蛋白质纯化实验参考手册.docx

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蛋白质纯化实验参考手册

蛋白质纯化实验室

实验手册

第一章外源基因在大肠杆菌中的表达

一、通过聚合酶链式反应（PCR）将靶基因亚克隆到质粒载体上

（一）PCR引物设计的基本原则与PCR反应组分和条件

1.PCR引物设计的基本原则

（1）引物与靶基因间配对的碱基一般为15-20。

（2）引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物G+C含量宜在45-55%左右。

（3）引物内部不应形成二级结构，两个引物之间尤其在3’末端不应有互补链存在。

（4）引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性。

可用计算机进行辅助检索分析。

（5）引物3’末端一般以单个C或G结尾。

2.PCR反应组分和条件

PCR反应体系一般选用50μl体积，其中含有：

10×Reactionbuffer，5μl

2个引物，各12.5-25pmol（终浓度各0.25-0.50μmol/L）

4种底物（dATP+dCTP+dGTP+dTTP），各200μmol/L

模板DNA，100ng左右

TaqDNA聚合酶，2.5-3U

PCR反应条件一般为：

（1）94℃，5分钟

（2）94℃变性30-60秒

（3）50-55℃退火30-60秒

（4）70-72℃延伸30-60秒

（5）72℃5-10分钟

共进行25-35次循环。

循环是步骤

（2）和（4）

（二）质粒DNA的小量制备

1、传统方法

（1）用灭菌牙签挑单菌落于3mlLB培养液中，37℃培养过夜。

（2）在每个EP管中倒入1ml左右的过夜培养物，6,000rpm离心1分钟以收集菌体。

（3）将菌体重悬于100μl4℃预冷的溶液I中，并加入200μl新配制的溶液II,盖紧管口，快速颠倒离心管6-7次，然后，冰浴5分钟。

（4）加150μl4℃预冷的溶液III,倒置5-6次以混合内容物，然后，冰浴5分钟。

（5）12,000rpm离心10分钟后，小心吸取上清至另一EP管中。

（6）加2倍体积的无水乙醇，振荡混合，并在室温放置5分钟。

（7）12,000rpm离心5分钟后，移去上清，并用70%乙醇漂洗DNA沉淀。

DNA沉淀自然干燥，并溶于20μl双蒸水或1×TE缓冲液（10mmol/LTris,1mmol/LEDTA,pH8.0）中。

2.Promega公司WizardPlus小量DNA纯化方法-离心方案（适用于产品A1330，A1340，A1460及A1470）

（1）12,000rpm离心1分钟，以沉淀1-10ml过夜培养物。

（2）用250μlCellResuspensionSolution充分悬浮大肠杆菌细胞。

（3）加250μlCellLysisSolution，倒置5-6次混合。

（4）加10μlAlkalineProteaseSolution，倒置5-6次混合，室温放置5分钟。

（5）加350μlNeutralizationSolution，倒置5-6次混合。

（6）室温，最高转速离心10分钟，回收上清。

（7）将离心柱插入收集管中。

（8）将上清倒入离心柱中。

（9）室温，最高转速离心1分钟，倒掉流穿液，将离心柱重新插入收集管中。

（10）加750μlWashSolution（加乙醇），最高转速离心1分钟，倒掉流穿液，将离心柱重新插入收集管中。

（11）重复步骤（10）（用250μlWashSolution）。

（12）室温，最高转速离心2分钟。

（13）将离心柱插入一个无菌的1.5ml微量离心管中。

（14）在离心柱中加50-100μlNuclease-FreeWater，室温，最高转速离心1分钟。

（15）DNA溶液保存在-20℃备用。

（三）质粒DNA的中量制备

1.在100ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中加入1mlpET-15b/Novablue甘油菌，37℃培养过夜；

2.4℃,4,000rpm离心10分钟以收集菌体；在菌体用3ml溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris,pH8.0,10mmol/LEDTA,pH8.0）充分悬浮后，加入6ml溶液II（0.2mol/LNaOH,1%SDS），并倒置混合，冰浴5-10分钟；

