蛋白质纯化实验参考手册.docx

1、蛋白质纯化实验参考手册蛋白质纯化实验室实验手册第一章外源基因在大肠杆菌中的表达一、通过聚合酶链式反应（PCR）将靶基因亚克隆到质粒载体上（一）PCR引物设计的基本原则与PCR反应组分和条件1.PCR引物设计的基本原则（1）引物与靶基因间配对的碱基一般为15-20。（2）引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物G + C含量宜在45-55%左右。（3）引物内部不应形成二级结构，两个引物之间尤其在3末端不应有互补链存在。（4）引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性。可用计算机进行辅助检索分析。（5）引物3末端一般以单个C或G结尾。2.PCR反应组分和条件PCR反应体系一般选用50

2、l体积，其中含有：10Reaction buffer，5 l2个引物，各12.5-25 pmol (终浓度各0.25-0.50 mol/L)4种底物（dATP + dCTP + dGTP + dTTP），各200mol/L模板DNA，100 ng左右Taq DNA聚合酶，2.5-3 UPCR反应条件一般为：（1）94，5分钟（2）94变性30-60秒（3）50-55退火30-60秒（4）70-72延伸30-60秒（5）725-10分钟共进行25-35次循环。循环是步骤（2）和（4）(二)质粒DNA的小量制备1、传统方法（1）用灭菌牙签挑单菌落于3 ml LB培养液中，37培养过夜。（2）在每个

3、EP管中倒入1 ml 左右的过夜培养物，6,000 rpm 离心1分钟以收集菌体。（3）将菌体重悬于100 l 4预冷的溶液I中，并加入200 l新配制的溶液II, 盖紧管口，快速颠倒离心管6-7次，然后，冰浴5分钟。（4）加150 l 4预冷的溶液III, 倒置5-6次以混合内容物，然后，冰浴5分钟。（5）12,000 rpm 离心10分钟后，小心吸取上清至另一EP管中。（6）加2倍体积的无水乙醇，振荡混合，并在室温放置5分钟。（7）12,000 rpm离心5分钟后，移去上清，并用70%乙醇漂洗DNA沉淀。DNA沉淀自然干燥，并溶于20 l 双蒸水或1TE缓冲液 (10 mmol/L Tri

4、s, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0) 中。2. Promega公司Wizard Plus小量DNA纯化方法-离心方案（适用于产品A1330，A1340，A1460及A1470）（1）12,000 rpm离心1分钟，以沉淀1-10 ml过夜培养物。（2）用250l Cell Resuspension Solution充分悬浮大肠杆菌细胞。（3）加250l Cell Lysis Solution，倒置5-6次混合。（4）加10l Alkaline Protease Solution，倒置5-6次混合，室温放置5分钟。（5）加350l Neutralization Solution，倒

5、置5-6次混合。（6）室温，最高转速离心10分钟，回收上清。（7）将离心柱插入收集管中。（8）将上清倒入离心柱中。（9）室温，最高转速离心1分钟，倒掉流穿液，将离心柱重新插入收集管中。（10）加750l Wash Solution（加乙醇），最高转速离心1分钟，倒掉流穿液，将离心柱重新插入收集管中。（11）重复步骤（10）（用250l Wash Solution）。（12）室温，最高转速离心2分钟。（13）将离心柱插入一个无菌的1.5 ml微量离心管中。（14）在离心柱中加50-100l Nuclease-Free Water，室温，最高转速离心1分钟。（15）DNA溶液保存在-20备用。 (

6、三) 质粒DNA的中量制备1. 在100 ml 含100 g/ml 氨苄青霉素的LB培养液中加入1 ml pET-15b/Novablue甘油菌，37培养过夜；2. 4, 4,000 rpm离心10分钟以收集菌体；在菌体用3 ml 溶液 I (50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris, pH 8.0, 10 mmol/L EDTA, pH 8.0) 充分悬浮后，加入6 ml 溶液II (0.2 mol/L NaOH, 1% SDS)，并倒置混合，冰浴5-10分钟；3. 加入4.5 ml 溶液III（60ml 5 mol/L 乙酸钾，11.5 ml 冰乙酸和28.5ml水），轻摇

