核酸提取常见试剂的作用原理之欧阳计创编.docx
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核酸提取常见试剂的作用原理之欧阳计创编
异硫氰酸胍
时间：
2021.02.11
创作：
欧阳计
强用力的卵白质变性剂，能迅速溶解卵白质，招致细胞结构破碎，核卵白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸别离。
胍盐是破坏卵白质三维结构的离液剂，在通常使用的卵白质变性剂中作用最强的是异硫氰酸胍，它们可以使大都卵白质转换成一随机的卷曲状态。
含有强力的阴离子和阳离子基团，它们可以形成较强的氢键。
在还原剂存在的情况下，异硫氰酸胍可以断裂氢键，而去垢剂，如SDS存在的情况下，可以破坏疏水作用。
盐酸胍、尿素
盐酸胍是一个核酸酶的强抑制剂，它其实不是一种足够强的变性剂，可以允许完整的RNA从富含RNase的组织中提取出来。
48M可断裂氢键，有两种可能机制：
1变性卵白和盐酸胍、尿素优先结合，形成变性卵白变性剂复合物，当复合物被除去，从而引起ND反响平衡向右移动，随着变性剂浓度增加，天然状态的卵白不竭转变成复合物，最终招致卵白质完全变性；2盐酸胍、尿素对氨基酸的增溶作用，能形成氢键，当浓度高时，能破坏水的氢键结构，结果盐酸胍、尿素就称为非极性残基的较好溶剂，使卵白质内部的疏水残基伸展和溶解性加强，盐酸胍、尿素引起的变性往往是不成逆的。
高浓度尿素使卵白质变性并抑制Rnase活性
十二烷基肌氨酸钠
使卵白质解体变性
巯基试剂
1避免卵白质或酶等（如辅酶A）分子中SH基团氧化成二硫键，2在某些酶反响过程中维持体系的还原环境。
DTT，DDTE、巯基乙醇应用最广，谷胱甘肽也常应用，由于他是生物体内的还原剂，同时氧化后能被谷胱甘肽还原酶原位释放。
DNA提取中，常使用巯基乙醇，维持缓冲液的还原环境，避免多酚类氧化，由于具有一定的毒性，浓度不该高于2%。
巯基乙醇
β巯基乙醇的主要作用是破坏RNase卵白质中的二硫键（肽和卵白质分子中的半胱氨酸残基中的键）。
1还原卵白质二硫键，使Rna酶变性
2抑制酚类氧化，若氧化，核酸会酿成灰黑色，苯酚的氧化产品苯醌等氧化物引起磷酸二酯键的断裂及招致RNA和DNA的交联
3呵护卵白质的巯基卵白质提取中需要
巯基乙醇还原二硫键，使RNA酶失活
化学变性剂SDS、尿素、盐酸胍能破坏疏水键、盐键、氢键、范德华力使卵白质变性但不影响肽键和二硫键，不克不及使卵白质完全变性
加上还原剂巯基乙醇或DTT，能还原二硫键，使RNA完全变性
DTT二硫苏糖醇
安慰性气味要小很多，毒性也比巯基乙醇低很多。
并且DTT比巯基乙醇的浓度低7倍时，两者效果相近，但DTT价格略高一些。
由于容易被空气氧化，因此DTT的稳定性较差；但冷冻保管或在惰性气体中处理能够延长它的使用寿命。
由于质子化的硫的亲核性较低，随着pH值的降低，DTT的有效还原性也随之降低；DTT或含有DTT的溶液不克不及进行高压处理。
抑制Rnase活性
TCEP三（2甲酰乙基）膦盐酸盐
半胱氨酸
Trizol
苯酚、异硫氰酸胍、8－羟基喹啉、β巯基乙醇等。
TRIzol的主要成分是苯酚。
苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的卵白，核酸物质解聚获得释放。
苯酚虽可有效地变性卵白质，但不克不及完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。
0.1%的8－羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。
异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的卵白质变性剂，可溶解卵白质并使卵白质二级结构消失，招致细胞结构降解，核卵白迅速与核酸别离。
β巯基乙醇的主要作用是破坏RNase卵白质中的二硫键。
液氮
组织破碎，裂解细胞
SDS
十二烷基硫酸钠
阴离子去垢剂，高温（5565℃）裂解细胞，使染色体离析，卵白变性，形成SDS/卵白质/多糖复合物，释放核酸，提高盐（KAc或NaAc）浓度并降高温度（冰浴），使SDS/卵白质/复合物转变成溶解度更小的钾盐酸形式，使卵白质及多糖杂质沉淀更加完全、离心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀水相中的DNA
操纵简单，温和，可提取到高分子量的DNA，但产品多糖类杂质较多
阳离子强概略活性剂，通常与卵白酶K和抗氧化剂、螯合剂一起使用
