毛细管电泳.docx
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毛细管电泳
分离的原因：
电泳迁移，电渗迁移
电泳迁移：
在高压电场下，带电离子向相反的方向移动。
电渗迁移：
当毛细管内充满缓冲溶液时，毛细管壁上的硅羟基发生解离，生成氢离子溶解在溶液中，这样就使毛细管壁带上负电荷与溶液形成双电层，在毛细管的两端加上直流电场后，带正电的溶液就会整体的向负极端移动，这就形成了电渗流。
在操作缓冲溶液中，带电粒子的运动速度等于电泳速度和电渗速度的矢量和，电渗速度一般大于电泳速度，因此即使是阴离子也会从阳极端流向阴极端。
加大缓冲溶液的酸度、在缓冲溶液中加入有机试剂都会减少硅羟基的解离，减小电渗流。
分离模式
毛细管电泳的分离模式有以下几种。
（1）毛细管区带电泳（CZE）将待分析溶液引入毛细管进样一端，施加直流电压后，各组分按各自的电泳流和电渗流的矢量和流向毛细管出口端，按阳离子、中性粒子和阴离子及其电荷大小的顺序通过检测器。
中性组分彼此不能分离。
出峰时间称为迁移时间（tm），相当于高效液相色谱和气相色谱中的保留时间。
（2）毛细管凝胶电泳（CGE）在毛细管中装入单体和引发剂引发聚合反应生成凝胶，这种方法主要用于分析蛋白质、DNA等生物大分子。
另外还可以利用聚合物溶液，如葡聚糖等的筛分作用进行分析，称为毛细管无胶筛分。
有时将它们统称为毛细管筛分电泳，下分为凝胶电泳和无胶筛分两类。
（3）毛细管等速电泳（CITP）采用前导电解质和尾随电解质，在毛细管中充入前导电解质后，进样，电极槽中换用尾随电解质进行电泳分析，带不同电荷的组分迁移至各个狭窄的区带，然后依次通过检测器。
（4）毛细管等电聚焦电泳（CIEF）将毛细管内壁涂覆聚合物减小电渗流，再将样品和两性电解质混合进样，两个电极槽中分别加入酸液和碱液，施加电压后毛细管中的操作电解质溶液逐渐形成pH梯度，各溶质在毛细管中迁移至各自等电点（pI）时变为中性形成聚焦的区带，而后用压力或改变检测器末端电极槽储液的pH值的办法使溶质通过检测器。
（5）胶束电动毛细管色谱（MEKC或MECC）当操作缓冲液中加入大于其临界胶束浓度的离子型表面活性剂时表面活性剂就聚集形成胶束，其亲水端朝外憎水非极性核朝内，溶质则在水和胶束两相间分配，各溶质因分配系数存在差别而被分离。
对于常用的阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠，进样后极强亲水性组分不能进入胶束，随操作缓冲液流过检测器（容量因子k′=0）；极强憎水性组分则进入胶束的核中不再回到水相，最后到达检测器（k′＝∞）。
其他常用的胶束试剂还有阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵，胆酸等。
（6）毛细管电色谱（CEC）将细粒径固定相填充到毛细管中或在毛细管内壁涂覆固定相以电渗流驱动操作缓冲液（有时再加辅助压力）进行分离
在电场作用下，溶液中的带电粒子作定向移动的现象
电渗：
在电场作用下，毛细管或固相多孔物质内液体沿
固体表面移动的现象。
毛细管电泳原理及分析策略
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一、毛细管电泳的基本原理
电泳是指电解质中带电粒子在电场力作用下，以不同的速度向电荷相反方向迁移的现象。
高效毛细管电泳（HPCE），是指离子或带电粒子以毛细管为分离室，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间迁移速度和分配行为上的差异而实现分离的液相分离分析技术。