7、混合，冰浴10分钟；4. 4，12,000 rpm 离心20分钟，小心吸取上清至另一个50 ml离心管中；加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10分钟；5. 室温，10,000 rpm离心10分钟以沉淀DNA；6. 在沉淀用70%乙醇漂洗，自然干燥，并溶于0.3 ml 的TE (10 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0) 缓冲液中，然后转入EP管中；7. 加入等体积的5 mol/L LiCl, 室温，10,000 rpm离心10分钟以沉淀大分子RNA分子；8. 回收上清，加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，12,000 rpm 离心5分钟以沉淀DNA；9

8、. DNA沉淀用70%乙醇漂洗，然后，自然干燥；10. DNA沉淀溶于200 l含50-100 g/ml 胰RNA酶的TE缓冲液中，在37保温30分钟；11. 加入等体积的13% PEG8000/1.6 mol/L NaCl, 室温放置5分钟；12,000 rpm 离心10分钟以沉淀DNA；12. 小心移去上清，DNA沉淀溶于200 l TE (pH 8.0) 缓冲液中，并用酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）抽提一次；小心将上层溶液转移到一个干净的EP管中，并加入0.1体积的3mol/L NaAc (pH 5.2)和2倍无水乙醇，混匀，-40放置30分钟；13. 12,000 rpm 离心5分

9、钟以沉淀DNA；DNA沉淀用70%的乙醇漂洗，自然干燥，并溶于100 l TE 缓冲液中。最后，用1%的琼脂糖凝胶电泳对DNA进行定量和纯度鉴定。（四）DNA（PCR产物或质粒）的酶切 1. 一般在15-20 l体积中酶切0.2-1 g的DNA，可根据实际情况，按比例放大酶切反应的体积和DNA的量。 2. 一般用7-8 u的限制性内切酶酶切1 g的DNA，酶:DNA的比率应小于25u/g，以防止star activity。 3. 限制性内切酶一般保存在50%的甘油中，而大于5%的甘油可能会引起star activity或抑制酶切反应。因此，在酶切反应体系中，甘油的浓度一般应小于5%，也就是说，

10、限制性内切酶的体积应小于酶切反应总体积的1/10。 4. 对于双酶切反应，可考虑在同一种缓冲液中进行，一般要求任一一种限制性内切酶的活性不低于其最大活性的50%。 5. 酶切反应的时间一般为2-3小时。如果酶切不完全，可适当延长酶切反应的时间。（五）从琼脂糖凝胶或PCR反应物中回收DNA （用Promega公司的Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System适用于产品A9280、A9281及A9282）1. 从琼脂糖凝胶中切下含DNA的胶条，并放入一洁净的EP管中。按每10 mg胶条加10 l的Membrane Binding Solution，漩涡震荡，并在50-

11、60保温直到胶条完全溶解；对于PCR反应物，可直接加等体积的Membrane Binding Solution混合。2. 将SV 微柱插入收集管中，并将上述溶液加入SV微柱，室温放置1分钟。 3. 10,000 g离心1分钟，丢弃流穿液，重新将微柱插入收集管中。 4. 加700 l Membrane Wash Soluton，10,000 g离心1分钟，丢弃流穿液，重新将微柱插入收集管中。5. 用500 l Membrane Wash Solution 重复步骤4，10,000 g离心5分钟。6. 小心将微柱插入一洁净的EP管中。7. 在微柱中加50 l Nuclease-Free Water

