实验二质粒的酶切鉴定及片段回收
一、小量酶解反应
主要应用于质粒的酶切鉴定。
10ul反应体积中含1gDNA，酶切反应体系如下：
质粒DNA1L
10×缓冲液1L
两种限制酶各0.5L+0.5L
双蒸去离子水7L
总体积10L
[操作方法]
按下列顺序加入试剂：
（1）在一灭菌的新的Ep管中加入7ul双蒸水。
（2）加入10×缓冲液1L。
（3）加限制酶KpnI0.5L，SacI0.5L。
（4）最后加入质粒DNAlL。
（5）稍离心，混合。
（6）37℃水浴1—1.5h。
（7）取出后电泳分析鉴定是否酶解。
[注意事项]
（1）双蒸水为可变体积，当其它反应成分确定后，用双蒸水将反应体积补足。
（2）质粒DNA最后加入，以防止操作不当引起试剂的污染。
（3）大多数限制酶均加50％甘油缓冲液置于-20℃保存，其活力，稳定，但在配制反应混合物时，酶的加入量要准确限制小于总体积的l／10，否则甘油会抑制酶解反应。
二、冻溶法从琼脂糖凝胶中回收DNA
在重组DNA或探针标记等实验中，常常需要从凝胶中回收和纯化DNA，常用的回收方法有：
压碎浸泡法、透析袋洗脱法、低熔点琼脂糖法和DEAE—纤维素膜法等。
[操作方法]
（1）从琼脂糖凝胶中将含有拟回收DNA片段的胶块切下，置于Ep管内。
（2）用一次性注射器将胶由针头处挤入Ep管内，加等体积Tris平衡酚混匀后，置液氮10min。
（3）取出离心，5000g，5min。
（4）小心地将水相转移至另一Ep管中。
（5）加等体积酚：
氯仿（1：
1）充分混匀。
离心，5000g，5min。
（6）将水相转移Ep管中，加等体积氯仿：
异戊醇（49：
1）充分混匀。
（7）离心，5000g，5min。
（8）在转移出的水相中加1／10体积3mol乙酸钠（pH5.2）和2.5倍体积的预冷的无水乙醇置-30℃30min。
（9）离心，12000g，15min．
（10）弃上清，加预冷的70％乙醇1ml，12000g，离心5min。
弃上清，室温放置数分钟。
（11）将沉淀用20ulTE缓冲液（pH8.0）溶解，-20℃保存备用。
实验三真核细胞总RNA的制备
从细胞中分离RNA的纯度于完整性对于许多分子生物学实验至关重要。
如Northern印迹与杂交分析、寡聚（dT）纤维素选择分离mRNA，cDNA合成及体外翻译等实验的成败，在很大程度上决定于RNA的质量。
RNA分离的最关键因素是尽量减少RNA酶的污染。
快速一步法提取总RNA
组织及有核细胞在匀浆过程中被变性液破膜、溶解，变性剂抑制RNA酶的活性，并使蛋白质变性及与核酸分离。
经酸酚/氯仿将RNA抽提至水相，与DNA和蛋白质分离，再经异丙醇沉淀回收总RNA。
【试剂】
1×CSB缓冲液：
柠檬酸三钠25mmol/LpH7.0
十二烷基肌苷酸钠0.5%
巯基乙醇0.1mol/L
配制100ml5×CS缓冲液：
柠檬酸三钠3.6762，十二烷基肌苷酸钠2.5g溶于100ml0.05％DEPC水中，过滤，15lb/in2，20min，去DEPC，4C保存。
用前100ml工作液加巯基乙醇700l。
4mol/L异硫氰酸胍变性缓冲液：
47.26g异硫氰酸胍加至100mlCSB缓冲液中。
配制：
23.63g异硫氰酸胍加热65C溶于20ml无RNase水中，加10ml5×CS，加350l巯基乙醇，用无RNase的水定量至50ml。
（约加25ml水）
2mol/L乙酸钠NaAc（pH4.0）：
16.4g乙酸钠加至0.05％DEPC水40ml，用冰乙酸调pH至4.0，定容至100ml，分装，高压20min去除DEPC。
3mol/L乙酸钠NaAc（pH5.2）:
24.6g乙酸钠加至0.05％DEPC水80ml，用冰乙酸调pH至5.2，定容至100ml，分装，高压20分钟去除DEPC。
水饱和酚（酸酚，pH4.0）：
取重蒸酚200ml，于65C水浴溶解，加100ml无RNase水混匀，静置，取上层水相（大部分），加0.2g8巯基喹啉，混匀，保存于棕色广口瓶，4C待用。
【操作方法】
1．组织匀浆：
新鲜的或液氮冻存的组织，称重后，按100mg组织/ml变性液，匀浆。
置冰上30min。
培养细胞：
贴壁细胞用PBS洗2次后，直接加2ml变性缓冲液/瓶；悬浮细胞用PBS洗沉淀2次，按107细胞/ml变性缓冲液，置冰上30min。
2．取0.5ml粘稠液体加入1.5mlEppendorf管（10ml塑料离心管）中，加50l（1/10体积）2mol/LNaAc（pH4.0），混匀。
3．加0.5ml（等体积）酚和100l（1/10体积的）氯仿：
异戊醇（49:
1），振荡混匀，冰浴10min。
4．4C，12000g，20min。
5．吸上层水相入新管，加等体积异丙醇，-20C，至少1hr。
6．4C，12000g，20min。
7．弃上清，沉淀用1ml预冷的70%乙醇漂洗，并移入Eppendorf管。
8．4C，12000g，10min。
9．弃上清，室温干燥蒸发残存乙醇，数分钟。
10．加100l水溶解RNA，测含量。
11．加1／10体积3mol乙酸钠（pH5.2）和2.5倍体积预冷的无水乙醇置-30℃30min。
12．离心，12000g，15min．
13．弃上清，加预冷的70％乙醇1ml，12000g，离心5min。
弃上清，室温放置数分钟。
溶解RNA：
每20gRNA加4.5l水溶解RNA，4℃存放待转膜（不宜久放）。
TotalRNAIsolation
Guanidine-basedisolation
Objective:
ToobtaintotalRNAfromzebrafishembryos.