由于毛细管内径小，表面积和体积的比值大，易于散热，因此毛细管电泳可以减少焦耳热的产生，这是与传统电泳技术的根本区别。
毛细管
HPCE实际上包含电泳、色谱及其相互交叉的内容，是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大进展，它使得分离分析科学从微升级水平进入到纳升级水平，并使得细胞的分析，乃至单分子的分析成为可能。
尤其是对样品珍贵，取样极少的生物大分子，毛细管电泳具有绝对的优势。
其突出特点是：
（1）所需样品量少；
（2）分析速度快，分离效率高，分辨率高，灵敏度高；
（3）分离模式多，开发分析方法容易；
（4）溶剂用量少，经济、环保；
（5）应用范围极广。
毛细管电泳技术可用于分离分析多种组分，如核酸/核苷酸、蛋白质/多肽/氨基酸、糖类/糖蛋白、酶、碱氨基酸、微量元素、小的生物活性分子等的快速分析，以及DNA序列分析和DNA合成中产物纯度测定等，还可用于碱性药物分子及其代谢产物、无机及有机离子/有机酸、手性化合物、单细胞分析、药物与细胞的相互作用和病毒的分析。
毛细管电泳依分离模式不同，可分为：
毛细管区带电泳（CZE）、毛细管胶束电动色谱（MECC/MCKC）、毛细管凝胶电泳（CGE）、毛细管等电聚焦（cIEF）、亲和毛细管电泳（ACE）、毛细管电色谱（CEC）。
下面以最常用的毛细管区带电泳（CZE）为例，探讨毛细管电泳原理及分析策略。
二、毛细管区带电泳
样品在电解液中泳动,根据物质的荷/质比差异来进行分离，比值愈大,跑得愈快。
毛细管带电泳
毛细管区带电泳的进样方式有三种，分别为压力进样、电动进样、浓缩进样，如下图：
方式
常用毛细管规格如图示，毛细管分非涂层毛细管（裸管）和内壁涂层毛细管（涂层管）两类。
分类
非涂层毛细管-电渗流的概念（电渗流是CE中最大的驱动力来源之一）：
电渗流是毛细管内壁表面电荷所引起的管内液体的整体流动，来源于外加电场对管壁溶液双电层的作用。
电渗流的特点：
特点
纯电泳状态：
状态
电渗流+电泳：
电渗流
电渗流的正面作用：
1.增加分离速度；
2.使得正、负电荷物质同时分离。
电渗流的负面作用：
1.减少分离时间和分离有效距离；
2.电渗流的波动极大的影响了迁移时间的重复性。
影响电渗流的因素：
1.PH值：
PH值越高，电渗流越大。
ph值
2.离子强度：
离子强度越高，电渗流越小。
3.缓冲溶液添加剂：
离子型表面活性剂、有机溶剂、环糊精
控制电渗流的三个重要手段：
1.采用涂层毛细管，消除电渗流的影响；
2.改变pH，从而调整电渗流的大小。
pH<3时电渗流很低；当pH>10以后，电渗流基本不增加；
3.添加剂：
有机溶剂可以降低电渗流的大小，从而增加分离的有效距离；表面活性剂可以彻底改变电渗流的方向和大小，主要是在阴离子分析时使用。
CZE中缓冲溶液的影响和选择：
1.在所选的pH范围内有较强缓冲能力；
2.在检测波长处有低的紫外吸收；
3.小的淌度（即大体积、低电荷离子）以降低所产生的电流。
那些被称为生物“优良缓冲液”的，如Tris, borate, CAPS等特别有用，因为这些缓冲溶液中的离子一般较大，能够在较高浓度下使用而不会产生大的电流，但一个潜在的缺点是这些大的缓冲离子有强的紫外吸收。
常用的CE缓冲体系：
1.磷酸钠体系：
宽缓冲范围
2.硼酸钠体系：
高pH范围
3.Tris-HCl体系：
低pH范围
4.醋酸-醋酸铵体系：
CE/MS常用体系
三、CZE分离条件的选择
1.毛细管类型--涂层还是非涂层？
2.毛细管长度--长毛细管还是短毛细管？
