玉米耐低钾基因型筛选体系的建立 24000.docx

玉米耐低钾基因型筛选体系的建立 24000.docx

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玉米耐低钾基因型筛选体系的建立24000

研研究生学位论文题目

作

者姓名

吉林大学

分类号：

单位代码：

10183

研究生学号：

200XXXXXXX密级：

（以上为宋体加粗小四号字）

吉林大学

硕士学位论文

玉米耐低钾基因型筛选体系的建立

Maizeresistanttolowpotassiumgenotypescreeningsystem

作者姓名：

专业：

研究方向：

指导教师：

培养单位：

年月

硕士学位论文扉页书写格式

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玉米耐低钾基因型筛选体系的建立

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Maizeresistanttolowpotassiumgenotypescreeningsystem

作者姓名：

专业名称：

指导教师：

学位类别：

答辩日期：

年月日

未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行、出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此限）。

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吉林大学博士（或硕士）学位论文原创性声明

本人郑重声明：

所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。

除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。

对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。

本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。

学位论文作者签名：

日期：

年月日

摘要

我国是农业大国，为了更好的解决粮食作物问题，需要弥补农作物吸收钾肥不足的问题。

虽然我国耕地中的土壤含钾量较高，但真正能够被植物吸收的比例却很少，尤其是随着农作物产量的提高，土壤中的钾含量会逐步减少，进而使土壤缺钾的情况越发严重。

为了更好的解决这一问题，传统的办法会通过对土壤施加更多的氮肥来提高土壤中钾元素含量。

我国虽然是农业大国但钾肥资源不足，农业所用的钾肥需要大量从国外进口，但随着进口钾肥价格上涨，增加了我国使用进口钾肥的压力，所以如果按照传统施用钾肥的方式来进行农作，不仅增加了巨大的成本开支，而且对环境势必会造成一定影响，这样既不经济也不环保的做法不能满足时代的需要。

为了解决我国钾肥紧张的问题，农业部经过了不懈的努力研究出从基因角度改变农作物的遗传性质问题，利用科学、合理的方法筛选优秀玉米品种，从而使玉米在低钾的土壤中也能够很好的生长，这种对农作物改良的新型培育方法对粮食产量具有重要的意义。

本实验利用水培实验建立一个科学、简单、方便、高效的玉米筛选低钾基因的办法，将筛选出的耐低钾基因的玉米基因和对钾基因敏感的基因以及低钾胁迫下吸钾量和吸钾指数的测定和低钾胁迫下玉米生育时期的确定进行研究，分析玉米耐钾基因的生理机制，从而为遗传提供必要的参考依据。

利用RT-PCR克隆技术，克隆了玉米ZmHAK1基因，并且采用Gateway克隆技术构建植物筛选的载体，从而为后续的玉米基因研究和培育耐钾玉米品种做铺垫，具体的研究成果如下。

1.钾吸收相关基因的研究

提高农作物对土壤钾离子运输的水平和利用钾离子通道等多种途径可以实现对农作物钾基因的营养改良。

本实验使用RT-PCR克隆技术和Gateway系统构建植物表达载体，以此为提高玉米吸收钾量奠定基础。

本实验从玉米中克隆了四个钾离子运输基因。

通过TD-PCR技术克隆了玉米的基因脱氧核糖核酸序列，其中进行编码的蛋白质包括781个氨基酸，预测有13个跨膜结构域。

ZmHAKl是钾离子运输基因的一种，对植物对钾的吸收有积极的作用。

通过系统的分析ZmHAKl得出其与HvHAKl具有较近的亲缘关系，预示其具有相似的特征，在使用半定量PCR对ZmHAKl基因进行表达时，得出结果ZmHAKl基因能够表达组织特性，在其根部表达，并且受到低钾胁迫的表达。

