BSA

primerSTARMAXpremix

cDNA模板

CIAP碱性磷酸酶

琼脂糖

1×TAE缓冲液

溴化乙锭溶液EB

DNA分子量Marker15kb

10×loadingbuffer

5MNacl

苯酚、氯仿

无水乙醇

75%乙醇溶液

T4DNA连接酶

10×T4DNAligasebuffer

Inoue转化缓冲液

DMSO二甲亚矾

LB液体培养基

试剂盒：

琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒离心柱型

质粒小提试剂盒（离心柱型）

2.1.3引物

本实验所用的扩增引物和测序序列均由生工生物工程上海有限公司合成部合成。

引物片段：

Fas-bamH/F：

ataggatccCTCCTCAACGAAGGCATCG

Fas-Hind/R：

ataaagcttctaGAGGCTGCTGCTGGGCGGTTTG

2.1.4质粒载体

本实验所用质粒载体PET28a来自于本实验室保存。

2.2实验方法

2.2.1目的基因的获取

1、PCR反应体系

表2.1PCR反应体系150μl

Table2.1PCRreactionsystem（150μl）

反应组分

体积

2×primerSTARMAXpremix

75.0μl

上游引物fasⅢ-bamH/F

1.5μl

下游引物fasⅢ-Hind/R

1.5μl

cDNA模板

6.0μl

ddH2O

66.0μl

2、PCR反应程序

98℃5min

98℃20s

30cycles55℃20s

72℃1min30s

72℃5min

16℃4min

3、琼脂糖凝胶电泳检测

（1）制备0.1％琼脂糖凝胶：

称取0.25g琼脂糖，加入25ml1×TAE缓冲液，置微波炉加热至完全融化，取出摇匀。

（2）胶板的制备：

1）将塑料内槽洗净、晾干，放置于水平制胶器中，并放好样品梳；

2）待胶液冷到60℃左右时，加入2—3μl的溴化乙锭，轻轻混匀后将胶液倒入塑料内槽，至塑料板上形成一层胶面；

3）待胶液凝固后，将梳子轻轻垂直拔出；

4）将塑料内槽取出放入电泳槽内，并加入1×TAE缓冲液至电泳槽中使缓冲液浸没胶面，高出凝胶。

（3）加样：

取约2μl10×loadingbuffer与2μlPCR产物混合均匀，用移液枪加到凝胶孔中，并用DL15000TMDNAMaker做对照。

（4）电泳：

盖好电泳槽盖子，接通电泳槽与电泳仪的电源，选择电泳电压120V，开始电泳。

（5）观察结果：

取出样品，在紫外灯下观察，摄像，根据片段大小判断目的片段是否扩增成功。

2.2.2酶切

1、DNA产物的纯化

产物共150μL，集中到1.5mLEP管，加无菌水至500μL

（1）酚抽：

在EP管中加入等体积，即500μL苯酚/氯仿混合液，颠倒混匀，室温12000r/min离心5min，吸取上层液到新的EP管，吸约450μL

（2）加入1/10体积的5MNaCl（按450uL换算，即45μLNaCl）

（3）加入2-3倍体积无水乙醇1mL，混匀，4℃12000r/min离心10min，吸走上清液，产物沉淀在底部。

（4）漂洗：

用70%乙醇清洗沉淀1-2次，离心，彻底吸走上清液。

（5）干燥和溶解：

自然干燥5min至残留乙醇挥发干净，加入20μL无菌水溶解。

2、酶切，体系如表2.2所示

表2.2酶切体系50μl

Table2.2Enzymedigestionsystem（50μl）

反应组分

体积

无菌水

18.0μl

BSA

5.0μl

10×K.Buffer

5.0μl

BamHI

1.0μl

HindⅢ

1.0μl

质粒或片段

20.0μl

溶液配好混匀后瞬时离心，使溶液集中于管底，放在37℃水浴锅水浴1h；其中PET28a质粒酶切管在水浴1h后需加入1μlCIAP，接着水浴30min。

2.2.3琼脂糖凝胶电泳法回收DNA

1、制胶

2、切胶

3、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒

操作步骤

（1）柱平衡步骤：

向吸附柱CA2中加入500μl平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

（2）将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下，放入干净的离心管中，称取重量。

（3）向胶块中加入3倍体积溶胶液PN，50℃水浴放置10min，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

（4）将上一步所得的溶液加入一个吸附柱CA2中，室温放置2min，12000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。

