解析 基因工程.docx

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解析基因工程

DNA重组技术的基本工具和基因工程的基本操作程序

基础自查

一．基因工程的概念

基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。

基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。

二．基因工程的基本工具

1.限制性核酸内切酶（限制酶）

（1）来源：

主要是从原核生物中分离纯化出来的。

（2）功能：

能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，具有专一性。

（3）结果：

产生的DNA片段末端通常有两种形式：

黏性末端和平末端。

2.DNA连接酶

（1）两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）比较：

①相同点：

都缝合磷酸二酯键。

②区别：

E·coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。

（2）与DNA聚合酶作用的异同:

DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。

DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。

3.载体

（1）载体具备的条件：

①能在受体细胞中复制并稳定保存。

②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。

③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。

（2）最常用的是质粒,其它载体：

噬菌体的衍生物、动植物病毒

三．基因工程的基本操作程序

第一步：

目的基因的获取

１.反转录法和化学合成法

２.PCR技术扩增目的基因

（1）原理：

DNA双链复制

（2）过程：

：

DNA解链；引物结合到互补DNA链，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。

第二步：

基因表达载体的构建

1.目的：

使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。

2.组成：

目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因

（1）启动子：

是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。

（2）终止子：

也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。

（3）鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。

常用的标记基因是抗生素基因。

第三步：

将目的基因导入受体细胞

2.常用的方法：

a、农杆菌转化法基因枪法和花粉管通道法等。

b、显微注射技术受精卵。

C、大肠杆菌先用Ca2+处理细胞，使其成为感受态细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。

第四步：

目的基因的检测和表达

1.转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因DNA分子杂交技术。

2.目的基因是否转录出了mRNA用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。

3.目的基因是否翻译成蛋白质转基因生物中提取蛋白质抗体进行抗原－抗体杂交。

4.个体生物学水平的鉴定。

课堂深化探究

一．对基因工程概念的理解

别名

基因拼接技术或DNA重组技术

操作环境

生物体外

操作对象

基因

操作水平

DNA分子水平

基本过程

剪切→拼接→导入→表达

结果

人类需要的基因产物

与杂交育种相比

克服远缘杂交不亲和的障碍

与诱变育种相比

定向改造生物性状

原理

基因重组

二．基因工程的基本操作工具

1．与DNA分子相关的酶

（1）几种酶的比较

种类

项目

限制酶

DNA连接酶

DNA聚合酶

解旋酶

作用底物

DNA分子

DNA分子片段

脱氧核苷酸

DNA分子

作用部位

磷酸二酯键

磷酸二酯键

磷酸二酯键

碱基对间的氢键

作用特点

切割目的基因及载体，能专一性识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开

将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键

只能将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上

将DNA

两条链之

间的氢键

打开　　

作用结果

形成黏性末端或平末端

形成重组DNA分子

形成新的DNA分子

形成单链

DNA分子

（2）

①原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。

②DNA连接酶起作用时不需要模板。

2．载体

（1）①作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内。

②利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。

（2）①能在宿主细胞内稳定保存并大量复制。

②有多个限制酶切割位点，以便与外源基因连接。

③具有特殊的标记基因，以便进行筛选。

（3）①质粒：

一种祼露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，能够自我复制的很小的双链环状DNA分子。

②λ噬菌体的衍生物。

③动植物病毒。

三．基因工程操作程序

1．

（1）目的基因的获取途径

①从自然界中已有的物种中分离出来，如从基因组文库或cDNA文库中获取。

②人工合成目的基因

常用的方法有反转录法和化学合成法。

③利用PCR技术扩增目的基因

通过PCR技术可对已获取的目的基因进行扩增，以获取大量的目的基因。

（2）基因表达载体的构建

（3）将目的基因导入受体细胞（转化）

生物种类

植物细胞

动物细胞

微生物细胞

常用方法

农杆菌转化法

显微注射技术

Ca2＋处理法

受体细胞

体细胞

受精卵

原核细胞

转化过程

将目的基因插入Ti质粒的TDNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA上→表达

将含有目的基因的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物

Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子

（4）目的基因的检测与鉴定

类　型

检测内容

方　法

结果显示

分子

检测

导入检测

目的基因是否进入受体细胞

DNA分子杂交（DNA和DNA之间）

杂交带

转录检测

目的基因是否转录出mRNA

分子杂交（DNA和mRNA之间）

杂交带

翻译检测

目的基因是否翻译成蛋白质

抗原—抗体杂交

杂交带

个体水平检测

包括做抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；对基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较，以确定功能活性是否相同

