EP5110 细菌内毒素测试使用指南中英文11.docx
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EP5110细菌内毒素测试使用指南中英文11
EP5.1.10细菌内毒素测试使用指南（中英文1/2）
2015-12-2822:
58:
13| 分类：
EP
07/2016:
50110
5.1.10.GUIDELINESFORUSINGTHETESTFORBACTERIALENDOTOXINS 细菌内毒素测试使用指南
1.INTRODUCTION 概述
Endotoxinsfromgram-negativebacteriaarethemostcommoncauseoftoxicreactionsresultingfromcontaminationofpharmaceuticalproductswithpyrogens;theircommonpyrogenicactivityismuchhigherthanthatofotherknownpyrogenicsubstances.Theseendotoxinsarelipopolysaccharides.Althoughthereareasmallnumberofpyrogensthatpossessadifferentstructure,theconclusionisgenerallyjustifiedthattheabsenceofbacterialendotoxinsinasubstanceorproductimpliestheabsenceofpyrogeniccomponents,providedthepresenceofnon-endotoxinpyrogenicsubstancescanberuledout.Themonocyte-activationtest（2.6.30）isasuitablemethodtousetoruleoutthepresenceofnon-endotoxinpyrogensinsubstancesorproducts.
革兰氏阳性菌产生的内毒素是最常见的有毒性反应原因，其原因是药品受到热源污染。
其常见热源活性大大高于其它已知热源物质。
这些内毒素为脂多糖。
尽管有少量热源具有不同的结构，如果排除了非内毒素热源物质的存在的话，通常该原料药或制剂中不存在细菌内毒素的话就能下结论说其中不存在热源成分。
单核细胞激活测试（2.6.30）是用来排除原料药或制剂中非内毒素热源存在的适当方法。
Thepresenceofendotoxinsinasubstanceorproductmaybemaskedbyfactorsinterferingwiththereactionbetweentheendotoxins,thetestreagentsandtheamoebocytelysate.Also,theabilitytodetectendotoxinsmaybeaffectedbystorageconditionsorstoragetime.Hence,theanalystwhowishestoimplementatestforbacterialendotoxinsortoreplacethepyrogentestbyatestforbacterialendotoxinshastodemonstratethatavalidtestcanbecarriedoutonthesubstanceorproductconcerned:
thismayentailaprocedureforremovinginterference.
原料药或制剂中含有的内毒素可能会被干扰因子通过与内毒素、测试用试剂和阿米巴样细胞鲎试剂的反应所掩蔽。
存贮条件和存贮时间也可能影响其检出内毒素的能力。
因此，期望进行细菌内毒素测试，或采用细菌内毒素测试取代热源测试的化验员必须证明对相关的原料药和制剂能进行有效的测试：
可以通过消除干扰因素来使得一个测试方法有效。
Asindicatedingeneralchapter2.6.14.Bacterialendotoxins,informationmustbeavailableonthefollowing2aspectsbeforeatestonasamplecanberegardedasvalid.
正如通论2.6.14“细菌内毒素”中所指出，在对一个样品进行测试前必须获得以下两方面资料，方可认为测试有效：
- Thesuitabilityofthematerialtobeusedforthetesthastobeestablished.TheabsenceofendotoxinsinthewaterforBET（waterforbacterialendotoxinstest）andintheotherreagentsanconsumablesmustbeassuredandthesensitivityoftheamoebocytelysatemustbecheckedtoconfirmthesensitivitydeclaredbythemanufacturer.
- 要检查用于测试的物料的适用性。
必须确保BET用水和其它消耗性试剂中没有内毒素，必须检查阿米巴样细胞鲎试剂以确认其达到生产商所声称的灵敏度。
- Asthesubstanceorproducttobeexaminedmayinterferewiththetest,thesensitivityoftheamoebocytelysateisdeterminedinthepresenceandintheabsenceofthesubstanceorproducttobeexamined.Theremustbenodifferencebetweenthe2sensitivityvalues.
- 由于受测原料药或制剂可能会对测试产生干扰，阿米巴样细胞鲎试剂的灵敏度要在受测原料药或制剂存在时与不存在时分别测试。
两者所得灵敏度值应该没有差异。
Generalchapter2.6.14.Bacterialendotoxinsindicatesmethodsforremovinginterferingfactors;inthecaseofinterference,anothertestmustbecarriedoutaftersuchamethodhasbeenappliedtocheckwhethertheinterferencehasindeedbeenneutralizedorremoved.
通则2.6.14“细菌内毒素”给出了消除干扰因素的方法。
如果有干扰存在，则在常规方法测试完后，还需要有采用另一方法来测试，以检查是否该干扰真的被中和或消除。
Thisgeneralchapterexplainsthereasonsfortherequirementsinthetestforbacterialendotoxins,thendealswithreadingandinterpretationoftheresults.
