分子实验学报告重组质粒的酶切鉴定及PCR实验.docx
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分子实验学报告重组质粒的酶切鉴定及PCR实验
第三次分子生物学实验报告
重组质粒的酶切鉴定及PCR实验
一、实验目的
1、通过酶切鉴定重组质粒的插入片段的大小；
2、学习并掌握PCR技术的原理和基本操作。
二、实验原理
1、重组质粒酶切鉴定
将含有外源DNA的转化子的E.coliDH5α菌株进行培养，并用试剂盒提取其质粒DNA，将所提取的DNA用切pUC19质粒的同一种限制性内切酶进行切割以验证所插入的外源DNA的大小。
2、PCR原理
PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶链式反应是1986年由KallisMullis发现。
这项技术已广泛地应用于分子生物学各个领域，它不仅可用于基因分离克隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析等方面。
本次实验旨在通过学习和掌握PCR反应的基本原理和实验技术，以验证重组质粒插入片段大小。
（1）聚合酶链式反应原理
CR是一种利用两种与相反链杂交并附着于靶DNA两侧的寡核苷酸引物，经酶促合成特异的DNA片段的体外方法。
反应过程由高温变性，低温退火和适温延伸等几步反应组成一个循环，然后反复进行，使目的的DNA得以迅速扩增。
置待扩增DNA于高温下解链成为单链DNA模板，人工合成的两个寡核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合，DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物3'端开始掺入，沿模板5'—3'方向延伸，合成DNA新链。
由于每一循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，所以PCR产物以指数方式增加，经25—30次周期之后，理论上可增加109倍，实际上可增加107倍。
PCR技术具有操作简便、省时、灵敏度高特异性强和对原始材料质量要求低等优点，但由于所用的TaqDNA聚合酶缺乏5'—3'核酶外切酶活性，不能纠正反应中发生的错误核苷酸掺入，估计每9000个核苷酸会导致一个掺入错误，但是错误掺入的碱基有终止链延伸的作用倾向，使得错误不会扩大。
（2）PCR的反应动力学
PCR技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性：
模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
②模板DNA与引物的退火（复性）：
模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
③引物的延伸：
DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
到达平台期（Plateau）所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。
反应最终的DNA扩增量可用Y＝（1＋X）n计算。
Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平（Y）均每次的扩增效率，n代表循环次数。
平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。
反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竞争等因素。
大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。
（3）PCR扩增产物
PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。
短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。
短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3’端开始延伸，其5’端是固定的，3’端则没有固定的止点，长短不一，这就是长产物片段。
进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链（即长产物片段）结合。
引物在与新链结合时，由于新链模板的5’端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的短产物片段。
短产物片段是按指数倍数增加，而长产物片段则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计。
这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。
3、PCR反应的要素
在PCR反应体系中主要存在5类物质，即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。
（1）引物
引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：
（a）引物长度：
引物长度根据统计学计算，长约17个碱基的寡核苷酸序列在基因组中可能出现的机率的为1次。
因此，引物长度一般最低不少于16个核苷酸，而最高不超过30个核苷酸。
典型的引物18到24个核苷长。
引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。
但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。
较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
（b）引物扩增跨度：
以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
（c）引物碱基：
（G+C）含量以40-60%为宜，（G+C）太少扩增效果不佳，（G+C）过多易出现非特异条带。
A、T、G、C最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
（d）避免引物内部出现二级结构，尤其是发夹结构。
两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端，即使无法避免，其3’端互补碱基也不应大于2个碱基，否则易生成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
（e）引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
（f）引物中有或能加上合适的酶切位点。
被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
（g）引物的特异性：
引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：