2.玉米耐低钾基因筛选研究

通过对低钾土壤的水培实验研究分析，得出如下的结果：

对玉米的幼苗期进行进行水培实验中筛选出耐低钾基因的最佳生育期是六叶期，此时钾浓度为0.1mmol/L，筛选的标准是钾利用比例要高于吸钾量。

经过实验筛选得到蠡玉13、吉单27、锦玉28为较耐低钾玉米基因型，郁青281、宁玉309和先玉335为钾相对敏感的基因型。

3.耐低钾玉米基因型的遗传研究

将筛选出的耐低钾基因和父母本为探索耐低钾玉米基因型遗传的研究对象。

在试验中需要对各个基因型吸收钾基因的能力和生理特性进行探索，结果显示：

耐低钾基因的玉米与对钾基因敏感的玉米相比，根系体积较大，根系总体的吸收面积大。

在实验中，随着钾浓度的下降，耐低钾基因玉米叶片活性和相应的降低，与对钾基因敏感的玉米相比更能适应钾浓度下降对作物带来的不利影响。

在对钾进行吸收动力学的研究中可以看到，耐低钾基因玉米具有较大的体积和较小的重量，能够在较短的时间里使玉米对钾元素的吸收达到平衡。

玉米在低钾的环境下通过植物的根系运输土壤中的钾离子同时吸收空气中的钾。

在本实验中通过使用NH4Cl钾离子通道玉米基因的钾动力进行研究。

本实验在低钾的环境中（低于0.1mmol/L），玉米中的基因主要通过钾离子运输和吸收外界的钾。

不同的玉米基因差异可能由于Km不同而有所差异，不同基因钾运输和钾离子之间的亲和力不同致使农作物对钾吸收的含量不同，从而产生不同钾利用的参数。

关键词：

玉米；钾离子；耐钾基因；筛选体系

Abstract

Ourcountryisagriculturalcountryinordertobettersolvetheproblemoffoodcrops,needtomakeupforthecropabsorbtheproblemofshortageofpotashfertilizer.Althoughhighkcontentinsoilofarablelandinourcountry,buttotheproportionofabsorbedbyplantsreallyrarely,especiallywiththeimprovementofcropyields,rapidly-availablepotassiumcontentinthesoilwillbereducedgradually,whichmakessoilpotassiumdeficiencyisincreasinglyserious.Inordertobettersolvetheproblem,thetraditionalmethodbyapplyingonthesoilwillbemorenitrogenfertilizertoimprovethecontentofpotassiuminthesoil.ThoughistheinsufficientagriculturalcountrybutpotashresourcesinChina,theagriculturaluseofpotashneedsalargenumberofimportedfromabroad,butastheimportofpotashprices,makeChina'simportofpotashfertilizerincreasedtheuseofpressure,soifaccordingtothetraditionalwayofkfertilizerforfarming,notonlyincreasedthehugecosts,andwillalsocauseacertaininfluencetotheenvironment,itisneithereconomicnorthepracticeofenvironmentalprotectioncannotmeettheneedsofTheTimes.Inordertosolvetheissueofinsecurityofpotashfertilizerinourcountry,theministryofagriculturethroughtheunremittingeffortstostudythechangefromtheperspectiveofgenecropgeneticnatureoftheproblem,themethodofusingscientificandrationalscreening,excellentmaizevarietiesincornoflowpotassiuminthesoilalsocangrowverywell,thisnewtypeofcropimprovementisofgreatimportancetothecultivationmethodsoffoodproduction.

Thishydroponicexperimentdesignwasusedtoestablishascientific,simple,convenientandefficientscreeningoflowpotassiumgenefrommaize,willfilteroutlowpotassiumgeneofcornresistantgenesandgenesaresensitivetokandpotassiumuptakeunderlowpotassiumstressandthedeterminationofpotassiumabsorptionindexanddeterminationofthemaizegrowthperiodunderlowpotassiumstress,analysisofcornpotassiumresistantgenephysiologicalmechanism,soastoprovidethenecessaryreferencebasisforgenetic.Usingrt-pcrcloningtechnology,cloningZmHAK1genesofmaize,andtheGatewaycloningtechnologywasusedtoconstructtheplantselectionofthecarrier,thusforsubsequentmaizegeneticresearchandbreedingpotassiummaizevarietiesresistanttodobedding,specificresearchresultsareasfollows.