（5）将吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW，12000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。

（6）重复操作步骤5

（7）将吸附柱CA2放入收集管中，12000rpm离心2min，尽量除尽漂洗液。

将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底晾干。

（8）将吸附柱CA2放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温放置2min。

12000rpm离心2min收集DNA溶液。

（9）电泳检测：

分别取3μl酶切样品与2μl10×loadingbuffer混合后加到凝胶孔中开始电泳，电泳结束后取出样品，在紫外灯下观察，摄像。

2.2.4DNA片段的体外连接（目的基因导入质粒载体）

1、配制连接体系，各成分如表2.3所示，体系中外源基因量要多些，载体的量要少些；

表2.3连接体系10μl

Table2.2Connectionsystem（10μl）

反应组分

体积

10×T4DNAligaseBuffer

1.0μl

T4DNAligase

0.8μl

酶切的PET28a质粒

3.0μl

酶切的fasⅢ片段

5.2μl

2、混匀后用瞬时离心，使液体全部集中于管底；

3、将离心管放于16℃水浴锅保温过夜；

4、取出连接体系，利用感受态细胞进行转化实验。

2.2.5连接体系的转化

1、取1管100μl的TOP10超级感受态细胞，在冰上化冻后，在无菌操作台里向EP管中加入7μl连接体系，用枪轻轻吹打混匀；

2、将EP管插在冰水复合物中冰浴30min；

3、将EP管放到42℃恒温水浴锅中保温90s，然后迅速放到冰水复合物中冰浴2min；

4、在无菌操作台里向EP管中加入1ml的含K的液体LB培养液，混匀后放于摇床上37℃振荡培养45min，转速为150rpm/min，使细胞恢复正常生长状态；

5、45min之后，3000r/min离心3min

6、在无菌操作台中弃去950μl上清液，余下的150μl用移液枪轻轻打匀，吸至含K的LB培养基平板中，用事先已经加热灭菌并冷却后的三角推棒轻轻涂布均匀；

7、待涂布液干燥后，将平板37℃培养箱中倒置过夜培养。

2.2.6挑菌落做菌落PCR

1、PCR反应体系

表2.4PCR反应体系25μl

Table2.4PCRreactionsystem（25μl）

反应组分

体积

10×PCRBuffer

2.5μl

dNTP

0.25μl

上游引物fasⅢ-bamH/F

0.25μl

下游引物fasⅢ-Hind/R

0.25μl

rTaq酶

0.25μl

模板

ddH2O

21.5μl

模板：

阳性对照—重组质粒的连接体系

阴性对照—无菌水

实验组—待检测的菌落

2、PCR反应程序

97℃3min

94℃30s

30cycles52℃30s

72℃1min

72℃3min

16℃3min

3、琼脂糖凝胶电泳检测：

以DNAMamker和阳性对照作参考，判断实验组条带大小是否正确，进而判断是否为阳性克隆。

2.2.7重组质粒的转管培养

1、经过菌落PCR鉴定后，挑选4个初步鉴定是阳性克隆的菌落转管培养。

2、将无菌操作台灭菌后，取4个15mlEP管，分别加入约4ml含卡那霉素（Kan）的LB液体培养基。

3、用无菌枪头挑取单菌落，在EP管的培养基中轻轻搅拌，并将枪头打入EP管中，盖紧管盖，放于摇床上37℃振荡培养过夜，转速为180rpm/min。

2.2.8PET28a-fasⅢ质粒的少量制备

1、菌液保种：

将选取的菌液扩大培养，浑浊后分别取450μl菌液并各加入50μlDMSO于-20℃冻存。

2、用质粒小提试剂盒（离心柱型）提取并制备质粒。

操作步骤：

（1）柱平衡步骤：

向吸附柱CP3中加入500μl平衡液BL，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

（2）取1.5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12000rpm离心1min，尽量吸除上清。

（3）向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1（使用前已加入RNaseA）,用移液枪彻底悬浮细菌沉淀。

（4）向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解，所用时间不超过5分钟。

（5）向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，将出现白色絮状沉淀。

12000rpm离心10min。

（6）将上一步收集的上清液用移液枪转移到吸附柱CP3中，尽量不要吸出沉淀。

12000rpm离心30sec,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

（7）向吸附柱CP3中加入500μl去蛋白液PD，12000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。

（8）向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW，12000rpm