3.加入4.5ml溶液III（60ml5mol/L乙酸钾，11.5ml冰乙酸和28.5ml水），轻摇混合，冰浴10分钟；

4.4℃，12,000rpm离心20分钟，小心吸取上清至另一个50ml离心管中；加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10分钟；

5.室温，10,000rpm离心10分钟以沉淀DNA；

6.在沉淀用70%乙醇漂洗，自然干燥，并溶于0.3ml的TE（10mmol/LTris,1mmol/LEDTA,pH8.0）缓冲液中，然后转入EP管中；

7.加入等体积的5mol/LLiCl,室温，10,000rpm离心10分钟以沉淀大分子RNA分子；

8.回收上清，加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，12,000rpm离心5分钟以沉淀DNA；

9.DNA沉淀用70%乙醇漂洗，然后，自然干燥；

10.DNA沉淀溶于200μl含50-100μg/ml胰RNA酶的TE缓冲液中，在37℃保温30分钟；

11.加入等体积的13%PEG8000/1.6mol/LNaCl,室温放置5分钟；12,000rpm离心10分钟以沉淀DNA；

12.小心移去上清，DNA沉淀溶于200μlTE（pH8.0）缓冲液中，并用酚-氯仿-异戊醇（25:

24:

1）抽提一次；小心将上层溶液转移到一个干净的EP管中，并加入0.1体积的3mol/LNaAc（pH5.2）和2倍无水乙醇，混匀，-40℃放置30分钟；

13.12,000rpm离心5分钟以沉淀DNA；DNA沉淀用70%的乙醇漂洗，自然干燥，并溶于100μlTE缓冲液中。

最后，用1%的琼脂糖凝胶电泳对DNA进行定量和纯度鉴定。

（四）DNA（PCR产物或质粒）的酶切

1.一般在15-20μl体积中酶切0.2-1μg的DNA，可根据实际情况，按比例放大酶切反应的体积和DNA的量。

2.一般用7-8u的限制性内切酶酶切1μg的DNA，酶:

DNA的比率应小于25u/μg，以防止staractivity。

3.限制性内切酶一般保存在50%的甘油中，而大于5%的甘油可能会引起staractivity或抑制酶切反应。

因此，在酶切反应体系中，甘油的浓度一般应小于5%，也就是说，限制性内切酶的体积应小于酶切反应总体积的1/10。

4.对于双酶切反应，可考虑在同一种缓冲液中进行，一般要求任一一种限制性内切酶的活性不低于其最大活性的50%。

5.酶切反应的时间一般为2-3小时。

如果酶切不完全，可适当延长酶切反应的时间。

（五）从琼脂糖凝胶或PCR反应物中回收DNA（用Promega公司的WizardSVGelandPCRClean-UpSystem—适用于产品A9280、A9281及A9282）

1.从琼脂糖凝胶中切下含DNA的胶条，并放入一洁净的EP管中。

按每10mg胶条加10μl的MembraneBindingSolution，漩涡震荡，并在50-60℃保温直到胶条完全溶解；对于PCR反应物，可直接加等体积的MembraneBindingSolution混合。

2.将SV微柱插入收集管中，并将上述溶液加入SV微柱，室温放置1分钟。

3.10,000g离心1分钟，丢弃流穿液，重新将微柱插入收集管中。

4.加700μlMembraneWashSoluton，10,000g离心1分钟，丢弃流穿液，重新将微柱插入收集管中。

5.用500μlMembraneWashSolution重复步骤4，10,000g离心5分钟。

6.小心将微柱插入一洁净的EP管中。

7.在微柱中加50μlNuclease-FreeWater，室温放置1分钟，10,000g离心1分钟。

8.丢弃微柱，将DNA储存在4℃或-20℃。

（六）PCR产物或DNA酶切片断与质粒载体的连接

1.常规方法

一般在10μl反应体系中，加酶切并回收的质粒载体50-100μg左右及1μl的T4DNA连接酶（3-5u/μl），按PCR产物或DNA酶切片断摩尔数与载体摩尔数比约为3:

1的比例进行连接。

连接反应在13-16℃保温过夜。

2.快速连接方法

可以通过连接Kit进行。

例如，对于Takara公司的连接Kit，可在载体与插入片段的混合液（5μl）中加入5μlKit溶液，16℃保温2小时即可。

（七）大肠杆菌感受态细胞的制备

1.单菌落接种于3mlLB培养液中，37℃过夜培养。

2.取2ml过夜培养物接种于200mlLB培养液中，并且，当37℃培养至OD600为0.4左右时，转移至250ml离心管中，立即冰浴30分钟。

3.在4℃，3,600rpm离心10分钟，弃上清，加4℃预冷的0.1mol/LCaCl

2溶液10ml,轻摇以充分悬浮细胞。

4.转移至50ml离心管中，在4℃，3,500rpm离心7分钟，小心弃上清。

5.加5ml预冷的0.1mol/LCaCl2，轻摇离心管以充分悬浮细胞；冰浴2小时后，加4℃预冷的80%甘油至终浓度为15%，混匀分装，并保存于-70℃。

（八）用质粒或连接产物转化大肠杆菌感受态细胞

1.常规方法

一般用2-3μl连接反应物与200μl大肠杆菌菌株感受态细胞混合，冰浴30分钟；42℃热激90秒，冰浴2分钟；加0.5-0.8ml的LB培养液，37℃，150-200rpm振荡培养60分钟；低速离心以沉淀细胞，并移去大部分上清；用移液器吹吸混匀细胞，在9cm直径的平板涂布100-200μl细胞悬液，并在37℃保温过夜。