本通则解释了细菌内毒素测试要求的理由，然后说明了结果读取和诠释要求。
Replacementoftherabbitpyrogentestrequiredinapharmacopoeialmonographbyanamoebocytelysatetest,orbyothermethodssuchasthemonocyte-activationtestoratestusingrecombinantfactorCreagentasareplacementfortheamoebocytelysate,constitutestheuseofanalternativemethodofanalysisandhencerequiresdemonstrationthatthemethodisappropriateforthegivensubstanceorproductandgivesaresultconsistentwiththatobtainedwiththeprescribedmethodasdescribedintheGeneralNotices（seealsosection12）.
采用阿米巴样细胞鲎试剂测试，或其它方法如单核细胞激活测试，替代药典各论中所要求的兔热源测试，或使用重组因子C试剂来替代阿米巴样细胞鲎试剂，都被认为是使用替代分析方法，从而要求证明该方法适用于给定的原料药或制剂，证明其得到的结果与各论中所述预定方法得到的结果一致（参见第12部分）。
Theprescribedmethodforbacterialendotoxinsmaybestatedinthemonographonagivensubstanceorproduct.Theuseofamethodotherthanthemethodprescribedinthemonographisconsideredastheuseofanalternativemethod.Wherenomethodisstated,anyofmethodsAtoFofgeneralchapter2.6.14.Bacterialendotoxinscanbeused.
细菌内毒素所要求的方法可能会在指定物质或制剂各论里指定，如使用不同方法，则被认为是使用了替代方法。
如果各论里没有指定方法，则在2.6.14细菌内毒素里的方法A至F均可使用。
2.METHODANDACCEPTANCECRITERIA 测试方法和可接受标准
2-1.METHODSANDPRECAUTIONSTOBETAKEN 要使用的方法和预防措施
Theadditionofendotoxinstoamoebocytelysatemayresultinturbidity,precipitationorgelation（gel-clot）;initiallyonlythegel-clotmethodwasusedinthePharmacopoeiaasanevaluationcriterioninthetestforbacterialendotoxins.Theadvantagewasthesimplicityofbasingthedecisiontopassorfailthesubstanceorproducttobeexaminedontheabsenceorpresenceofagel-clot,visiblewiththenakedeye.ThequantitativemethodsC,D,EandFweredevelopedlater:
theyrequiremoreinstrumentation,buttheyareeasiertoautomateforregulartestingoflargenumbersofsamplesofthesamesubstanceorproduct.
向阿米巴样细胞鲎试剂中加入内毒素可能会产生混浊、沉淀或凝胶。
刚开始只有凝胶方法进入药典用于细菌内毒素测试的评估标准。
其优点是简单，对受试样品测试结果基于内容目视检查是否出现凝胶，来判定是否通过该测试。
定量方法C、D、E和F是后来建立的，它们需要更多的仪器，但这些方法易于自动化，使日常大规模原料药或制剂样品测试变得更容易。
Endotoxinsmaybeadsorbedontothesurfaceoftubesorpipettesmadefromcertainplasticsortypesofglass.Interferencemayappearduetothereleaseofsubstancesfromplasticmaterials.Hence,thematerialsusedmustbechecked.
内毒素可以被一些型号的塑料或玻璃试管及吸管表面吸收，因此塑料材质上释放出的物质可能会产生干扰。
所以必须对材质进行检查。
2-2.ENDOTOXINLIMITCONCENTRATION 内毒素限度浓度
Thedecisiontousethetestforbacterialendotoxinsasalimittestimpliesfirstlythatanendotoxinlimitconcentrationmustbedefinedforthesubstanceorproducttobeexamined,andsecondlythattheobjectiveofthetestistoknowwhethertheendotoxinconcentrationinthesampletobeexaminedisbeloworabovethislimit.ThequantitativemethodsC,D,EandFmakeitpossibletodeterminetheendotoxinconcentrationinthesampletobeexamined,butforcompliancewiththePharmacopoeiaandinroutinequalitycontrolthefinalquestioniswhetherornotthisconcentrationexceedsadefinedlimit.
决定将细菌内毒素测试作为一个限度测试首先表示定义该原料药或制剂中的细菌内毒素限度浓度，其次测试的目的是知道受测样品中内毒素浓度是否低于或高于此限度。
定量方法C、D、E和F使得有可能确定受测样品中的内毒素浓度，但要符合药典，并且要用于日常质量控制，最后的问题是该浓度是否超出指定的限度。
Thedoseofthesubstanceorproducttobeexaminedmustbetakenintoaccountinsettingtheendotoxinlimitconcentration:
thelimitissetsoastoensurethat,aslongastheendotoxinconcentrationinthesubstanceorproductremainsbelowthislimit,eventhemaximaldoseadministeredbytheintendedrouteperhourdoesnotcontainsufficientendotoxintocauseatoxicreaction.