12、，室温放置1分钟，10,000 g离心1分钟。8. 丢弃微柱，将DNA储存在4或-20。（六）PCR产物或DNA酶切片断与质粒载体的连接1. 常规方法一般在10l反应体系中，加酶切并回收的质粒载体50-100 g左右及1 l的T4 DNA连接酶（3-5 u/l），按PCR产物或DNA酶切片断摩尔数与载体摩尔数比约为3:1的比例进行连接。连接反应在13-16保温过夜。2. 快速连接方法可以通过连接Kit进行。例如，对于Takara公司的连接Kit，可在载体与插入片段的混合液（5 l）中加入5 l Kit溶液，16 保温2小时即可。（七）大肠杆菌感受态细胞的制备1. 单菌落接种于3 ml LB培养

13、液中，37过夜培养。2. 取2 ml 过夜培养物接种于200 ml LB培养液中，并且，当37培养至OD600为0.4左右时，转移至250 ml离心管中，立即冰浴30分钟。3. 在4，3,600 rpm离心10分钟，弃上清，加4预冷的0.1 mol/L CaCl2溶液10 ml, 轻摇以充分悬浮细胞。4. 转移至 50 ml 离心管中，在4，3,500 rpm离心7分钟，小心弃上清。5. 加5 ml 预冷的0.1 mol/L CaCl2 ，轻摇离心管以充分悬浮细胞；冰浴2小时后，加4预冷的80%甘油至终浓度为15%，混匀分装，并保存于-70。（八）用质粒或连接产物转化大肠杆菌感受态细胞1. 常

14、规方法一般用2-3 l连接反应物与200 l 大肠杆菌菌株感受态细胞混合，冰浴30分钟；42热激90秒，冰浴2分钟；加0.5-0.8 ml 的LB培养液，37，150-200 rpm振荡培养60分钟；低速离心以沉淀细胞，并移去大部分上清；用移液器吹吸混匀细胞，在9 cm 直径的平板涂布100-200 l 细胞悬液，并在37保温过夜。2. 快速转化方法用2-3 l连接反应物与200 l 大肠杆菌菌株感受态细胞混合，冰浴10分钟，42热激90秒，冰浴2分钟，然后涂布在含有适宜抗生素的平板上。（九）转化子的筛选和鉴定1. 通过Promega公司pGEM-T Vector System的蓝/白斑筛选（

15、1）在含有适当抗生素90 mm LB琼脂平板中央滴加40 l 2% X-gal（用二甲基甲酰胺配制）和7 l 20% IPTG.。如用150 mm平板，则加100 l 2% X-gal 和 20 l 20% IPTG。（2）用涂布棒使溶液均匀地分散在整个平板的表面。然后，在37保温1小时，使全部液体消失。（3）将pGEM-T Vector-插入片断连接反应物转化的大肠杆菌细胞涂布在上述平板的表面，37保温过夜。其中，白色菌落表明：细胞中的质粒含有插入片断；蓝色菌落表明：细胞中的质粒不含有插入片断。2. 转化子质粒DNA的酶切鉴定用灭菌牙签挑单菌落于3 ml含有适宜抗生素的LB培养液中，37振荡

16、过夜培养。吸取1 ml过夜培养物进行质粒DNA的小量抽提，用限制性内切酶酶切检验质粒DNA中是否有插入片断。3. 以菌落为模板的PCR鉴定用灭菌吸头挑取少许单菌落细胞，点在PCR管的底部。然后，加入其他PCR组分，进行正常的PCR反应（其中，PCR循环前的反应参数为：95保温10分钟），以检测菌落细胞质粒DNA中是否有插入片断。二、Stratagene公司的QuikChangeTM 定点突变方法为了保证高的突变效率，DNA模板的用量要小，DNA聚合酶的保真度要高，PCR的循环数要少。（一）突变引物的设计 1. 对于每一个突变，需合成两条互补的引物，并且引物应通过PAGE纯化。2.引物的长度为2