2.快速转化方法

用2-3μl连接反应物与200μl大肠杆菌菌株感受态细胞混合，冰浴10分钟，42℃热激90秒，冰浴2分钟，然后涂布在含有适宜抗生素的平板上。

（九）转化子的筛选和鉴定

1.通过Promega公司pGEM-TVectorSystem的蓝/白斑筛选

（1）在含有适当抗生素90mmLB琼脂平板中央滴加40μl2%X-gal（用二甲基甲酰胺配制）和7μl20%IPTG.。

如用150mm平板，则加100μl2%X-gal和20μl20%IPTG。

（2）用涂布棒使溶液均匀地分散在整个平板的表面。

然后，在37℃保温1小时，使全部液体消失。

（3）将pGEM-TVector--插入片断连接反应物转化的大肠杆菌细胞涂布在上述平板的表面，37℃保温过夜。

其中，白色菌落表明：

细胞中的质粒含有插入片断；蓝色菌落表明：

细胞中的质粒不含有插入片断。

2.转化子质粒DNA的酶切鉴定

用灭菌牙签挑单菌落于3ml含有适宜抗生素的LB培养液中，37℃振荡过夜培养。

吸取1ml过夜培养物进行质粒DNA的小量抽提，用限制性内切酶酶切检验质粒

DNA中是否有插入片断。

3.以菌落为模板的PCR鉴定

用灭菌吸头挑取少许单菌落细胞，点在PCR管的底部。

然后，加入其他PCR组分，进行正常的PCR反应（其中，PCR循环前的反应参数为：

95℃保温10分钟），以检测菌落细胞质粒DNA中是否有插入片断。

二、Stratagene公司的QuikChangeTM定点突变方法

为了保证高的突变效率，DNA模板的用量要小，DNA聚合酶的保真度要高，PCR的循环数要少。

（一）突变引物的设计

1.对于每一个突变，需合成两条互补的引物，并且引物应通过PAGE纯化。

2.引物的长度为25-45个碱基，其Tm值应大于或等于78℃。

Tm=81.5+0.41（%GC）–675/N–%mismatch,N为引物的长度。

3.突变碱基应当位于引物的中间。

4.引物的GC含量应大于或等于40%，并且应当以一个或多个C或G结尾。

（二）PCR相关参数

1.小抽或中抽的质粒DNA均可用作DNA模板。

对于50μl反应体系，DNA模板的用量为10-100ng，最适用量应通过实验来确定。

2.引物应过量，一般可配成100ng/μl，用量为3-5μl。

3.PCR反应条件为：

95℃，1分钟；50-55℃,1-2分钟；68℃,2minutes/kbofplasmidlength。

4.对于单个碱基的改变，退火温度为55℃，循环数为12次；对于两个或三个碱基的改变，或者单个氨基酸的缺失或插入，退火温度为50或55℃，循环数为16次；对于多个氨基酸的缺失或插入，退火温度为50或55℃，循环数为18次。

（三）DNA模板的去除

PCR反应后，取10μl反应物走1%琼脂糖凝胶电泳，以检测目标产物的量和纯度。

如果目标产物的量和纯度符合要求，则在剩余反应物中加1μl限制性内切酶DpnI（10-20u/μl）,37℃保温2-3小时以酶解模板DNA。

（四）转化

取3μlDpnI酶切反应物转化200μl大肠杆菌感受态细胞。

（五）突变基因的鉴定

突变基因通过DNA测序鉴定。

三、检测外源蛋白质在大肠杆菌中的表达

如果靶基因亚克隆在含有T7启动子的表达载体（如质粒载体pET-22b和pET-15b等）上，那么重组质粒应转化入λDE3溶源菌菌株[如BL21（DE3）、JM109（DE3）及QrigamiB（DE3）等]中，以进行靶基因的表达。

（一）溶菌酶-DNaseI-反复冻融裂解菌体法

1.单菌落接入4mlLB培养液中，过夜培养。

再以1:

20转接至2管4mlLB培养液中，当OD600为0.6-0.8时，一管加IPTG诱导，另一管不加IPTG作对照。

2.离心收集菌体，每管加Bindingbuffer100μl，DNaseI（2,000u/ml）10μl，溶菌酶（2mg/ml）5μl。

菌体充分悬浮后，在-20℃放置20分钟，室温融化，如此反复冻融8-10次。

3.吸取20μl加入一洁净的EP管中，12,000rpm离心10分钟，上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳，以判断靶蛋白质主要以溶解形式还是以包涵体形式存在。

（二）超声波裂解菌体法

1.单菌落接入4mlLB培养液中，过夜培养。

其中2ml过夜培养物用于菌种保存和DNA测序，另外2ml过夜培养物接入100mlLB培养液中扩大培养。

当OD600为0.6-0.8时，加IPTG诱导表达3-4小时。

2.4℃，5,000rpm离心10分钟收集菌体，用5mlBindingbuffer充分悬浮细胞，超声波破碎细胞（功率：

120W左右，间歇时间：

10秒，工作时间：

3秒，破碎次数：

40-50次）。

3.吸取20μl加入一洁净的EP管中，12,000rpm离心10分钟，上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳，以判断靶蛋白质主要以溶解形式还是以包涵体形式存在。

