组培实验报告胡萝卜愈伤组织诱导培育.docx
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组培实验报告胡萝卜愈伤组织诱导培育
本科学生综合性实验报告
学号姓名
学院专业、班级
实验课程名称植物组织培育实验
教师及职称
开课学期2021至2021学年第二学期
填报时刻2021年06月20日
云南师范大学教务处编印
一、实验设计方案
实验名称：
胡萝卜愈伤组织的诱导培养
实验时间：
实验室：
1．实验目的
（1）通过本次实验，使学生进一步熟悉配制培养基的流程及操作中应注意的事项，学会设计和筛选胡萝卜愈伤组织诱导培养基配方。
（2）能熟练准确配制MS培养基母液和组培室常用的化学试剂，巩固相关理论基础知识。
（3）能够熟练掌握外植体的表面消毒技术和无菌操作技术。
（4）进一步熟悉配制培养基的步骤，能熟练准确配制培养基；掌握愈伤组织状态的调控手段，设计适合的使愈伤组织增殖快、结构疏松的增殖培养基，以便能培养出下次细胞培养的材料。
（5）熟练掌握愈伤组织继代培养的基本操作技术，进一步熟悉、规范无菌操作技术。
2．实验原理、实验流程或装置示意图
实验原理：
①胡萝卜愈伤组织的诱导培养：
培养基是植物离体培养组织和细胞赖以生存的营养基质。
配制培养基时，为了减少试剂称取时的工作量和少量称取时出现的误差，以及避免多种营养成分混合导致沉淀产生或相互反应而失去培养效果，预先要将各种营养成分配制为一定倍数的培养基母液，待使用时稀释到要求的浓度。
母液的浓度为培养基浓度的10倍、20倍、50倍、100倍等或更高。
②胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配制：
将事先配制好的培养基母液按一定比例稀释至浓度为培养基中规定的使用浓度，再加入琼脂、蔗糖、生长调节物质等，制备成符合要求的培养基。
③胡萝卜愈伤组织的诱导：
将胡萝卜的贮藏根（根的变态）表面消毒后切割成小块在无菌条件下接种于愈伤组织诱导培养基上，诱导外植体脱分化产生愈伤组织。
④胡萝卜愈伤组织增殖培养基的配制：
将事先配制好的培养基母液按一定比例稀释至浓度为培养基中规定的使用浓度，再加入琼脂、蔗糖、生长调节物质等，制备成符合要求的培养基。
⑤胡萝卜愈伤组织的继代培养：
将由胡萝卜肉质直根诱导产生的愈伤组织剥离转接到愈伤组织增殖培养基上培养，即可实现愈伤组织的增殖。
实验流程：
2-1MS培养基母液和常用试剂的配制
2-2胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配制
2-3胡萝卜愈伤组织的诱导
2-4胡萝卜愈伤组织继代培养基的配制
2-5胡萝卜愈伤组织的继代培养
3．实验设备及材料
（1）、MS培养基母液和常用试剂的配制：
冰箱、普通天平、分析天平、各种型号的试剂瓶（棕色和白色）、移液管、量筒、烧杯、容量瓶、搪瓷杯、药勺、称量纸、玻棒、标签纸、pH试纸（~），电磁炉、电热恒温干燥箱、硝酸铵、硝酸钾、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、碘化钾、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、乙二胺四乙酸二钠、硫酸亚铁、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆素、烟酸、肌醇、2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）、NAA（α-萘乙酸）、6-BA（6-苄基腺嘌呤）、KT、浓盐酸、氢氧化钠、浓硫酸、重铬酸钾、95%酒精、蒸馏水等。
（2）、胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配制：
冰箱、普通天平、三角瓶、移液管、量筒、烧杯、玻璃棒、医用口杯、精密pH试纸（~）、药勺、称量纸、封口膜、橡皮筋/棉线、电炉/电磁炉、高压蒸汽灭菌锅、MS培养基母液（大量元素、微量元素、铁盐、有机物）、琼脂、蔗糖、生长调节物质（2,4-D、6-BA、KT）、蒸馏水、1mol·L-1HCl、1mol·L-1NaOH。
（3）、胡萝卜愈伤组织的诱导：
酒精棉球、小块纱布、已灭菌滤纸、枪状镊子、解剖刀、已灭菌培养皿、酒精灯、
超净工作台、恒温培养箱、胡萝卜愈伤组织诱导培养基、无菌水、75％酒精、%HgCl2、胡萝卜肉质直根