3.缓冲液体系--种类和pH值
可先用磷酸缓冲体系为搜寻基础，初步确定（最佳）pH范围后，再进一步细选出更好pH和缓冲试剂。
磷酸盐是毛细管电泳中最常用的缓冲体系之一，它的紫外吸收低，pH缓冲范围比较宽（pH=1.5～13），但电导也比较大。
研究经验表明：
对于蛋白质、肽和氨基酸等两性样品，采用酸性（pH 2）或碱性（pH＞9）分离条件，比较容易得到好的分离结果；糖类样品通常在pH=9～11之间能获得最佳分离；羧酸或其他样品多在pH=5～9之间选择分离条件。
pH 的选择也和所用的毛细管种类有关，许多涂层毛细管只能在一定的pH范围内工作，例如聚丙烯酰胺涂层毛细管，在3＜pH＜8的范围以外工作，其涂层容易水解失效。
在相同的 pH下，不同缓冲体系的分离效果不尽相同，有的可能相差甚远。
一般的经验是，能与样品发生相互作用的试剂，有可能就是最好的试剂。
一个典型的例子是，在分离糖类和DNA等分子时优先使用硼酸盐缓冲体系，因为硼酸根能与糖羟基形成配位键，从而增加糖的负电荷和分离度。
硼酸缓冲试剂也适用于其他含邻位羟基或多羟基化合物的分离。
缓冲试剂及pH调节剂的浓度也需要优化。
缓冲试剂的浓度一般控制在10～200 mmol/L之间。
电导率高的缓冲试剂如磷酸盐和硼砂等，其浓度多控制在20 mmol/L附近，而电导小的试剂如硼酸及HEPES等，其浓度可在100 mmol/L以上。
有时为了抑制蛋白质吸附等特殊目的，可采用很高（＞0.5mol/L）的试剂浓度，此时要注意减少分离电压，分析速度自然也将随之降低。
4.添加剂类型--甲醇、环糊精、乙腈
（1）添加剂的目的：
a改善分离；
b抑制分析物在毛细管上的吸附。
（2）添加剂的选择：
a甲醇、乙腈（百分之五到百分之五十）：
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降低电渗流，增加分离有效距离，从而改善分离效果；
?
增加非极性物质的水溶性。
b环糊精、SDS等表面活性剂：
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增加分离选择性，提高分析效果；
?
降低电渗流，增加分离有效距离，从而改善分离效果。
c非极性高分子聚合物：
?
掩蔽毛细管内壁电荷，抑制分子吸附；
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降低电渗流；
?
形成一定的分子筛，提高分子大小选择性。
5.检测器选择--紫外、二极管阵列、激光诱导荧光
CE检测器种类及性能如下图：
CE检测
小分子检测
（1）有紫外吸收：
首先选择二极管阵列检测器或紫外检测器；
（2）无紫外吸收：
可以衍生化的，可以采用自外衍生的方法再用紫外检测器检测，如氨基酸、还原性糖等；不可以衍生化的，可采用间接紫外法用紫外检测器检测，也可以尝试电化学检测器；
（3）有荧光或需要高灵敏度检测的可采用LIF检测器
（4）需要测定结构或者难以用光学检测器检测的，可以考虑质谱检测
大分子检测
（1）蛋白、核酸：
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可以首先选择紫外检测器；
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如果需要高灵敏度检测可以采用柱前或者柱上衍生的方法标记荧光，然后用LIF检测；
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如果需要特异性检测，可使用特异性荧光探针，标记后再LIF检测；
?