17、5-45个碱基，其Tm值应大于或等于78。Tm = 81.5 + 0.41 (%GC) 675/N % mismatch, N为引物的长度。3.突变碱基应当位于引物的中间。4.引物的GC含量应大于或等于40%，并且应当以一个或多个C或G结尾。（二）PCR相关参数1.小抽或中抽的质粒DNA均可用作DNA模板。 对于50l反应体系，DNA模板的用量为10-100 ng，最适用量应通过实验来确定。2.引物应过量，一般可配成100 ng/l，用量为3-5 l。3.PCR反应条件为：95，1分钟；50-55, 1-2分钟； 68, 2 minutes/kb of plasmid length。4.对于单

18、个碱基的改变，退火温度为55，循环数为12次；对于两个或三个碱基的改变，或者单个氨基酸的缺失或插入，退火温度为50或55，循环数为16次；对于多个氨基酸的缺失或插入，退火温度为50或55，循环数为18次。（三）DNA模板的去除PCR反应后，取10 l反应物走1%琼脂糖凝胶电泳，以检测目标产物的量和纯度。如果目标产物的量和纯度符合要求，则在剩余反应物中加1 l限制性内切酶DpnI (10-20 u/l), 37保温2-3小时以酶解模板DNA。（四）转化取3 l DpnI酶切反应物转化200 l大肠杆菌感受态细胞。（五）突变基因的鉴定突变基因通过DNA测序鉴定。三、检测外源蛋白质在大肠杆菌中的表达

19、如果靶基因亚克隆在含有T7启动子的表达载体（如质粒载体pET-22b和pET-15b等）上，那么重组质粒应转化入DE3溶源菌菌株 如BL21(DE3)、JM109(DE3)及Qrigami B(DE3)等 中，以进行靶基因的表达。（一）溶菌酶-DNase I-反复冻融裂解菌体法1.单菌落接入4ml LB培养液中，过夜培养。再以1:20转接至2管4 ml LB培养液中，当OD600为0.6-0.8时，一管加IPTG诱导，另一管不加IPTG作对照。2.离心收集菌体，每管加Binding buffer 100 l，DNase I (2,000 u/ml) 10 l，溶菌酶 (2 mg/ml) 5 l

20、。菌体充分悬浮后，在-20放置20分钟，室温融化，如此反复冻融8-10次。3.吸取20 l加入一洁净的EP管中，12,000 rpm离心10分钟，上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳，以判断靶蛋白质主要以溶解形式还是以包涵体形式存在。（二）超声波裂解菌体法1.单菌落接入4 ml LB培养液中，过夜培养。其中2 ml过夜培养物用于菌种保存和DNA测序，另外2 ml过夜培养物接入100 ml LB培养液中扩大培养。当OD600为0.6-0.8时，加IPTG诱导表达3-4小时。2.4，5,000 rpm离心10分钟收集菌体，用5 ml Binding buffer充分悬浮细胞，超声波破碎细胞（功率

21、：120 W左右，间歇时间：10 秒，工作时间：3秒，破碎次数：40-50次）。3.吸取20 l加入一洁净的EP管中，12,000 rpm离心10分钟，上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳，以判断靶蛋白质主要以溶解形式还是以包涵体形式存在。（三）SDS-煮沸裂解菌体法1.单菌落接入4ml LB培养液中，37培养。当OD600为0.6-0.8时（约需3-4小时），吸取2 ml加入另一空的培养管中。其中，一管加IPTG诱导，另一管不加IPTG作为对照。2.吸取1 ml培养物加入洁净的EP管中，10,000 rpm离心1分钟收集菌体。在菌体管中加20 l水和20 l 2loading buffer