可破坏细胞膜、核膜，并使组织卵白与DNA别离
溶解膜类卵白
SDS能裂解细胞。
使细胞中的卵白质和核酸之间常借着静电引力或配位键结合，阴离子去污剂能够破坏这种价键，使染色体离析，卵白变性，释放核酸。
（1）SDS是一种阴离子概略活性剂，能使卵白质的氢键和疏水键掀开，并结合到卵白质的疏水部位;
（2）SDS可引起卵白质构象修改
（3）SDS是一种良好的解离剂，可使卵白质溶解，变性
（4）形成SDS卵白质复合物，并使复合物带负电
质粒方面：
在1％的SDS溶液中慢慢加入5N的NaCl，你会发明SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。
因此高浓度的盐招致了SDS的沉淀。
但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发明沉淀的量要多的多。
这其实是十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate）遇到钾离子后酿成了十二烷基硫酸钾（potassiumdodecylsulfate,PDS），而PDS是水不溶的，因此产生了沉淀。
如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的纳离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。
年夜家知道SDS专门喜欢和卵白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的年夜量沉淀自然就将绝年夜部分卵白质沉淀了，让人高兴的是年夜肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。
基因组DNA一旦产生断裂，只要是50－100kb年夜小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了
CTAB
CTAB：
十六烷基三甲基溴乙胺，高温时易沉淀
阳离子去污剂
一种在高盐下能和核酸结合形成可溶、稳定的复合物，低盐浓度下可沉淀的概略活性剂
是一种阳离子去污剂,低离子强度（0.10.5MNaCl），沉淀核酸与酸性多聚糖，而卵白质和中性多聚糖仍留在溶液中。
在高离子强度的溶液中（>0.7mol/LNaCl），CTAB与卵白质和多聚糖形成复合物，只是不克不及沉淀核酸。
通过有机溶剂抽提，去除卵白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸别离出来。
CTAB可从年夜量产生黏多糖的植物及某些革兰氏阴性菌制备纯化的DNA，这种去污剂加入调节至高离子强度的细菌和细胞裂解液中（＞0.7MNaCl），经过连续的酚/氯仿抽提，去除CTAB/黏多糖/卵白质复合体，异丙醇/无水乙醇沉淀上清即可将DNA别离出来
CTAB还有提高DNA互补链复性速率及稳定已形成的DNA双螺旋的作用
CTAB法的主要特点是用用较广
CTAB溶液在低于15度会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物资料时，必须预热，且离心温度不低于15度
EDTA
酶抑制剂，螯合二价金属，抑制金属依赖性的酶
螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制细胞中DNase的活性，该酶可降解DNA
EDTA是去垢剂，结合离子用，而它结合的部别离子是能够诱发或者增进RNA酶活性的，比方Ca2+。
EDTA是一种二价离子熬合剂,能熬合Mg2+和Ca2+等二价阳离子,而多种RNA酶的活性是需要依赖二价阳离子的,所以EDTA能通过熬合二价阳离子来抑制RNA酶的活性
碱性条件下才干够溶解，要和NaOH粉末混合后，再加水，然后用NaOH水溶液调节pH。
0.01M，DNase酶基本失活。
BSA
酶抑制剂，使一些降解酶的活性的概略变性
精胺或其他多胺
酶抑制剂，降低核酸酶的影响
氰化物
酶抑制剂，降低重金属氧化酶的影响
PVP
减少酚类、醌类、单宁类物质的影响，抗氧化作用，络合多酚和萜类物质，避免多酚类褐变而氧化，去除多糖和色素，色素是PCR强抑制剂，必须去除
样品液氮研磨及提取缓冲液中加入PVP或PVPP等能络合多酚和萜类物质，离心或氯仿抽提出去，有效避免多酚氧化成醌类，避免溶液变褐色而具有抗氧化能力
提取液中加入适量的PVP或PVPP能提高DNA的纯度，用量根据杂质而定（16%），PVP同时能去除多糖，因此将PVP和巯基乙醇配合使用并调整用量，能有效避免多酚污染
PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
Tritonx100
Triton X100之类的去垢剂有苯环结构，所以在280nm有很强的吸收。
卵白酶K
卵白酶K：
切割活性较广的丝氨酸卵白酶，切割脂族和芳香族氨基酸的羧基端肽键，将卵白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地别离出来。
卵白酶K在较广的pH规模内均有活性（pH412.5）温度规模3760度盐浓度3MGuHCl或4M尿素中均有活性在一些去污剂：
Tween20（5%）、TritonX100（1%）和SDS（1%）条件下也有活性。
卵白酶K消化裂解法适用于所有标本的消化处理，尤以DNA样品为佳.如组织细胞（包含石蜡包埋组织）绒毛、毛发、精斑、血液（血清、血浆、全血）局部排泄物、尿，粪便等.卵白酶K的一般工作浓度是50—100μg/ml
卵白酶（卵白酶K或链酶卵白酶）可以降解卵白质,灭活核酸酶（DNase和RNase）,DNase和RNase也用于去除不需要的核酸，有人使用卵白酶替代DEPC处理水的，但有些人说效果欠好。
卵白酶K，威力巨年夜的广谱卵白酶，95C加热10分钟，则完全失活。
数年前首次使用它替代DEPC处理RNA抽提用的离心管和枪头，效果不错；后来又用于处理RNaseFree的水，效果也是一级棒。
从此就再也不必DEPC了。
配制RNA裂解试剂时，直接用灭菌的双蒸水配制，最后，加入卵白酶K至终浓度1ug/ml。
轻轻混匀，室温放置15分钟后即可。
枪头及离心管去除RNase：
先将枪头及离心管清洗干净后，移入预先混好的含1ug/ml卵白酶K的双蒸水，完全浸入。
室温放置30分钟后，连水一起高压灭菌。
弃水后，烘干即可。
RNaseFree水的获得：
直接在灭菌的双蒸馏水中加入卵白酶K至终浓度1ug/ml。
轻轻混匀，室温放置15分钟后，灭菌处理即可。
该卵白质的残留对后续实验没有可见的影响。
无卵白质残留的RNaseFree水的获得：
这比较麻烦。
直接在灭菌的双蒸馏水中加入卵白酶K至终浓度1ug/ml。
轻轻混匀后，倒入专用的蒸馏器中。
放置15分钟后，加热蒸馏，流出的就是无卵白质残留的RNaseFree水。
要提醒的是，该专用蒸馏器头几次流出来的水，只能当普通蒸馏水用，因为通道中难确保RNaseFree的环境；另外，一定要主要密闭性，不然，流出的水又被污染了。
DNA裂解液的作用是破坏细胞膜、核膜，并使组织卵白与DNA别离，抑制细胞中Dnase的活性，而卵白酶k的作用是将卵白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地别离出来！
溶菌酶
溶壁酶
Dnase
Rnase
多糖水解酶：
水解多糖
饱和酚
酚是一种有机溶剂,预先要用STE缓冲液饱和,因未饱和的酚会吸收水相而带走一部分核酸。
酚也易氧化发黄,而氧化的酚可引起核酸链中磷酸二酯键断裂或使核酸链交联：
故在制备酚饱和液时要加入82羟基喹咛,以避免酚氧化。
苯酚
非极性分子水为极性分子
使卵白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。
用苯酚处理匀浆液时，由于卵白与DNA联结键已断，卵白分子概略又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。
卵白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。
使用酚的优点：
1.有效变性卵白质；2.抑制了DNase的降解作用。
能有效使卵白质变性而出去，酚形成的有机相破坏卵白质的胶体稳定性，从而卵白质不会散布在水相中，避免核酸污染
缺点：
1.能溶解1015%的水，从而溶解一部分poly（A）RNA。
2.不克不及完全抑制RNase的活性。
酚变性年夜，但与水相有一定水平的互溶，年夜约1015%的水溶在酚相中，使核酸损失