（4）、胡萝卜愈伤组织增殖培养基的配制：
冰箱、普通天平、三角瓶、移液管、量筒、烧杯、玻璃棒、医用口杯、精密pH试纸（~）、药勺、称量纸、封口膜、橡皮筋/棉线、电炉/电磁炉、高压蒸汽灭菌锅、MS培养基母液、琼脂、蔗糖、生长调节物质、蒸馏水、1mol·L-1HCl、1mol·L-1NaOH
（5）、胡萝卜愈伤组织的继代培养：
酒精棉球、小块纱布、已灭菌培养皿和滤纸、枪状镊子、解剖刀、酒精灯、超净工作台、愈伤组织继代培养基、75％酒精、处于脱分化进程中的外植体
4．实验方法步骤
（1）、MS培养基母液和常用试剂的配制
培养基母液的配制：
母液的配制有两种方法：
一种是配制成单一化合物母液。
此法适合配制多种培养基都需要的同一种母液。
另一种是配成几种不同化合物的混合母液。
此法在大量配制同种培养基时省时省力。
由于MS培养基较为常用，故配制MS培养基母液。
配好的母液应放在试剂瓶中贮存。
在配制MS培养基母液时，为减少工作量可以把几种药品（如培养基中的大量元素或微量元素）配在同一母液中，但应注意各种化合物的组合以及加入的先后顺序，以免发生沉淀。
通常把每种试剂单独溶解后再与别的也已完全溶解的药品混合，或者待前一种化合物完全溶解后再加入后一种化合物。
混合已溶解的各种矿质盐时还应注意先后顺序，力求把Ca2+与SO42-和PO43-错开，以免形成硫酸钙或磷酸钙的不溶物。
同时，要慢慢地混合，边混合边搅拌。
大量元素母液的配制
MS培养基中的9种大量元素除C、H、O外，剩下的六种可由KNO3、NH4NO3、CaCl2•2H20、MgSO4•7H2O、KH2PO4几种无机盐来供应，它们可配在同一母液中（具体配制见下表）。
配制的步骤为：
确定母液的浓度和体积→计算各种化合物用量→称量→分别溶解→混合→定容→装瓶→贴标签→放入冰箱保存
母液
种类
成分
规定用量
/mg•L-1
浓缩
倍
数
称取量/mg
母液定容体积/ml
配1LMS培养基吸取取量/ml
大量元素
KNO3
1900
20
38000
1000
50
NH4NO3
1650
33000
CaCl2•2H20
440
8800
MgSO4•7H2O
370
7400
KH2PO4
170
3400
微量元素母液的配制
MS培养基中的微量元素可由MnSO4•4H2O、ZnSO4•7H2O、H3BO3、KI、Na2MoO4•2H2O、CuSO4•5H2O、CoCl2•6H2O几种无机盐来供应，它们也可配在同一母液中（具体配制见下表）。
配制步骤同大量元素（混合时不要求先后顺序）
母液
种类
成分
规定用量
/mg•L-1
浓缩
倍
数
称取
量/mg
母液定容体积/ml
配1L培养基吸取量/ml
微量元素
MnSO4•H2O
200
3380
1000
5
ZnSO4•7H2O
1720
H3BO3
1240
KI
166
Na2MoO4•2H2O
50
CuSO4•5H2O
5
CoCl2•6H2O
5
有机成分母液的配制
MS培养基中所需的维生素和氨基酸等有机成分母液应分别单独配制（具体配制见下表）。
配制的步骤为：
确定母液的浓度和体积→计算各种化合物用量→称量→溶解→定容→装瓶→贴标签→放入冰箱保存
母液
种类
成分
规定用量
/mg•L-1
浓缩
倍
数
称
取
量
/mg
母液定容体积/ml
配1LMS培养基吸取量/ml
有
机
成
分
甘氨酸
200
100
250
5
盐酸硫胺素
5
盐酸吡哆素
25
烟酸
25
肌醇
100
5000
铁盐母液的配制
铁盐母液宜单独配制，其配制步骤为：
确定母液的浓度和体积→计算各种化合物用量→称量→分别溶解→混合→煮沸数分钟→调节pH值至→定容→装瓶（棕色）→贴标签→放入冰箱保存。
用时每配lL培养基取该溶液5ml
母液
种类
成分
规定用量
/mg•L-1
浓缩
倍
数
称
取
量
/mg
母液定容体积/ml
配1LMS培养基吸取量/ml
铁盐
Na2EDTA•2H2O
200
3730
500
5
FeSO4•7H2O
2780
植物生长调节物质母液的配制
对于植物生长调节物质，配制成母液时，通常用mg·ml-1或ppm较为方便，一般配制成·ml-1的母液，这样的浓度便于计算也可避免冷藏时形成结晶。
2,4-D/NAA用少量95％酒精溶解，再加水定容；6-BA/KT应先溶于少量1mol·L-1的HCl中，再加水定容。
具体配制见下表：
母液
种类
成分
称取量