1.Researchonpotassiumabsorptionofrelatedgenes

Improvethelevelofcropsonsoilpotassiumiontransportandtheuseofpotassiumchannelsandsoonmanykindsofwaystoachievepotassiumnutritionimprovementofgenestothecrops.Thisexperimentusingrt-pcrcloningtechnologyandconstructionofplantexpressionvectorofGatewaysystem,toimprovetheabsorptionofpotassiumcornlaythefoundation.Thisexperimentclonedthefourfromthecornpotassiumiontransportgenes.ThroughtheTD-PCRtechnologycloninggenesofmaizeDNAsequences,whichencodeproteinsincluding781aminoacids,predictionhas13acrossthemembranestructurefield.ZmHAKlisoneofthepotassiumiontransportgenes,hasapositiveeffecttotheuptakeofpotassiumbyplants.ThroughtheanalysisofsystemZmHAKlconcludedwiththeHvHAKlhaveclosekinship,indicatedthatithassimilarfeatures,inusingsemi-quantitativePCRwascarriedoutontheZmHAKlgeneexpression,theresultsofZmHAKlgenecanexpressorganizationcharacteristics,expressedintheroots,andtheexpressionoflowpotassiumstress.

2.Cornresistanttolowpotassiumgenescreeningstudy

Throughhydroponicexperimentstudyoflowpotassiuminsoil,thefollowingresults:

seedlingstageofcornforhydroponicexperimentsinlowpotassiumresistantgeneisthebestgrowthperiodofsixleafstage,thepotassiumconcentrationtendencyfor0.1L,screeningcriteriaispotassiumutilizationratioishigherthanpotassiumuptake.Afterexperimentalscreeninggetziyingdianjade13,jidan27,28forjinyuisresistanttolowpotassiummaizegenotypes,YuQing281to281,309andthefirstNingYujadepotassiumrelativelysensitivegenotypes.

3.Lowpotassiumtolerancegeneticresearchofmaizegenotypes

Willfilterouttheresistancetolowpotassiumgeneandparentsforexploringlowpotassiummaizegenotypegeneticresearchobject.Intheexperimentofdifferentgenotypetoabsorbpotassiumgeneticabilityandexplorationonthephysiologicalcharacteristics,theresultsshowedthatlowpotassiumtolerancegenecomparedwithsensitivetopotassiumgeneofcorn,cornrootvolumeislarger,roottotalabsorptionareaislarge.Intheexperiments,astheconcentrationofpotassium,resistanttolowpotassiumgeneactivityofcornleafandthecorresponding,comparedwiththecornissensitivetopotassiumgenearemorecomfortablewithpotassiumconcentrationsdecreasetheadverseinfluenceonthecrops.Intheresearchintothedynamicsofpotassiumabsorptionasyoucansee,theresistancetolowpotassiumgenecornwithlargervolumeandtheweightofthesmall,caninarelativelyshorttimetomakecornontheabsorptionofpotassiumbalance.Maizeundertheenvironmentoflowpotassiumbyplantrootsinthesoilpotassiumabsorptionofthepotassiumintheairatthesametime.Inthisexperiment,throughtheuseofNH4Clpotassiumionchannelgenecornpotassiumpowerwerestudied.Thisexperimentinanenvironmentoflowpotassium（below0.1tendency/L）,thegenefrommaizemainlybypotassiumiontransportandpotassiumabsorptionoutside.DifferentmaizegeneticdifferencesmaybeduetodifferencesamongKm,differentpotassiumtransportandpotassiumionaffinitybetweenthedifferentcropsonthecontentofpotassiumabsorption,toproducepotassiumusedifferentparameters.

KeyWords:

corn;potassium;potassiumresistancegenes;screeningsystem

目录

第1章绪论1

1.1研究背景1

1.1.1我国土地钾资源概况1

1.1.2我国钾肥资源概况1

1.2研究目的和意义1

1.3研究依据2

1.3.1不同基因型吸收钾的效率2

1.3.2植物钾效率的遗传特点2

第2章材料及方法4

2.1材料4

2.2方法4

第3章研究结果与分析6

3.1建立耐低钾玉米基因型的筛选体系6

3.1.1.水培实验不同钾浓度的确定6

3.1.2.低钾胁迫下玉米生育时期的确定9

3.1.3.低钾胁迫下吸钾量和吸钾指数的测定11

3.2耐低钾玉米基因型的筛选13

3.2.1.不同玉米基因型的吸钾量分析13

3.2.2不同玉米基因型的吸钾指数分析16

第4章结论21

参考文献22

第1章绪论

1.1研究背景

1.1.1我国土地钾资源概况

钾元素是土壤中较为丰富的元素，在土壤中的含量比氮、磷等含量多。

我国土壤中钾含量由北向南、由西向东逐步递减，我国华北地区土壤中的氧化钾含量处于1.85至2.40区间。

随着粮食产量的不断提升，农作物对钾元素的需求量也逐步增加，即使在钾含量丰富的北部地区，对土地中钾的供应量也接近饱和。

在各地的研究中发现，由于北方地区很少使用钾肥，令钾元素的支出与投入之间极不均衡，促使北方地区土地的钾含量处于逐年下降的状况。

土壤中钾元素的循环失衡，已经成为制约农作物生长的主要因素，对我国农业的发展极为不利。

我国土壤缺钾的原因主要有以下几点：

第一，农作物的产量逐年增高，随着新产品的推广对土地的复种指数增加，加剧土壤中钾输出含量，加剧了土壤中钾元素的消耗量；第二，对土壤施用的有机肥是补充土壤钾含量的重要方法之一，但有机肥用量在逐年下降，有机肥需要消耗大量的劳动力，但劳动力已经不再是廉价资源，随着人力资本的增加，制约着有机肥的生产，使有机肥产量下滑；第三，秸秆还田技术没有得到广泛的应用，致使这以有效填补土壤钾含量不足技术没有发挥其应有的作用，致使土地缺钾的面积连年上升。

1.1.2我国钾肥资源概况

我国对一个钾矿资源短缺的国家，钾矿主要集中于我国的西北地区例如：

青海的察尔汗盐湖和新疆的罗布泊，其余地区几乎没有可以开采的钾矿资源。

我国是世界第二大钾肥消耗国，仅次于美国。

拒不完全统计，我国钾肥的消耗量为700多万吨，但国内的钾肥产量仅有140多万吨，在这种消耗和自行供给的比例下，我国需要大量的进口国外钾肥。

有报道称，即使将青海二期的上百万吨钾肥全部投入生产，仍然满足不了我国钾肥存在的巨大缺口，我国每年仍然需要花费大量的资金用于进口钾肥。

我国的人口占世界的四分之一，面对如此的农业大国仅仅依靠进口来满足农业需求势必不是长久之计。

为了解决钾肥短缺的问题，我国农业研究人员提出从植物生理、遗传、营养、育种等方面进行资源筛选，研究耐低钾的机理从而培养推广低钾品种，有效的缓解钾肥短缺的现况，现在经济、高产。

1.2研究目的和意义

钾是促进植物生长发育的重要营养因素，在植物的整个生长周期中具有重要的作用。

我国是人口大国为了更好的解决粮食问题，需要提高作物的单产，因而使土壤缺钾问题浮出水面。

据不完全统计，目前大约有百分之三十的耕地缺钾，我国南部地区缺钾的现象更为严重。

在传统农业研究中通过对土壤施以钾肥的形式，提高农作物的产量，但我国钾资源相对匮乏，其中大约百分之九十的钾肥需要通过进口得到，面对钾肥供需出现的严重问题，有科学家指出，需要充分的利用基因多样性和遗传多样性，采用一定的方法手段筛选出高效喜低钾环境的基因，将这种基因用于培育基因的多样性，并且采用科学的方法将其培育成优良农作物资源，在通过现代基因的手段将培育出的高钾营养植物应用于实际的生之中，从而有效的解决我国土壤缺钾的情况。

我国玉米产量位居所有粮食产量第二位，仅次于水稻产量。

有报道指出钾元素的缺失已经严重制约玉米的产量，为了有效的解决这一问题，我国研究人员经过不懈的努力终于得到了解决上述问题的办法，通过对玉米资源进行筛选，从而培育出高钾玉米基因。

筛选的过程需要建立在一个便捷、高效的