酚（Phenol）对卵白质的变性作用远年夜于氯仿，按事理应该用酚来最年夜水平将卵白质抽提失落，可是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比方4M的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，晦气于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，便利水相的回收；还有一点，酚与水有很年夜的互溶性，如果单独用酚抽提后会有年夜量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反响（比方限制性酶切反响），应此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少很多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反响不克不及正常进行。
至于异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也便利了水相的回收。
氯仿
非极性分子水为极性分子
去除脂肪,使更多卵白质变性,从而提高提取效率
克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。
最后用氯仿抽提：
去除核酸溶液中的迹量酚。
（酚易溶于氯仿中）
氯仿变性不如酚好，但与水不混溶，不会带走DNA
因此混合使用最佳，经酚第一次抽提的水相有残留的酚，由于酚和氯仿互溶，可用氯仿第二次带走酚，也可在第二次抽提中混合使用，比例为1：
1
苯酚/氯仿
苯酚、氯仿抽提去除卵白质
非极性分子水为极性分子，当卵白水溶液与他们混合时，卵白质分子见的水分子被挤去，使卵白失去水合状态而变性，经离心，变性卵白密度比对年夜，而与水相别离，苯酚/氯仿比重年夜，保存在最下层
苯酚氯仿使卵白质变性量要足够，因为苯酚去除卵白是有一定的饱和度的，超出饱和度，裂解体系中卵白质不克不及被一次性去除，必须屡次抽提。
离心后分三层，下层有机层中有一些脂溶性的杂质，中间层白色絮状沉淀是卵白，上清液中即含有核酸；变性后的卵白质从水相中析出，位于苯酚中或苯酚与水相之间。
异戊醇
抽提DNA，为混合均匀，容易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用，加入异戊醇降低分子概略张力，一般采取氯仿：
异戊醇=24：
1或酚：
氯仿：
异戊醇=25：
24：
1（不必先配置，临用前加入即可）
减少操纵过程中产生的气泡。
减少卵白质变性操纵过程中产生的气泡。
异戊醇可以降低概略张力，从而减少气泡产生。
另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性卵白相及下层有机溶剂相维持稳定。
NaCl
提供一个高盐环境，使DNA充分溶解于液相
沉淀DNA时总会加入高浓度的盐,加盐的目的是破坏能使卵白质坚持稳定的两个因素,使卵白和DNA别离并沉淀下来.而此时盐的阳离子会与DNA结合形成DNA阳离子盐溶于溶液中,再用无水乙醇可以将DNA阳离子盐沉淀下来
提取DNA时先加0.14mol/L氯化钠，因为在这种浓度的氯化钠溶液中，DNA的溶解度最低，而卵白质的溶解度增加，这样通过过滤能将DNA别离开，以除去卵白质。
再加入95%的酒精能使DNA沉淀，因为在这个浓度下DNA溶解度最低。
如果直接加酒精不先加氯化钠，DNA和卵白质都能被酒精所沉淀，就无法将DNA和卵白质别离开。
所以必须先加氯化钠后加酒精，顺序不克不及倒置。
DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。
这样可以是DNA沉淀出来在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也欠好。
在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反响，必须要进行洗涤或重沉淀。
柠檬酸钠
它可以控制反响体系的离子强度，同时还有一定的缓冲作用，包管体系PH的相对稳定状态，总之柠檬酸钠在这里的作用类似于食物中的防腐剂。
DEPC
焦碳酸二乙酯，它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使卵白质变性，从而抑制酶的活性。
与肝素何用效果增强。
在Tris中不稳定，很快会分化为二氧化碳和乙醇。
强烈但不完全的RNA酶抑制剂0.1%浓度
TrisHCl
缓冲体系，使pH变更不会太年夜
异丙醇
加入异丙醇之后立即呈现絮状沉淀，我一直以为这是正确的，看了帖子才知道是卵白质污染，
异丙醇的沉淀效果要比无水乙醇的沉淀效果要好，可是异丙醇沉淀有一个弊病就是会沉淀下来好多的盐和卵白质这样会影响下一步的操纵，一般我加异丙醇是等体积的效果还可以。
70%乙醇
70%乙醇洗涤DNA沉淀（因为在70%乙醇里DNA是不溶的,而盐离子却可溶）,用无水乙醇则达不到这个目的!