22、，沸水浴中维持3-5分钟。3.用SDS-PAGE电泳分析上述样品，以判断靶蛋白质在大肠杆菌中的表达量。四、用大肠杆菌生产13C-15N标记的蛋白质1.用于生产13C-15N标记蛋白质的组合培养基（每升） K2HPO43H2O：10.375克KH2PO4：4.375克15NH4Cl：0.5克MgSO47H2O：50 毫克NH4FeSO46H2O：7毫克盐酸硫胺：10毫克（母液浓度为10毫克/毫升）13C-葡萄糖：2.5克氨苄青霉素：100毫克（母液浓度为100毫克/毫升）除15NH4Cl、13C-葡萄糖及氨苄青霉素外，其余试剂均为国产分析纯试剂；2.5克葡萄糖溶于25毫升蒸馏水中，并单独灭菌；对

23、盐酸硫胺和氨苄青霉素采用过滤除菌；葡萄糖、盐酸硫胺及氨苄青霉素在培养前加入。2.在大肠杆菌细胞中合成13C-15N标记的蛋白质将来自LB平板上的单菌落（含有重组质粒）接入2-3毫升组合培养基中，37振荡培养12小时（例如，从9:00-21:00），然后接入100毫升组合培养基中；过夜培养后，分别接入三个330毫升（在1升三角瓶中）组合培养基中；当37培养至OD600=0.6-0.7时，加IPTG至终浓度为1 mmol/L，并继续培养4小时，以诱导13C-15N标记蛋白质的合成。第二章蛋白质的纯化和鉴定一、用Ni2+亲和层析柱纯化可溶性蛋白质1.30 ml的过夜培养物加入300 ml（在1升三角

24、瓶中） 含有100 g/ml氨苄青霉素的LB培养液中，在37 振荡培养。2. 当OD600达到0.6-1.0时，加IPTG至终浓度为1 mmol/L 进行诱导表达，培养物继续保温4小时以进行目标蛋白质的累积。3. 4 ，5,000 rpm离心10分钟收集菌体。对于500 ml菌液中的菌体，用20-30ml的start buffer充分悬浮。4. 在冰浴条件下，用超声波破碎细胞（条件为：工作时间3秒，间歇时间10秒，总次数120-200）。5. 4 ，12,000 rpm离心20分钟以去除细胞碎片，上清与Ni2+亲和层析柱混合。6. 上样后，分别用start buffer (20 mmol/L

25、Tris, pH 7.8, 0.5 mol/L NaCl) 和wash buffer （20 mmol/L Tris, pH 7.8, 0.5 mol/L NaCl, 50-100 mmol/L 咪唑）洗脱杂蛋白质，用elution buffer（20 mmol/L Tris, pH 7.8, 0.5 mol/L NaCl, 0.5 mol/L咪唑）洗脱目标蛋白质。二、通过Ni2+亲和层析柱纯化包涵体蛋白质1.5,000 rpm离心15 min。弃培养基，按每500 ml菌体加入20 ml缓冲液A。2.震荡混匀，加入200 l 100 mmol/L PMSF。超声破碎200次（功率为200 W

26、，工作时间为3 s，间隙时间为10 s）。12,000 rpm离心20 min。3.弃上清，沉淀再加入5 ml缓冲液A洗涤1次。12000rpm离心20min。加入6ml盐酸胍溶液，4静置过夜。12000rpm离心20min。按以下步骤处理：（1）用缓冲液B平衡Ni agarose柱。（2）将盐酸胍处理的蛋白质溶液上Ni agarose柱。（3）用约10倍床体积的含25 mmol/L咪唑的缓冲液C洗脱。（4）用约10倍床体积的含40 mmol/L咪唑的缓冲液C洗脱。（5）用约 5倍床体积的含400 mmol/L咪唑的缓冲液C解析下目标蛋白质。缓冲液A： TrisCl (pH8.0) 50 mm