（mg）
母液定容体积（ml）
母液浓度（mg/ml）
生长素
2,4-D
50
100
NAA
50
100
细胞分裂素
6-BA
10
100
KT
10
100
其它常用试剂的配制
盐酸（lmol·L-1）：
用浓度%、密度cm3的浓盐酸配制
氢氧化钠（lmol·L-1）：
用固体氢氧化钠配制
75%酒精（v/v）：
用95%的酒精来配制
稀铬酸洗涤液：
重铬酸钾50g溶于1000ml蒸馏水中，冷却后缓慢加入工业用硫酸90ml。
（2）、胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配制
药品及用具的准备
培养基的配制步骤
①各种成分的计量：
根据配制培养基的体积、配方和母液浓度计算各种成分的用量。
②称量琼脂，加入适量的蒸馏水占总体积的（60%-70%），加热溶解。
③吸取规定用量的母液于干净烧杯中。
④称量规定用量的蔗糖。
⑤混合各种成分。
⑥加蒸馏水定容至所需体积。
⑦调节培养基的酸碱性至。
⑧培养基的分装。
⑨培养基的灭菌。
⑩无菌蒸馏水和接种工具准备。
（3）、胡萝卜愈伤组织的诱导
准备工作
①外植体表面灭菌前的准备工作
a接种室的清洁和消毒；
b超净工作台的开机和消毒；
c消毒溶液、无菌水、装材料的容器、解剖刀、镊子、培养皿、计时器、待用培养基等的准备。
②实验材料的准备
a准备新鲜健康的胡萝卜肉质直根作实验材料；
b实验材料的修整、刷洗、冲洗；
c用洗衣粉水或肥皂水浸洗后再用自来水冲净。
植物材料的表面灭菌和接种
①操作人员洗手消毒
②装材料的容器及玻璃棒用酒精表面消毒
③将待消毒的材料浸入75％的酒精中10秒，取出用无菌水冲洗干净。
④倒入消毒剂（%HgCl2）并计时
⑤到预定时间（20分钟）后倒出消毒液并用无菌水清洗干净。
⑥将材料切块后接种到诱导培养基上。
（4）、胡萝卜愈伤组织继代培养基的配制
培养基配方设计：
（1）根据培养的目的选择一种培养基为基本培养基。
（2）确定培养基中各种激素的浓度及相对比例
配方：
MS基本培养基＋L2,4-DLNAA＋L6-BA＋200mg/L水解酪蛋白＋％琼脂＋3％蔗糖
配制体积：
每小组配制，用50ml三角瓶分装成20瓶，每人5瓶。
药品及用具的准备
培养基配制
调节培养基的酸碱性至
培养基的分装
培养基的灭菌
（5）、胡萝卜愈伤组织的继代培养
准备工作
①接种室的清洁和消毒
②超净工作台的开机和消毒
③解剖刀、镊子、已灭菌培养皿和滤纸、待用培养基等的准备
④实验材料的准备（选择装有无污染的已分化出愈伤组织的外植体的三角瓶摆放于净工作台上）
愈伤组织继代培养
将上次接种在愈伤组织诱导培养基中的无污染的外植体上产生的生长状态良好、色泽新鲜未褐化的愈伤组织剥离转接到愈伤组织继代培养基上，放置在25℃全黑暗条件下进行愈伤组织的增值培养，以获得足够的愈伤组织，作为后续实验的实验材料。
5．实验数据处理方法
胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配制:
培养基配方设计：
（1）根据培养的目的选择一种培养基为基本培养基。
（2）确定培养基中各种激素的浓度及相对比例
配方：
MS基本培养基＋1mg/L2,4-D＋L6-BA＋LKT＋％琼脂＋3％蔗糖
配制体积：
每小组配制，每人用50ml三角瓶分装5瓶，每瓶约装25ml培养基。
胡萝卜愈伤组织继代培养基的配制:
培养基配方设计：
（1）根据培养的目的选择一种培养基为基本培养基。
（2）确定培养基中各种激素的浓度及相对比例
配方：
MS基本培养基＋L2,4-DLNAA＋L6-BA＋200mg/L水解酪蛋白＋％琼脂＋3％蔗糖
配制体积：
每小组配制，用50ml三角瓶分装成20瓶，每人5瓶。
计算胡萝卜愈伤组织的发生率
6．注意事项
（1）MS培养基母液和常用试剂的配制
1 玻璃器皿的洗涤
2 天平的使用
3 配制大量元素母液时溶液的混合顺序
4 铁盐的配制
5 洗液的配制
6 生长调节物质的配制
（2）胡萝卜愈伤组织诱导培养基、继代培养基的配制
1 母液使用前的检查
2 计量、称量、量取准确
3 量取各母液的移液管单独使用，不混用
4 加热溶解过程中液体不能外溢
5 pH值的调节问题
6 分装问题
7 封口
8 灭菌问题：
高压蒸汽灭菌锅的使用、灭菌时间、灭菌温度
（4）胡萝卜愈伤组织的诱导、继代培养
1 材料的表面消毒
2 材料消毒的时间长短
3 接种材料时无菌操作
7．参考文献.