RequiredMaterials
∙DenaturingSolutionorSolution"D"
∙2MNaOACpH4
∙Phenol,H2Osaturated
∙49:
1Chloroform/Isoamylalcohol
∙Isoproponal
∙75%EtOH
∙DEPC-treatedH2Oorfreshlydeionizedformamide
∙1mLsyringe
∙20gaugeneedle
∙1.5mLmicrocentrifugetubes
∙microcentrifuge
Procedures
Start=>Collectedzebrafishembryosofdesireddevelopmentalstage,etc.
1.RemoveexcessH2Ofromembryos.
2.Usinga1mLsyringewitha20gaugeneedle,addtheappropriateamount（consultTable1）ofsolution"D"totheembryos.
3.Homogenizetheembryosbypassagethroughthesyringeneedle（5-8）times.Todecreasethevolumeoffrothyhomogenateandcheckthestatusoftheembryos,brieflypulseinamicrocentrifugeatlowspeed.Ifthereisapelletofembryonictissue,continuetohomogenatewiththesyringeneedle.Ifnot,continuewiththeextraction.
oThehomogenatescanbesafelystoredat-80°C.
4.Add2MNaOAcpH4（consultTable1）,andmixbyinversion.
5.Addphenolandchloroform:
isoamylalcohol,vortex,andincubateonicefor5-10'.
6.Centrifugeat14,000rpmfor2-3'at4°C,andtransferupperaqueousphasetoanewmicrocentrifugetube.
7.Add100%IsopropanoltoprecipitateRNA.Incubatesamplesat-20°Cforatleast30'.
8.Centrifugeat14,000rpmfor10'at4°C,anddiscardsupernatantinwastecontainer.
9.DissolvetheRNApelletinsolution"D",andtransfer10μLtoanewmicrocentrifugetube.
10.PrecipitateRNAbyaddingequalvolumesof100%isopropanol.Incubatesamplesat-20°Cforatleast30'.
11.Centrifugeat14,000rpmfor10'at4°C,anddiscardsupernatantinwastecontainer.
12.Washpelletbyadding75%EtOH.
oIfRNAistobestored,leavemajorityofRNAprecipitatedinthe75%EtOHat-80°C.Continuewiththe10μLaliquottodetermineapproximateconcentrationandintegrityofrRNAbands.
13.Centrifugeat14,000rpmfor10'at4°C,anddiscardsupernatantinwastecontainer.
14.Pulsethepellettocollectremainingsupernatantwithapipettip.Allowthepellettoairdryoruseavacuum.
15.ResuspendinDEPC-treatedH2Oorformamide.
oSuspensioninformamideprotectstheRNAfromdegradationbyRNases,butformostapplicationstheRNAshouldbeprecipitatedfromtheformamidebyadding4volumesof100%EtOHandcentrifugingat14,000rpmfor10'at4°C.,
16.QuantitateRNAbydiluting1μLinto100μLwithalkalineH2O（seebelow）.ThendeterminetheA260andA280.
oWaterusedforspectrophotometricmeasurementofRNAshouldhaveapHof>7.5.AcidicpHaffectstheUVabsorptionspectrumofRNAandsignificantlydecreasestheA260/A280.AdjustwatertoaslightlyalkalinepHbyaddingconcentratedNa2HPO4solutiontoafinalconcentrationof1mM.
