海洋浮游生物学实验指导2008.doc

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海洋浮游生物学实验指导

实验室规则和显微镜的镜检方法……………………………………………1

实验一藻类细胞的观察与计数………………………………………………2

实验二藻类细胞大小的测定…………………………………………………4

实验三微藻的分离培养………………………………………………………6

实验四浮游动物的观察1……………………………………………………12

实验五浮游动物的观察2……………………………………………………13

实验六浮游动物的观察3……………………………………………………16

附录水生生物的基本调查方法……………………………………………17

实验室规则

   1．实验课前必须预习实验内容，实验课不得无故迟到、早退、旷课。

   2．实验时做到细致，认真，避免吸烟，随地吐痰，大声喧哗。

   3．爱护公物，不随便动用实验室的仪器，标本。

若损坏器材，立即向老师登记，若要借用实验器材，须征得老师同意。

4．每次实验后，须交实验报告，将所用器材擦洗干净，放回原处，值日生要负责清洁工作。

显微镜的镜检方法

   显微镜的使用在基础课已经熟悉，不必赘述，观察浮游生物标本，镜检方法如下：

   1．制片

（1）在制片前先将盖玻片、载玻片擦干净，用吸管吸取器皿中的标本液，滴一滴于载玻片上，然后用镊子将盖破片沿着水珠的边缘慢慢放下，若发现标本液溢出或盖玻片内有气泡时，应将标本液吸回到器皿中，擦净载玻片和盖玻片，重新制片，直至水滴恰好在盖玻片内，并无气泡出现为止。

   观察丝状藻类时，先用镊子取3-5根藻丝放置于载玻片上，用解剖针将藻拨弄均匀，然后吸一滴水，盖上盖玻片即可观察。

（2）每次使用显微镜之前，首先检查镜子的各机械部分和镜头是否有毛病，如发现有毛病立即向老师报告，及时进行处理。

   （3）在使用显微镜之前、之后必须按显微镜的保养方法把它擦干净。

   2．镜检步骤

将做好的片子置于载物台上，用物镜的低倍、中倍、高倍依次检查。

注意：

在用高倍镜头观察时，只需用微调旋钮，以免镜头压坏盖玻片而粘水，引起镜头发霉以至影响使用效果和寿命。

实验一 藻类细胞的观察与计数

（一）实验的目的和要求

  显微镜下观察并识别几种常见海洋微藻的主要形态特征，识别常见种类。

了解血球计数板的计数原理，掌握血球计数板的计数方法。

（二）原理

利用血球计数板在显微镜下直接进行测定。

它观察在一定的容积中的藻类细胞的个体数目，然后推算出藻类细胞密度。

计数板是一块特制的厚玻璃片，玻片上有四个槽构成三个平台，中央平台又由一短槽隔成两半，其上各刻有一小方格网，每个方格网共分九个大格，中央的一大格作为计数用，称为计数室。

计数室刻度有2种：

一种是25中格X16小格，而另一种为16中格X25小格，它们都是由400个小格组成。

每个大方格边长为1mm，则每个大方格面积为1X1=1mm2。

盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间高度为0.1mm,所以每个计数室的体积为0.1X1X1=0.1mm3,每个大格有400个小格，所以每个小方格体积为0.1/400=1/4000mm3=1/4000,000ml。