在设定受检原料药和制剂的内毒素浓度限度时，必须要考虑其使用剂量。
限度设定要确保只要原料药或制剂中的内毒素浓度低于此限度，即使通过既定摄入途径摄入了最大剂量，这些剂量也不会含有足够的内毒素来引发毒性反应。
Whentheendotoxinconcentrationinthesubstanceorproductexactlyequalstheendotoxinlimitconcentration,gelationwilloccur,asisthecasewhentheendotoxinconcentrationismuchhigher,andthesubstanceorproductwillfailthetest,becausetheall-or-nonecharacterofthetestmakesitimpossibletodifferentiatebetweenaconcentrationexactlyequaltotheendotoxinlimitconcentrationandonethatishigher.Itisonlywhennogelationoccursthattheanalystmayconcludethattheendotoxinconcentrationisbelowtheendotoxinlimit.
当原料药或制剂中的内毒素浓度正好等于内毒素限度浓度时，就会发生凝胶化反应，该反应与内毒素浓度大大高于限度浓度时是一样的，这时原料药或制剂就被判定不合格，因为测试的特性是要么合格要么不合格，这样就没法区别浓度正好等于与大大超过两种情况。
只有当没有凝胶反应发生时，化验员才可以得出结论内毒素浓度是低于内毒素的限度。
Forsubstancesorproductsinthesolidstate,thisendotoxinlimitconcentrationpermassunitorperInternationalUnit（IU）ofsubstanceorproducthastobeconvertedintoaconcentrationofendotoxinpermilliliterofsolutiontobeexamined,asthetestcanonlybecarriedoutonasolution.Thecaseofsubstancesorproductsthatalreadyexistintheliquidstate（suchasinfusionfluids）isdiscussedbelow.
对于固体形态的原料药或制剂，原料药或制剂的每一质量单位或每国际单位（IU）的该内毒素限度浓度必须要转换成内每ml供试液里内毒素浓度，因为测试只能在配制成溶液后进行。
以液体形态存在的原料药或制剂的情况（例如灌洗液）讨论如下。
2-3.CALCULATIONOFTHEENDOTOXINLIMIT 内毒素限度计算
Theendotoxinlimitforactivesubstanceadministeredparenterally,definedonthebasisofdose,isequalto:
静脉注射用原料药内毒素限度，根据基本摄入量以如下公式计算：
K/M
K=thresholdprogenicdoseofendotoxinperkilogramofbodymass;
M=maximumrecommendedbolusdoseofproductperkilogramofbodymass
K：
每KG体重内毒素热原剂量阈值
M：
第KG体重药品剂量最大建议快速静脉注射量
Whentheproductistobeinjectedatfrequentintervalsorinfusedcontinuously,Misthemaximumtotaldoseadministeredperhour.
如果产品是频繁使用或持续注入，则M是每小时最大总摄入量
Theendotoxinlimitdependsontheproductanditsrouteofadministrationandmaybestatedinthemonograph.ValuesforKaresuggestedinTables5.1.10-1.
内毒素限度取决于药品及其摄入途径，可能会在各论中有表述。
K值在表5.1.10-1中已经给出。
Forotherroutes,theacceptancecriterionforbacterialendotoxinsisgenerallydeterminedonthebasisofresultsobtainedduringthedevelopmentofthepreparation.
对于其它给药途径，细菌内毒素的可接受标准通常由制剂研发过程中获得的结果来确定。
Table5.1.10-1 表5.1.10-1
Routeofadministration
K
给药途径
K
Intravenous
5.0IUofendotoxinperkilogramofbodymass
静脉
5.0IU内毒素/KG体重
Interavenousforradiopharmaceuticals
2.5IUofendotoxinperkilogramofbodymass
放射药物静脉
2.5IU内毒素/KG体重
Intrathecal
0.2IUofendotoxinperkilogramofbodymass
鞘内
0.2IU内毒素/KG体重
Perenteralformulationsadministeredpersquaremeterofbodysurface
100IU/m2
非肠道给药，按每平方米体表面积
100IU/m2
2-4.CONSIDERATIONSWHENESTABLISHINGANENDOTOXINLIMITFORASPECIFICSUBSTANCEORPRODUCT 在制订特定原料药或制剂内毒素限度时要考虑的内容
Theendotoxinlimitforasubstanceorproductisestablishedwithconsiderationofthefollowingaspects.
在制订原料药或制剂内毒素限度时要考虑以下方面：
Calculatedendotoxinlimit.
Theendotoxinlimitiscalculatedasdescribedinsection2-3
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