对应训练

1.下列关于基因工程的叙述，错误的是（）

A．目的基因和受体细胞均可来自动物、植物或微生物

B．限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶

C．人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性

D．载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达

2.下列有关基因工程中限制性核酸内切酶的描述，错误的是（　　）。

A．一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列

B．限制性核酸内切酶的活性受温度影响

C．限制性核酸内切酶能识别和切割RNA

D．限制性核酸内切酶可从原核生物中提取

3.如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性核酸内切酶。

下列说法错误的是（　　）。

A．图示过程是基因工程的核心步骤

B．表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠ

C．抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来

D．除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构

4.下图是获取转基因抗冻番茄植株的过程示意图，有关叙述正确的是（　　）

A．过程①获取的目的基因，可用于基因工程和比目鱼基因组测序

B．将多个抗冻基因编码区依次相连成能表达的新基因，不能得到抗冻性增强的抗冻蛋白

C．过程②构成的重组质粒缺乏标记基因，需要转入农杆菌才能进行筛选

D．应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达

限时训练

题组一　基因工程及基本操作

1.科学家将动物体内的能够合成胰岛素的基因与大肠杆菌的DNA分子重组，并且在大肠杆菌体内表达成功。

请根据图回答问题:

（1）此图表示的是采取　合成基因的方法获取　　　　　　　基因的过程。

（2）图中①DNA是以　　　　　　　　为模板，　　　　　　形成单链DNA，在酶的作用下合成双链DNA，从而获得了所需要的基因。

（3）图中③代表　　　DNA，含　　　　　　　基因。

（4）图中④表示　。

2．下图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是（　　）

A．①②③④B．①②④③C．①④②③D．①④③②

3．下列关于基因工程的叙述，不正确的是（多选）（　　）

A．基因工程经常以抗菌素抗性基因为目的基因

B．细菌质粒是基因工程常用的运载体

C．通常用一种限制性核酸内切酶处理含目的基因的DNA，用另一种处理运载体DNA

D．为培育成抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体

题组二　基因工程的操作程序

4.下图表示利用基因工程培育抗虫棉的过程，请据图回答下列有关问题。

（1）若限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—↓GATC—，限制酶Ⅱ识别序列和切点是—G↓GATCC—，那么在①过程中，应用限制酶________切割质粒，用限制酶________切割抗虫基因。

（2）将通过②过程得到的大肠杆菌涂布在含有________的培养基上，若能够生长说明已导入了普通质粒或重组质粒，反之则说明没有导入。

（3）要确定抗虫基因导入后，是否能稳定遗传并表达，需进行检测和鉴定工作，则在个体水平上的鉴定过程可简述为：

________。

经筛选分析，该植株细胞中含有一个携带抗虫基因的DNA片段，因此可以把它看作是杂合子。

理论上，该转基因植株自交产生的F1代中，仍具有抗虫特性的植株占总数的________。

（4）⑤过程所用的现代生物技术称为________，从遗传学角度来看，据细胞通过⑤过程，能形成棉植株的根本原因是细胞具有____________________。