实验四RNA甲醛变性凝胶电泳和转膜
从组织或细胞中提取出来的核酸（DNA/RNA）经琼脂糖凝胶电泳将其按分子量的大小分离，然后将其转移到固相支持物上（如：
硝酸纤维素膜），用被标记的已知核酸片断（探针）对固相支持物上的待检测核酸进行检测（杂交）。
一、RNA电泳（甲醛变性电泳）
【目的】将DNA/RNA通过凝胶电泳使之在凝胶中分离出来，通过加入标准核酸分子（markers）对其进行鉴定，并用于转膜、杂交等。
【试剂】
10×MOPS缓冲液：
0.2mol/LMOPS（3-〔N-吗啉〕丙磺酸）
80mmol/LNaAc
10mmol/LEDTANa2
先用400mlDEPC水溶解20.6gMOPS和4.1gNaAc后，加入10ml0.5mol/LEDTA，定容500ml。
用0.22m滤器过滤除菌，避光保存。
1×MOPS电泳缓冲液：
10×MOPS150ml
37%甲醛80ml
加水至1500ml。
甲醛凝胶变性RNA电泳加样缓冲液（10×）：
50％甘油
1mmol/LEDTA
0.25％溴酚蓝
0.25％二甲苯青FF
5ml甘油、20l0.5mol/LEDTA、25mg溴酚蓝、25mg二甲苯青FF，加DEPC水至10ml，高压后，4C保存。
5mol/LEDTA（pH8.0）
37％甲醛、甲酰胺等。
【操作步骤】
1．电泳槽用0.3%H2O2浸泡30min，DEPC水冲洗晾干。
2．铺胶（20ml）
琼脂糖0.24g（1.2%）
无RNase水17.4ml
10×MOPS2.0ml
37%甲醛0.6ml
EB1l
将琼脂糖加水融化后，加10×MOPS，待胶冷却至60C左右，再加甲醛和EB。
（若铺大胶可将上述各试剂的量加大2倍）。
3．RNA样品处理（以一条泳道为例）
10×MOPS1.0l
37%甲醛3.5l
甲酰胺10.0l
RNA样品4.5l（20gRNA）
于65变性15min，冰浴冷却。
经此处理的RNA样品，-70C可存放半年。
4．加2.0l甲醛凝胶加样缓冲液（10×）
5．加样和电泳
将凝胶预电泳5min，电压降为5v/cm。
随后加样品和标准物，以3－4v/cm电压降电泳，电泳液为1×MOPS电泳缓冲液。
直至溴酚蓝迁移至胶下游的3/4处。
6．电泳结束后，在紫外灯下，仔细测量28SrRNA和18SrRNA至加样孔的距离，并同荧光尺一起拍照，以记录标准物的位置。
【注意事项】
1．每一泳道至多可分析30gRNA，通常用10-20g总RNA进行Northern杂交，可以检测高丰度mRNA（占mRNA总量的0.1%以上）；如待测RNA含量极微，每个泳道加0.5-3.0gpoly（A）+RNA。
2．标准物28SrRNA6333base；18SrRNA2366base；9S兔珠蛋白mRNA710base。
溴酚蓝在前（300bp），二甲苯青FF在后（4kb）。
二、RNA样品的转膜（虹吸印迹法）
【试剂】
20×SSC：
175.3gNaCl，88.2g柠檬酸钠，DEPC水定容1000ml
NaOH调pH至7.0，高压后备用。
6×SSC：
用20×SSC稀释。
【操作步骤】
1．将电泳后的凝胶用蒸流水漂洗2min，20×SSC浸泡30min。
2．剪一与凝胶大小相等的硝酸纤维素膜，用蒸流水浸湿后放入20×SSC中。
3．在方盘上放置一平板，其上放置一滤纸，滤纸两端搭入盘内浸入20×SSC中。
4．将凝胶倒置于平台上,底面朝上，切掉右下角，并用保鲜膜封闭四周。
5．将硝酸纤维素膜放于胶上，赶走气泡。
6．膜上放两张滤纸，其上再放20层吸水纸。
7．吸水纸上放一平板，其上放500g左右的重物。
8．室温下过夜转膜，期间换纸2－3次。
9．完成转膜后，在紫外灯下观察效果，并标记好序号、加样孔位置和28S，18S的位置。
10．用6×SSC浸泡硝酸纤维素膜5分钟，滤纸吸干，80C烤箱真空干燥2小时。
室温保存。
实验五核酸分子探针的标记
随机引物法标记cDNA探针随机引物是指含有各种可能排列顺序的寡聚核苷酸片断的混合物，因此它可以与任意核苷酸序列杂交，起到聚合酶反应的引物作用。
将待标记的DNA探针片断变性后与随机引物一起杂交，然后以此杂交的寡聚核苷酸为引物，在大肠杆菌DNA聚合酶I大断段（KlenowFragment）催化下，合成与探针DNA互补的DNA链，当在反应体系中含有-32P-dNTP时，即形成放射性同位素标记的DNA探针。
【试剂】随机引物试剂盒（promega）
终止缓冲液：
0.2mol/LEDTA（pH8.0）
【操作步骤】
1．探针100ng溶于8μl水中（1.5mlEppendorf管），1000C，5min变性（双链者打开双链），冰浴骤冷，离心片刻。
2．标记程序：
终浓度
waterμl
5×Labellingbuffer10µl1×
mixdNTP（dATPdGTPdTTP）2μl20μΜ/each
变性的cDNA模板25ng500ng/ml
BSA（牛血清白蛋白）2μl400μg/ml
Klenow5u100u/ml
-32P-dCTP5μl（50µci）333nM
总体积50μl
3．离心片刻，混匀。
370C，1hr或室温3－12hr。
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