（三）SDS-煮沸裂解菌体法

1.单菌落接入4mlLB培养液中，37℃培养。

当OD600为0.6-0.8时（约需3-4小时），吸取2ml加入另一空的培养管中。

其中，一管加IPTG诱导，另一管不加IPTG作为对照。

2.吸取1ml培养物加入洁净的EP管中，10,000rpm离心1分钟收集菌体。

在菌体管中加20μl水和20μl2×loadingbuffer，沸水浴中维持3-5分钟。

3.用SDS-PAGE电泳分析上述样品，以判断靶蛋白质在大肠杆菌中的表达量。

四、用大肠杆菌生产13C-15N标记的蛋白质

1.用于生产13C-15N标记蛋白质的组合培养基（每升）

K2HPO4·3H2O：

10.375克

KH2PO4：

4.375克

15NH4Cl：

0.5克

MgSO4·7H2O：

50毫克

NH4FeSO4·6H2O：

7毫克

盐酸硫胺：

10毫克（母液浓度为10毫克/毫升）

13C-葡萄糖：

2.5克

氨苄青霉素：

100毫克（母液浓度为100毫克/毫升）

除15NH4Cl、13C-葡萄糖及氨苄青霉素外，其余试剂均为国产分析纯试剂；2.5克葡萄糖溶于25毫升蒸馏水中，并单独灭菌；对盐酸硫胺和氨苄青霉素采用过滤除菌；葡萄糖、盐酸硫胺及氨苄青霉素在培养前加入。

2.在大肠杆菌细胞中合成13C-15N标记的蛋白质

将来自LB平板上的单菌落（含有重组质粒）接入2-3毫升组合培养基中，37℃振荡培养12小时（例如，从9:

00-21:

00），然后接入100毫升组合培养基中；过夜培养后，分别接入三个330毫升（在1升三角瓶中）组合培养基中；当37℃培养至OD600=0.6-0.7时，加IPTG至终浓度为1mmol/L，并继续培养4小时，以诱导13C-15N标记蛋白质的合成。

第二章蛋白质的纯化和鉴定

一、用Ni2+亲和层析柱纯化可溶性蛋白质

1.30ml的过夜培养物加入300ml（在1升三角瓶中）含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中，在37℃振荡培养。

2.当OD600达到0.6-1.0时，加IPTG至终浓度为1mmol/L进行诱导表达，培养物继续保温4小时以进行目标蛋白质的累积。

3.4℃，5,000rpm离心10分钟收集菌体。

对于500ml菌液中的菌体，用20-30ml的startbuffer充分悬浮。

4.在冰浴条件下，用超声波破碎细胞（条件为：

工作时间3秒，间歇时间10秒，总次数120-200）。

5.4℃，12,000rpm离心20分钟以去除细胞碎片，上清与Ni2+亲和层析柱混合。

6.上样后，分别用startbuffer（20mmol/LTris,pH7.8,0.5mol/LNaCl）和washbuffer（20mmol/LTris,pH7.8,0.5mol/LNaCl,50-100mmol/L咪唑）洗脱杂蛋白质，用elutionbuffer（20mmol/LTris,pH7.8,0.5mol/LNaCl,0.5mol/L咪唑）洗脱目标蛋白质。