[1]李浚明、朱登云.植物组织培养教程[M].第三版.北京:
2005
二、实验报告
1．实验现象与结果
（1）、MS培养基母液和常用试剂的配制
我们组配制的是“有机成分”，正确配制了MS培养基母液。
（2）、胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配制
正确配制出了愈伤组织诱导培养基
（3）、胡萝卜愈伤组织的诱导
总接种瓶数
5
总接种块数
20
污染瓶数
3
污染块数
8
未污染瓶数
2
未污染块数
12
未污染块中愈伤
组织发生块数
12
愈伤组织发生率
60%
愈伤组织发生
情况记录
长了愈伤组织的胡萝卜块大部分长势良好，有一瓶中的愈伤组织长势一般，萝卜块较扁平。
污染情况及
原因分析
五瓶中污染了三瓶，都是细菌污染，有一瓶污染较严重，整个瓶子呈棕黄色，上面长了黄色原点菌落。
这个是因为在接种期间最后用薄膜封口时，因为瓶口温度太高，将薄膜烫破了，我另外找了其他未消过毒的薄膜封口，导致污染。
其他两瓶情况较轻，有一瓶只污染了一块胡萝卜。
估计是自己在接种过程中操作不当，镊子碰到瓶口导致材料污染了。
愈伤组织诱导结果图片：
（4）胡萝卜愈伤组织继代培养基的配制
按照步骤，正确配制出继代培养基
（5）胡萝卜愈伤组织的继代培养
胡萝卜愈伤组织继代培养结果图片：
增值培养基上长出的愈伤组织：
继代培养基上长出的愈伤组织图片：
2．对实验现象、实验结果的分析及其结论
在第一次实验，配制MS培养基的母液时，我们组配制的是“有机成分”的部分，在配制的过程中，由于PH的调节不到位，没有准确的调至，导致最后培养基在灭菌后没有凝固，所以又重新做了一次。
第二次进行培养愈伤组织诱导培养基的实验，我们吸取了第一次的经验，很认真的按照要求配制，所以一次性配制好所需培养基。
第三次是进行胡萝卜愈伤组织的诱导，从最后的结果来看自己做的不太好，污染了三瓶，其中有一瓶是自己在封口时将瓶口的温度加热的过高，将封口膜烫破，导致最后只能用其他未消毒的封口膜代替，所以污染严重。
其他两瓶，可能是在接种过程中，对已消毒的镊子和解剖刀操作不当，导致材料被污染。
第四次继代培养基的配制还算顺利。
最后将愈伤组织继代后的结果还算好，四瓶都没有被污染，但是由于自己的材料继代后培养的时间不长，所以长势一般。
从上面的图片中可以明显看出6-1即增值培养基中继代的较好，愈伤组织很疏松。
在6-2即继代培养基中的愈伤组织呈现很紧实的状态，颜色较深。
3．实验总结
这次试验是第一次接触组培实验，所以很多方面像仪器的清洗、培养基配制过程中要注意的各种问题（PH的调节、琼脂加热、分装、高压灭菌等）、在接种过程中无菌操作的问题等自己都不太熟练，因此产生了很多问题。
在这几次试验过程中也在慢慢的改进，学到了很到实际性的实验操作技巧，同时对于培养基的配制，以及培养基的一些属性也有了一定的了解。
通过这一系列的诱导胡萝卜愈伤组织的实验，也清楚了由植物的外植体具体是如何诱导脱分化成为愈伤组织，经过继代，可以培养出大量愈伤组织，成为下一步再分化等培养的材料。
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