需要测定分子量或氨基酸序列，可采用质谱检测；
（2）多糖：
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含量较高的多糖可以采用末端吸收法以紫外检测器检测；
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含量较低的还原性多糖可用衍生试剂标记后以LIF、UV的方式检测；
四、分离条件选择流程
分离条件的选择是毛细管电泳中最重要但也是最难之处。
不同的专业研究工作者可能会有各自不同的选择策略和流程，我们提出如下九步选择流程，仅供参考：
第一步，尽可能多地了解分离样品的类型、来源、组成及其性质；
第二步，根据样品的可能性质和来源，选择分离模式，若无样品信息可先选CZE；
第三步，根据样品性质确定检测方法，一般先选直接紫外吸收；
第四步，确定样品处理方式，包括衍生方案以及离心过滤除蛋白等；
第五步，根据样品解离常数计算最佳pH，或利用75µmID毛细管和磷酸缓冲体系确定pH范围;
第六步，根据所需pH构建缓冲体系，包括进一步优化pH、缓冲试剂浓度等；
第七步，优化其他操作参数，如毛细管尺寸、分离电压和温度等；
第八步，确定是否需要使用添加剂和使用非水溶剂；
第九步，确定是否需要换用其他分离模式。
在毛细管电泳条件选择中，还应充分注意下列操作事项：
①最好对样品和缓冲液进行过滤或离心处理。
②毛细管的洗涤或平衡，与缓冲体系、pH以及柱子有关。
磷酸根与石英和玻璃之间存在慢相互作用，需要延长平衡或冲洗时间，处理的时间应由分离重现性决定。
③欲降低缓冲液的电导，应尽量使用所谓的“生物缓冲试剂”；欲降低检测背景，则应尽量使用无机缓冲试剂。
④欲保持分离重现，要尽量采用相同的条件，包括毛细管、缓冲液、温度、电压、洗涤等。
五、各类物质的分离要点
1.阴离子及有机酸：
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此类物质没有紫外吸收，要采用间接检测法
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间接紫外法一般以铬酸钠等物质作为背景吸收物
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CTAB通常用作电渗流反向剂，以加速出峰，提高峰的尖锐度
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要使用反向极性分离
2.阳离子及金属离子的分离：
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此类物质没有紫外吸收，要采用间接检测法
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间接紫外法一般以氨基吡啶等物质作为背景吸收物
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与阴离子不同的是阳离子的分析不需要在缓冲溶液中添加电渗流反向试剂
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也不需要使用反向极性分离
3.易电离有极性的化合物：
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一般采用长60cm的毛细管
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分离的最佳pH在分析物pKa正负1左右
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通常不需要添加剂
4.弱极性物质和水溶性差的物质（一些中药成分、农药等）：
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要注意分析物的溶解性，防止在毛细管中的沉淀
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通过有机溶剂的添加，提高分析物在buffer中的溶解度
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添加SDS，增加溶解度
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降低样品中分析物的浓度，延长ramp time也可以防止分析物的析出
5.还原性的单糖、寡糖和多糖（葡萄糖、半乳糖等及其聚合物）：
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通常无紫外和荧光，注意检测问题
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可用APTS等衍生试剂衍生，使其带上电荷和紫外/荧光基团
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多糖也可以采用末端吸收来检测（180-200nm），不需要衍生化处理，但是要尽量采用高pH使得羟基部分电离带电
6.非还原性的单糖、寡糖和多糖：
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很难采用衍生的方法检测，通常对单糖和寡糖采用间接检测法
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对多糖采用末端吸收的方法来检测
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通常采用高pH使得羟基部分电离带电
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高pH缓冲液还有防止多糖在毛细管内壁吸附的作用
7.单链核苷酸、双链核苷酸片断及PCR产物：
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容易在毛细管内壁吸附，通常需要使用涂层管或者对毛细管进行动态涂层
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分子筛原理，凝胶的种类和浓度决定了分辨率的最佳范围和大小
8.多肽及蛋白质：
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一般来说小的肽段不需要考虑在毛细管内壁的吸附问题
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对于大的肽段和蛋白质一定要考虑在毛细管内壁的吸附，可采用极端pH和涂层毛细管的方法来避免吸附
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在使用极端pH条件的时候，通常都是用正向电压分离
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在使用涂层毛细管时通常没有电渗流，而蛋白是两性物质，需要仔细考虑使用涂层管时的分离极性
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