二、通过Ni2+亲和层析柱纯化包涵体蛋白质

1.5,000rpm离心15min。

弃培养基，按每500ml菌体加入20ml缓冲液A。

2.震荡混匀，加入200l100mmol/LPMSF。

超声破碎200次（功率为200W，工作时间为3s，间隙时间为10s）。

12,000rpm离心20min。

3.弃上清，沉淀再加入5ml缓冲液A洗涤1次。

12000rpm离心20min。

加入6ml盐酸胍溶液，4℃静置过夜。

12000rpm离心20min。

按以下步骤处理：

（1）用缓冲液B平衡Niagarose柱。

（2）将盐酸胍处理的蛋白质溶液上Niagarose柱。

（3）用约10倍床体积的含25mmol/L咪唑的缓冲液C洗脱。

（4）用约10倍床体积的含40mmol/L咪唑的缓冲液C洗脱。

（5）用约5倍床体积的含400mmol/L咪唑的缓冲液C解析下目标蛋白质。

缓冲液A：

Tris·Cl（pH8.0）50mmol/L

EDTA0.5mmol/L

NaCl0.4mmol/L

MgCl5mmol/L

甘油5%

盐酸胍溶液：

盐酸胍6mol/L

Tris·Cl（pH8.0）50mmol/L

甘油5%

缓冲液B：

Tris·Cl（pH7.9）10mmol/L

甘油10%

NaCl0.5mmol/L

缓冲液C：

Tris·Cl（pH7.9）20mmol/L

甘油20%

KCl100mmol/L

三、透析袋与超滤膜的使用注意事项

可用脱盐层析柱、透析袋或超滤膜对蛋白质溶液进行脱盐、缓冲液置换或浓缩。

对于透析脱盐，宜采用逐渐降低盐浓度的方式进行。

（一）透析袋使用注意事项

1.应带上一次性薄膜手套操作透析袋。

2.透析袋一般剪成10-20cm的小段。

3.新透析袋应在2%（w/v）碳酸氢钠和1mmol/L（pH8.0）EDTA中煮沸10分钟，然后用蒸馏水清洗干净，再用1mmol/L（pH8.0）EDTA中煮沸10分钟。

冷却后，4℃保存于20%的乙醇中。

4.用过的透析袋需用蒸馏水彻底清洗干净，然后浸于20%的乙醇中，在4℃保存备用。

（二）超滤膜使用注意事项

1.不要用手直接拿超滤膜，应用平头镊子小心夹取超滤膜的边缘。

2.在4℃，10%-20%的乙醇中保存，不要冰冻。

3.使用过的超滤膜应进行再生处理（放在培养皿中，在脱色摇床上进行），具体方案如下:

（1）蒸馏水漂洗2分钟。

（2）用0.1mol/LNaOH漂洗10分钟。

（3）用蒸馏水漂洗以除去NaOH。

（4）70%乙醇浸泡5分钟。

（5）用蒸馏水漂洗2分钟，再保存于10%-20%的乙醇中。

4.光面向上。

5.应避免超滤pH小于3.0或pH大于13的溶液。

6.不能与下列溶液混用：

（1）胺

（2）大于10%的磷酸溶液。

（3）大于0.5%的酚溶液。

（4）大于0.01mol/L的盐酸。

四、蛋白质浓度的测定

蛋白质的浓度用BCAProteinAssayKit（pierce公司）测定，以牛血清白蛋白为标准。

具体方案如下：

1.用Kit中的牛血清白蛋白标样配制成下列不同浓度的标准溶液：

2,000g/ml,1,500g/ml、1,000g/ml、750g/ml、500g/ml、250g/ml、125g/ml及25g/ml（0g/ml=空白溶液）。

在这里，配标准溶液所用的稀释剂应与待测样品的相同。

2.将50体积的BCA试剂A与1体积的试剂B充分混合，从而配成工作溶液。

工作溶液最好在测定的当天配制。

3.分别将0.15ml标准溶液、待测样品及空白溶液与3ml工作溶液在5ml离心管中混合，37℃保温30分钟。

然后，迅速用冰浴冷却所有的管。

4.用蒸馏水调零，在562nm处测定样品的光密度值（最好在10分钟内完成）。

5.从标准溶液和所测样品的562nm光密度值中减去空白溶液的相应吸收值，即得到净吸收值。

然后，以牛血清白蛋白浓度为横坐标，以相应的562nm净吸收值为纵坐标作标准曲线。

用标准曲线判定每个未知样品的浓度。

第三章DNA-蛋白质相互作用研究方法

一、凝胶迁移率变动实验（gelshiftorelectrophoreticmobilityshiftassay）

凝胶迁移率变动实验又称凝胶滞留法（gelretardationassay）或迁移率改变法（mobilityshiftassay），是检测DNA结合蛋白的一种简单迅速而又灵敏可靠的实验方法。

凝胶迁移率变动实验的基本原理是：

当DNA结合蛋白与相应的DNA片断或寡核苷酸结合而形成DNA-蛋白质复合物后，使DNA片段的分子量及电荷发生改变，因而在聚丙烯酰胺凝胶电泳体系中其电泳迁移率发生改变，通常较游离的DNA片段的泳动速率慢得多，在放射自显影

X光胶片上形成一较游离DNA片断滞后的带