每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
本次实验所使用的上下游引物M13F、M13R分别与puc19多克隆位点两端的24bp长度的序列配对。
pUC19载体上两引物之间的长度为150bp，因此目的扩增的片段长度=（多克隆位点插入片段长度+150bp）。
上下游引物的Tm值分别为64.7℃和57.9℃，相差达到6.7℃，基本符合引物设计要求。
（2）聚合酶及其浓度
TaqDNA聚合酶是从栖热水生菌中提纯的天然酶或是大肠菌合成的基因工程酶[3]。
本次实验催化PCR反应的酶量为0.05U/μL，如果聚合酶的浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
（3）dNTP的质量与浓度
dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L（本次实验为200μmol/L）。
4种dNTP的浓度应相等，如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。
如果4种dNTP浓度过低会降低PCR产物的产量，而dNTP浓度过高则会与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
（4）模板
模板的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，提取的核酸可直接作为模板用于PCR反应。
模板的量应适中（本实验为0.4ng/μL），。
如果模板的量过低会降低PCR产物的产量，而模板的量过高则会与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
另外，模板纯化程度过低会产生非目的扩增产物。
（5）Mg2+
Mg2+浓度对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在PCR反应中，Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
4、PCR反应条件的选择
PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
（1）温度与时间设置
基于PCR原理三步骤而设置变性、退火、延伸三个温度点。
在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物沿模板延伸。
对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸。
（a）变性温度与时间：
变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。
一般情况下，93～94℃1min足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。
此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。
（b）退火温度与时间：
退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。
变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。
由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。
退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。
对于20个核苷酸，（G+C）含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。
引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
Tm值（解链温度）=4（G+C）＋2（A+T）
复性温度=Tm值-（5～10℃）
在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。
复性时间一般为30～60s，足以使引物与模板之间完全结合。
（c）延伸温度与时间：
TaqDNA聚合酶的生物学活性：
70～80℃150bp/s•酶分子；
70℃60bp/s•酶分子；
55℃24bp/s•酶分子。
高于90℃时，DNA合成几乎不能进行。
PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。
3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。
延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。
对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
（2）循环次数
循环次数决定PCR扩增程度，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。
一般的循环次数选在20～40次之间，循环次数越多，模板、引物特异性下降，聚合酶的活性也会降低。
因而非特异性产物的量随之增多。
三、实验器具与试剂
PRC扩增仪，琼脂糖凝胶电泳设备，移液器，0.2ml薄壁PCR管，凝胶成像仪，模板pUC19重组质粒（插入片段125bp和564bp），寡核苷酸引物（上游引物M13F，下游引物M13R），TaqDNA聚合酶（TaKaRa，-20℃贮存），dNTPs（TaKaRa，-20℃贮存），10×PCR反应缓冲液（TaKaRa，-20℃贮存）。
高速离心机，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，量筒，移液枪，冰盒，枪尖，Eppendorf管，微量移液器，手套，记号笔，TAE电泳缓冲液（10×），琼脂糖，溴化乙锭（EB），DNA相对分子质量标准物DNAMarkerk／HindⅢ，DL5000。
四、实验步骤
1、重组质粒的酶切、电泳检测
（1）酶切
大片段的重组质粒采用10μl体系：
成分
体积（μl）
ddH2O
6.2
10×Buffer（含Mg2+）
1.0
Re-Puc19
2.0
HindⅢ（15U/μl）
0.8
共计
10.0
表格110ul酶切体系
若插入片段比较小，则选用20μl体系：
成分
体积（μl）
ddH2O
4.5
10×Buffer（含Mg2+）
1.5
Re-Puc19
8.0
HindⅢ（15U/μl）
1.0
共计
15.0
表格215ul酶切体系
轻弹混匀后，短暂离心，于37℃孵育2hr后，保存于-20℃，备电泳检测。
（2）酶切产物电泳检测
取得到的酶切产物，加入2ul10×LoadingBuffer，混匀后点样；
取2ul酶切前重组质粒于新的Ep管中，加入2ddH2O，加入1ul10×LoadingBuffer，混匀取5μl后点样；
其中，小体系产物用1%的凝胶，大体系用1.5%的凝胶；