27、ol/ LEDTA 0.5 mmol/ LNaCl 0.4 mmol/ LMgCl 5 mmol/ L甘油 5%盐酸胍溶液：盐酸胍 6 mol/ LTrisCl (pH8.0) 50 mmol/ L甘油 5%缓冲液B：TrisCl (pH 7.9) 10 mmol/ L甘油 10%NaCl 0.5 mmol/ L缓冲液C：TrisCl (pH 7.9) 20 mmol/ L甘油 20%KCl 100 mmol/ L三、透析袋与超滤膜的使用注意事项可用脱盐层析柱、透析袋或超滤膜对蛋白质溶液进行脱盐、缓冲液置换或浓缩。对于透析脱盐，宜采用逐渐降低盐浓度的方式进行。（一）透析袋使用注意事项 1. 应

28、带上一次性薄膜手套操作透析袋。2. 透析袋一般剪成10-20 cm的小段。3. 新透析袋应在2%（w/v）碳酸氢钠和1 mmol/L (pH8.0) EDTA中煮沸10分钟，然后用蒸馏水清洗干净，再用1 mmol/L (pH8.0) EDTA中煮沸10分钟。冷却后，4保存于20%的乙醇中。4. 用过的透析袋需用蒸馏水彻底清洗干净，然后浸于20%的乙醇中，在4保存备用。（二）超滤膜使用注意事项 1. 不要用手直接拿超滤膜，应用平头镊子小心夹取超滤膜的边缘。2. 在 4，10%-20%的乙醇中保存，不要冰冻。3. 使用过的超滤膜应进行再生处理（放在培养皿中，在脱色摇床上进行），具体方案如下:(1)

29、蒸馏水漂洗2分钟。(2)用0.1 mol/L NaOH漂洗10分钟。(3)用蒸馏水漂洗以除去NaOH。(4)70%乙醇浸泡5分钟。(5)用蒸馏水漂洗2分钟，再保存于10%-20%的乙醇中。4.光面向上。5.应避免超滤pH小于3.0或pH大于13的溶液。6.不能与下列溶液混用：（1）胺（2）大于10%的磷酸溶液。（3）大于0.5%的酚溶液。（4）大于0.01 mol/L的盐酸。四、蛋白质浓度的测定 蛋白质的浓度用BCA Protein Assay Kit (pierce 公司) 测定，以牛血清白蛋白为标准。具体方案如下：1. 用Kit中的牛血清白蛋白标样配制成下列不同浓度的标准溶液：2,000

30、g/ml, 1,500 g/ml、1,000 g/ml、750 g/ml、500 g/ml、250 g/ml、125 g/ml及 25 g/ml（0 g/ml=空白溶液）。在这里，配标准溶液所用的稀释剂应与待测样品的相同。 2. 将50体积的BCA试剂A与1体积的试剂B充分混合，从而配成工作溶液。工作溶液最好在测定的当天配制。3. 分别将0.15 ml标准溶液、待测样品及空白溶液与3 ml工作溶液在5 ml离心管中混合，37保温30分钟。然后，迅速用冰浴冷却所有的管。4. 用蒸馏水调零，在562 nm处测定样品的光密度值（最好在10分钟内完成）。5. 从标准溶液和所测样品的562 nm光密度值

31、中减去空白溶液的相应吸收值，即得到净吸收值。然后，以牛血清白蛋白浓度为横坐标，以相应的562 nm净吸收值为纵坐标作标准曲线。用标准曲线判定每个未知样品的浓度。 第三章 DNA-蛋白质相互作用研究方法一、凝胶迁移率变动实验 (gel shift or electrophoretic mobility shift assay)凝胶迁移率变动实验又称凝胶滞留法（gel retardation assay）或迁移率改变法（mobility shift assay），是检测DNA结合蛋白的一种简单迅速而又灵敏可靠的实验方法。凝胶迁移率变动实验的基本原理是：当DNA结合蛋白与相应的DNA片断或寡核苷酸结合而形成DNA-蛋白质复合物后，使DNA片段的分子量及电荷发生改变，因而在聚丙烯酰胺凝胶电泳体系中其电泳迁移率发生改变，通常较游离的DNA片段的泳动速率慢得多，在放射自显影X光胶片上形成一较游离DNA片断滞后的带