   （三）实验器材及药品

   显微镜、载玻片、盖玻片、解剖盘、解剖针、小镊子、吸管、培养皿、纱布、擦镜纸、鲁格氏液、自备实验报告纸及绘图铅笔（H、2H），橡皮等。

   （四）方法与步骤

1、用血球计数板测定藻细胞的数量

2、检查血球计数板

取血球计数板一块，先用显微镜检查计数板的计数室，看其是否沾有杂质或干涸着的细胞，若有污物则通过擦洗、冲洗，使其清洁。

镜检清洗后的计数板，直至计数室无污物时才可使用。

3、稀释样品

将培养后的藻培养液振荡振摇混匀，然后作一定倍数的稀释。

稀释度选择以小方格中的分布的细胞清晰可数为宜。

一般以每小格内含4～5个细胞的稀释度为宜。

4、加样

取出一块干净盖玻片盖在计数板中央。

用滴管取1滴藻培养液稀释悬液注入盖玻片边缘，让藻液自行渗入，计数室内不能有气泡，若藻液太多可用吸水纸吸去。

静置5—10分钟。

对于具鞭毛运动迅速种类，应先用鲁格试液固定，摇匀再取样。

5、镜检

待细胞不动后进行镜检计数。

先用低倍镜找到计数室方格后，再用高倍镜测数。

一般应取上下及中央五个中格的总藻数。

计数时若遇到位于线上的菌体，一般只计数格上方（下方）及右方（左方）线上的细胞。

计数时应不时调节焦距，才能观察到不同深度的细胞。

每个样品重复3次。

6、计算

取以上计数的平均值，按下列公式计算出每毫升藻液中的含藻量。

样品中细胞数/ml=每中格平均细胞数x25x10000x稀释倍数（采用25x16规格）。

7清洗

计数板用毕后先用95%的形酒精轻轻擦洗，再用蒸馏水淋洗，然后吸干，最后用擦镜纸揩干净。

若计数的样品是病原微生物，则须先浸泡在5%石炭酸溶被中进行消毒，然后再行清洗。

清洗后放回原位，切勿用硬物洗刷。

8、思考

1、能否用血球计数板在油镜下进行计数？

为什么？

2、根据自己体会，说明血球计数板计数的误差主要来自那些方面？

如何减少误差？

结果记录：

结果记录

名称：

总细胞数：

个/ml

第一个

中格

第二个

中格

第三个

中格

第四个

中格

第五个

中格

第一次

第二次

第三次

平均值

鲁格氏液：

碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml。

先将碘化钾溶于3~5ml蒸馏水中，然后加碘，摇匀，使碘完全溶解后，再加蒸馏水至足量。

装入棕色试剂瓶。

实验二 藻类细胞大小的测定

   一、目的

学习使用显微镜测微尺测定微生物细胞大小，掌握用测微尺测定细胞的方法。

二、原理

微生物细胞的大小是微生物分类鉴定的重要依据之一。

微生物个体微小，必须借助于显微镜才能观察，要测量微生物细胞大小，也必须借助于特殊的测微计在显微镜下进行测量。

显微测微计由镜台测微计和目镜测微计两部分组成。

后者可直接用于测量细胞大小。

它是一块圆形玻片，其中央有精确等分到度，测量时将其放在接目镜中的隔板上。

由于目镜测微计所测量的是微生物细胞经过显微镜放大之后所成像的大小，刻度实际代表的长度随使用的目镜和物镜放大倍数及镜筒的长度而改变，所以，使用前须先用镜台测微计进行标定，求出某一放大率下，目镜测微计每一小格所代表的长度，然后用目镜测微计直接测被测对象的大小。

镜台测微计是一块中央有精确刻玻片（图7—1），刻度的总长为lmm，等分为100小格，每小格长10um，专用于对目镜测微计进行标定的。

三、材料

1、器械

显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺，载玻片、盖玻片、擦镜纸、洗瓶、火柴、滴管。

2、藻种

培养至对数生长期的藻类培养液。

3、流程

置目测微计→置台测微计→标定目测微计→测藻细胞大小→记录结果→用毕擦拭干净

四、步骤

1、藻细胞大小的测定

2、目镜测微尺的校正

3、更换目镜镜头

更换目镜测微尺镜头（标记为PF）；或者取下目镜上部或下部的透镜，在光圈的位置上安上目镜测微尺，刻度朝下，再装上透镜，制成一个目镜测微尺的镜头。

4、某一倍率下标定目镜刻度

将镜台测微尺置于载物台上，使刻度面朝上，先用低倍镜对准焦距、看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器使两尺重叠，并使二尺的左边的某一刻度相重合，向右寻找另外二尺相重合的刻度。

记录两重叠刻度间的目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。

5、计算该倍率下目镜刻度

目镜测微尺每格长度=镜台测微尺格数/目镜测微尺格数xl0um

6、标定并计算其他放大倍率下的目镜刻度

以同样方法分别在不同倍率的物镜下测定目镜测微尺每格代表的实际长度。

如此测定后的测微尺的长度，仅适用于测定时使用的显微镜以及该目镜与物镜的放大倍率。

7、藻细胞大小的测定

8、将藻液制成水浸片。

9、大小换算

将标本先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺测定每个藻细胞长度和宽度所占的刻度，即可换算成藻细胞的长和宽。

10、求平均值

一般测量藻细胞的大小，用同一放大倍数在同一标本上任意测定l0一20个细胞后，求出其平均值即可代表该藻细胞的大小。

11、结果

（1）计算出目镜测微尺在低、高倍镜下的刻度值。

（2）记录藻细胞大小的测定结果。

12、思考

（1）为什么随着显微镜放大倍数的改变，目镜测微计每格相对的长度也会改变？

能找出这种变化的规律吗？

（2）根据测量结果，为什么同种藻其大小不完全相同？

附录：

目镜测数尺有两种：

一是特制的目镜镜头，镜片上刻有50等分或100等分的刻度，使用时直接安装在显微镜上，取代没有刻度的目镜镜头；另一种是一块直径大约17.5mm的圆玻璃片，其中央刻有50等分或100等分的刻度（图7-1A），使用时将该玻璃片安装在原来的目镜镜头上即可。

由于不同的显微镜放大倍数不同，既使同一显微镜在不同的目镜、物镜组合下其放大倍数也不同，故目镜测微尺每格实际表示的长度随显微镜放大倍数不同而异。

也就是说，目镜测微尺上的刻度只代表相对的长度。

因此在使用前须用镜台测微尺校正，以确定在一定放大倍数下目镜测微尺的每格长度。

实验三藻类的分离和培养

   微型藻类的分离和培养方法基本上与菌类的方法相似，但还需加上光照条件，并以液体培养为主。

在大量培养时，可不必考虑无菌条件。

一、目的

　　学习单细胞微型藻类的单种分离和培养方法

二、药品、材料和用具

　　试管，小玻璃碎片（能载一滴水，且能放进试管内），细玻璃管（3~5mm），橡皮管（能套住细玻璃管，自行车气嘴用），显微镜，小烧杯，小电炉，试管，载玻片，棉塞，吸管，灭菌海水，培养箱。

　　f/2培养液：

f/2（Guillard.1962）改良配方（海水）

         工作液（mg/L）        母液（g/L）

A:

  NaNO3           75mg          75g

B:

     NaH2PO4.H2O 5mg         5g

C:

 Na2SiO3.9H2O 20mg          20g

D Na2EDTA          4.36mg        4.36g

E:

 FeCl3.6H2O      3.16mg         3.16g

F:

 CuSO4.5H2O   0.01mg         0.01g

    ZnSO4.7H2O   0.023mg        0.023g

   CoCL2.6H2O  0.012mg        0.012g

 MnCL.4H2O   0.18mg        0.18g

 Na2MoO4 2H2O 0.07mg       0.07g

G：

 维生素B1            0.1μg        0.1mg

   维生素B12  0.5μg        0.5mg

   生