以10ulλDNA/HindIII和100ngDL2000为Marker；
100V恒压电泳约50min；
电泳结束EB染色10min；
水洗后紫外灯下拍照，观察并分析实验结果。
2、重组质粒的PCR验证/PCR扩增目的基因
对于电泳显示插入片段在2.0kb以下的重组质粒，采用PCR进行验证。
引物此次重组用到的载体是pUC19，限制性内切酶为HindⅢ，所以选择HindⅢ酶切位点两侧一定距离的序列制作引物。
由于载体pUC19上两引物间序列的长度是150bp，所以PCR扩增产物的长度（bp）=150+插入片段的长度。
下图所示为pUC19部分序列，即引物来源：
M13F（-47）:
EcoRⅠ
cgccagggttttcccagtcacgacgttgTaaaacgacggccagtgaattcgagctcggtacccggggatcctctagagtcgacctgcaggcatgcaagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctc
HindⅢM13R（-48）（互补链）
PCR引物为
引物名称
引物序列5’3’
引物长度（mers）
Tm（℃）
M13F（-47）
CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC
24
64.7
M13R（-48）
GAGCGGATAACAATTTCACACAGG
24
57.9
表格3PCR引物设计
（1）反应体系的建立
PCR反应体系如下：
编号
组分
体积（ul）
1
ddH2O
13.6
2
10×Buffer（含Mg2+）
2.0
3
dNTP（2.5mMeach）
1.6
4
M13F（10μM）
0.8
5
M13R（10μM）
0.8
6
模板（约10ng/μl）
1.0
7
Taq酶（5u/μl）
0.2
总体积
20.0
表格4PCR反应体系
（2）反应程序的设定
将加好样的PCR管进行标记，放入PCR仪中，设定反应基本参数如表所示。
编号
项目
温度/℃
时间
1
预变性
94
3min
2
变性
94
30s
3
复性
58
30s
4
延伸
72
60s
5
终延伸
72
10min
6
保存
4
2hr
表格5PCR温度设定表
预变性：
让DNA双链充分解离,然后第一次退火过程时候引物可以尽量多的结合到模版上面这主要是为了保险起见，使模板DNA的二级结构充分打开。
变性：
通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA。
复性：
当温度突然降低时由于模板分子结构较引物要复杂的多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少。
延伸：
在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷三磷酸底物及镁离子存在的条件下，5＇-→3＇的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。
终延伸：
循环完成后使PCR反应完全以提高扩增产量，在用普通Taq酶进行PCR扩增时在产物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的进行。
（3）PCR产物检测：
1%的琼脂糖凝胶电泳：
20ulPCR产物中加3.0ul10×上样缓冲液，混合均匀，取5ul点样。
以DL2000plus、λ/HIII为Marker；
100V恒压电泳约40min；
电泳结束EB染色10min；
水洗后紫外灯下拍照，观察并分析实验结果。
五、实验结果与分析
1、重组质粒的酶切电泳结果
将重组质粒酶切之后进行凝胶电泳，结果如图1、图2所示。
泳道
1
2
3
4
5
6
…
大体系
样品
λ/HIII
pUC19/HIII
rp1-1
rp1-1/HIII
rp1-2
rp1-2/HIII
DL2000
λ/HIII
样量（μl）
10
100ng
5.0
全部
5.0
全部
100ng
10
作用
M/对照
对照
对照
Marker
M/对照
表格6电泳各泳道上样样品顺序
123456789101112131415161718192021222324
图1组重组质粒小体系酶切凝胶电泳成像图
123456789101112131415161718
图2组重组质粒大体系酶切凝胶电泳成像图
两个电泳的上样顺序是相同，第1泳道都是λ/HIII产物，第2泳道是pUC19/HIII产物，之后是各组重组质粒和酶切后的产物。
我们组的样品在图1的第21、22泳道和图2的第3、4泳道。
在图1中，第22泳道大致可以分为三条带，和第21泳道中相近的条带是没有切开的重组质粒，比较淡；和23泳道里条带相近的是切成线性的载体，比较亮；最远的一条带和第24泳道里的2.3Kbp条带相近，说明插入片段为λDNA中的2322bp的DNA片段，这与实验前根据重组质粒电泳结果进行的粗略估计一致。
但本次酶切效果并不是很好，载体片段、插入片段的条带都比较宽而连成一片。
在图2中，第4泳道明显分出三条清晰的条带，和第2泳道中条带相近的条带是切开的载体片段，很亮；和第3泳道中条带相近是没有切开的重组质粒，非常暗，说明酶切效果比较理想。
而第4泳道中比较远的条带，可以看出比第1泳道（或第18）中564bp的条带小很多，不可能是546bp的片段，对比17泳道里的DL2000也可知它的大小介于100bp到250bp之间，推测是125bp的小片段，这与重组质粒电泳结果的估测一致，由于125bp的条带太小，条带都很暗。
另外，第18泳道相同的位置存在隐约可见的条带。
2、重组质粒的PCR验证结果
琼脂糖电泳后的克隆片段结果如图5。
12345678910111213141516
图5重组质粒PCR验证结果电泳图
加样顺序如下：
泳道
1
2
…
4
5
6
…
15
16
样品
DL2000
II-8
II-10
λ/HIII
III-1
III-10
DL2000plus
表格7PCR产物加样顺序
图5中，第6、7泳道是本组的样品。
第6泳道中，PCR产物比DL2000中250bp的条带略大，减去引物间载体序列150bp，插入片段大小是一个比100bp略大的数值，验证了酶切检验中得出的125bp的结论。
在第7泳道中，PCR产物比DL2000、λ/HIII中的2kbp条带均大，与λ/HIII中2.3Kbp的条带大小相近，验证酶切检验中得出的结论。
引物间载体序列150b相比2.3kp比较小，在电泳图上导致的差异不明显。
两泳道条带清晰明亮，说明PCR产物纯度高且量大，达到目的。
六、思考与讨论
分子实验课结束了，谈一下自己的感受吧。
做分子实验的时候一定要做到“心中有数”“胸有成竹”，比如凝胶电泳前就要估计要分离的DNA片段的大小，这样才能正确选用凝胶浓度和marker；比如在配反应体系时，一定要对自己手中现有的菌液的浓度有大体的估算值；比如电泳时要明确电泳的目的，这样才能合理选用电压和时间，达到最高的效率和最好的效果；另外，文档有备份是好习惯，保留个阶段的产物备份也是好习惯，规范命名也是在任何地方适用的好习惯。
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