乙醇对卵白质、核酸的沉淀效应随分子量加年夜而增年夜，小分子的核酸和卵白质碎片是可以溶于75%乙醇的。
漂洗DNA，是为了去除残存的盐类，去除过量SDS和酚等杂物，因为SDS在70%的乙醇中坚持溶解状态，不与DNA共沉淀，从而通过弃上清液去除这种去污剂,避免对以后PCR反响的影响。
DEPC
（焦碳酸二乙酯）:
经常使用RNA酶抑制剂，与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使卵白质变性,强烈但不完全的RNA酶抑制剂
甲酰胺
用高浓度甲酰胺替代苯酚从细胞裂解物的卵白酶K消化物中别离抽提DNA，甲酰胺是一种离子化溶剂，能别离卵白质DNA复合物并使卵白变性和释放，因其不影响卵白酶K的活性，特别适于别离高分子质量的DNA，其别离物籍火棉胶袋的透析，去除变性卵白进而纯化DNA。
聚乙二醇PEG
有机聚合物，无毒，亲水性强，相对分子量620k，沉淀效果主要与其自己的浓度和分子量有关，同时受离子强度、溶液pH值和温度等因素的影响，采取该办法可将病毒浓缩10倍以上。
为一种非离子多聚物，多离子多聚物是六十年代成长起来的一类重要沉淀剂。
基于多聚物的沉淀作用主要依赖于多聚物的浓度和被沉淀物的分子量年夜小，Laurent等（1967）提出PEG的沉淀机理主要是通过空间位置排斥，使液体中的微粒（包含生物年夜分子、病毒和细菌等）自愿集聚在—起而引起沉淀的产生。
PEG最早应用于提纯免疫球卵白（IgG）和沉淀一些细菌病毒，今年来逐渐应用于核酸和酶的别离纯化，特别是用PEG别离质粒DNA，已相当普遍。
用PEG8000取代乙醇沉淀DNA，可以在500ulDNA液中加入200ul20％PEG8000（含1．2mol／LNaCl），冰浴20min（Lieta1．，1994）。
该操纵的优点在于：
操纵条件温和，不容易引起生物年夜分子的变性。
同时具有极高的沉淀效能，少量的PEG可以沉淀相当多的生物年夜分子。
乙基黄原酸钾
乙基黄原酸钾能够与多糖结合，形成可溶性复合物，使细胞壁破裂，释放出核酸。
此复合物在铵离子存在的情况下可转变成水不溶性，并可通过简单的离心除去，不需要苯酚或氯仿抽提。
另外，乙基黄原酸钾能够结合金属离子，抑制DNase的活性。
Tillett等（2000）利用该办法从蓝细菌、微生物、环境样品中提取到高质量的核酸，DNA可以用于酶切、克隆、PCR，RNA可以用于RTPCR，Southern杂交等反响，并且样品中不含核酸酶，温育16h没有产生降解。
时间：
2021.02.11
创作：
欧阳计
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