5．干扰素是病毒侵入人体后由淋巴细胞产生的一种免疫活性物质，它具有广谱抗病毒的作用。

利用现代生物技术生产干扰素的流程如下：

（1）过程①产生的物质A是______，cDNA文库______（大于/小于）人的基因组文库。

（2）过程④用到的工具酶是______________，过程⑤需先用____________________处理受体细胞，过程⑥通常采用________技术。

（3）过程⑧和⑨的关键技术分别是________、________。

（4）基因工程的核心步骤是图中的________________（填标号）。

题组三综合题

6.（2011·安徽理综31）家蚕细胞具有高效表达外源基因的能力。

将人干扰素基因导入家蚕细胞并大规模培养，可提取干扰素用于制药。

（1）进行转基因操作前，需用________酶短时处理幼蚕组织，以便获得单个细胞。

（2）为使干扰素基因在家蚕细胞中高效表达，需要把来自cDNA文库的干扰素基因片段正确插入表达载体的________和________之间。

（3）采用PCR技术可验证干扰素基因是否已经导入家蚕细胞。

该PCR反应体系的主要成分应包含：

扩增缓冲液（含Mg2＋）、水、4种脱氧核糖核苷酸、模板DNA、________和________。

（4）利用生物反应器培养家蚕细胞时，贴壁生长的细胞会产生接触抑制。

通常将多孔的中空薄壁小玻璃珠放入反应器中，这样可以________，增加培养的细胞数量，也有利于空气交换。

7．（2010·天津理综，7Ⅰ）下图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线。

图中tetR表示四环素抗性基因，ampR表示氨苄青霉素抗性基因，BamHⅠ、HindⅢ、SmaⅠ直线所示为三种限制酶的酶切位点。

据图回答问题。

（1）图中将人乳铁蛋白基因插入载体，需用________________限制酶同时酶切载体和人乳铁蛋白基因。

筛选含有重组载体的大肠杆菌首先需要在含________的培养基上进行。

（2）能使人乳铁蛋白基因在乳腺细胞中特异性表达的调控序列是________（填字母代号）。

A．启动子B．tetRC．复制原点D．ampR

（3）过程①可采用的操作方法是________（填字母代号）。

A．农杆菌转化B．大肠杆菌转化

C．显微注射D．细胞融合

（4）过程②采用的生物技术是________________。

（5）对早期胚胎进行切割，经过程②可获得多个新个体。

这利用了细胞的________性。

（6）为检测人乳铁蛋白是否成功表达，可采用________（填字母代号）技术。

A．核酸分子杂交B．基因序列分析

C．抗原—抗体杂交D．PCR

8．（2009·上海卷）人体细胞内含有抑制癌症发生的P53基因，生物技术可对此类基因的变化进行检测。

（1）目的基因的获取方法通常包括________和________。

（2）上图表示从正常人和患者体内获取的P53基因的部分区域。

与正常人相比，患者在该区域的碱基会发生改变，在上图中用方框圈出发生改变的碱基对，这种变异被称为________。

（3）已知限制酶E识别序列为CCGG，若用限制酶E分别完全切割正常人和患者的P53基因部分区域（见上图），那么正常人的会被切成________个片段，而患者的则被切割成长度为________对碱基和________对碱基的两种片段。

（4）如果某人的P53基因部分区域经限制酶E完全切割后，共出现170、220、290和460个碱基对的四种片段，那么该人的基因型是________（以P＋表示正常基因，P－表示异常基因）。

9．（2009·福建卷）转基因抗病香蕉的培育过程如图所示。

质粒上有PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ等四种限制酶切割位点。

请回答下列问题。

（1）构建含抗病基因的表达载体A时，应选用限制酶________，对________进行切割。

（2）培养板中的卡那霉素会抑制香蕉愈伤组织细胞的生长，欲利用该培养基筛选已导入抗病基因的香蕉细胞，应使基因表达载体A中含有________，作为标记基因。

（3）香蕉组织细胞具有________，因此，可以利用组织培养技术将导入抗病基因的香蕉组织细胞培育成植株。

图中①、②依次表示组织培养过程中香蕉组织细胞的________。

高考真题体验

1．（2012浙江高考６）天然的玫瑰没有蓝色花，这是由于缺少控制蓝色色素合成的基因B，而开蓝色花的矮牵牛中存在序列已知的基因B。

现用基因工程技术培育蓝玫瑰，下列操作正确的是（）

A.提取矮牵牛蓝色花的mRNA，经逆转录获得互补的DNA，再扩增基因B

B.利用限制性核酸内切酶从开蓝色花矮牵牛的基因文库中获取基因B

C.利用DNA聚合酶将基因B与质粒连接后导入玫瑰细胞

D.将基因B直接导入大肠杆菌，然后感染并转入玫瑰细胞

2.（2012高考全国新课标卷40）根据基因工程的有关知识，回答下列问题：

（1）限制性内切酶切割ＤＮＡ分子后产生的片段，其末端类型有　　　和　　　。

（2）质粒运载体用EcoRⅠ切割后产生的片段如下：

为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外，还可用另一种限制性内切酶切割，该酶必须具有的特点是　　　。

[来源：

z#zs#]

（3）按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即　　　　　DNA连接酶和　　　　　　　DNA连接酶。

（4）反转录作用的模板是　　　，产物是　　　。

若要在体外获得大量反转录产物，常采用　　　技术。

（5）基因工程中除质粒外，　　　　　和　　　　　　也可作为运载体。

（6）若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是　　　　　　　。

3.（2012福建高考３２）现代生物科技专题。

肺细胞中的let-7基因表达减弱，癌基因RAS表达增强，会引发肺癌。

研究人员利用基因工程技术将let-7基因导入肺癌细胞实验表达，发现肺癌细胞的增殖受到抑制。

该基因工程技术基本流程如图１。

请回答：

（１）进行过程①时，需用酶切开载体以插入let-7基因。

载体应用RNA聚合酶识别和结合的部位，以驱动let-7基因转录，该部位称为。

（２）进行过程②时，需用酶处理贴附在培养皿壁上的细胞，以利于传代培养。

（３）研究发现，let-7基因能影响RAS的表达，其影响机理如图２。

据图分析，可从细胞提取进行分子杂交，以直接检测let-7基因是否转录。

肺癌细胞增殖受到抑制，可能是由于细胞中（RASmRNA/RAS蛋白）含量减少引起的。

４.（2012天津高考7）生物分子间的特异性结合的性质广泛用于生命科学研究。

以下实例为体外处理“蛋白质-DNA复合体”获得DNA片段信息的过程图。

据图回答：

（1）过程①酶作用的部位是键，此过程只发生在非结合区DNA，过程②酶作用的部位是键。

（2）①、②两过程利用了酶的特性。

（3）若将得到的DNA片段用于构建重组质粒，需要过程③的测序结果与酶的识别序列进行对比，以确定选用何种酶。

（4）如果复合体中的蛋白质为RNA酶聚合，则其识别、结合DNA序列位基因的

。

（5）以下研究利用了生物分子间的特异性结合的有（多选）

A.分离得到核糖体，用蛋白酶酶解后提取rRNA

B.用无水乙醇处理菠菜叶片，提取叶绿体基粒膜上的光合色素

C．通过分子杂交手段，用荧光物质标记的目的基因进行染色体定位

D．将抑制成熟基因导入番茄，其mRNA与催化成熟酶基因的mRNA互补结合，终止后者翻译，延迟果实成熟。

５.（2012江苏高考32）图1表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp即碱基对）和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。

现有MspI、BamHI、MboI、SmaI4种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。

请回答下列问题

（1）图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由连接。

（2）若用限制酶SmaI完全切割图1中DNA片段，产生的末端是末端，其产物长度为。

（3）若图1中虚线方框内的碱基对被T-A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。

从杂合子中分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaI完全切割，产物中共有种不同长度的DNA片段。

（4）若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是。

在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加的培养基进行培养。

经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是。

6．（2011·四川理综，5）北极比目鱼中有抗冻基因，其编码的抗冻蛋白具有11个氨基酸的重复序列，该序列重复次数越多，抗冻能力越强。

下图是获取转基因抗冻番茄植株的过程示意图，有关叙述正确的是（　　）。

A．过程①获取的目的基因，可用于基因工程和比目鱼基因组测序

B．将多个抗冻基因编码区依次相连成能表达的新基因，不能得到抗冻性增强的抗冻蛋白

C．过程②构成的重组质粒缺乏标记基因，需要转入农杆菌才能进行筛选

D．应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达

7.（2011•浙江）将ada（腺苷酸脫氨酶基因）通过质粒pET28b导人大肠杆菌并成功表达腺苷酸脱氨酶。

下列叙述错误的是（　）

A．每个大肠杆菌细胞至少含一个重组质粒

B．每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点

C．每个限制性核酸内切酶识别位点至少插入一个ada

D．每个插入的ada至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子

8．（2010·全国Ⅱ，5）下列叙述符合基因工程概念的是（　　）。

A．B淋巴细胞与肿瘤细胞融合，杂交瘤细胞中含有B淋巴细胞中的抗体基因

B．将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株

C．用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株

D．自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上

9．（2010·浙江理综，2）在用基因工程技术构建抗除草剂的转基因烟草过程中，下列操作错误的是（　　）。

A．用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸

B．用DNA连接酶连接经切割的抗除草剂基因和载体

C．将重组DNA分子导入烟草原生质体

D．用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞

10．（2010·江苏卷）下列关于转基因植物的叙述，正确的是（　　）。

A．转入到油菜的抗除草剂基因，可能通过花粉传入环境中

B．转抗虫基因的植物，不会导致昆虫群体抗性基因频率增加

C．动物的生长激素基因转入植物后不能表达

D．如转基因植物的外源基因来源于自然界，则不存在安全性问题

11．（2009·浙江卷）下列关于基因工程的叙述，错误的是（　　）。

A．目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物

B．限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶

C．人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性

D．载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达