综述无缝克隆与基因融合中文版_精品文档.docx
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无缝克隆与基因融合
基因融合技术是基因功能研究的关键工具。
准确拼接的杂合分子，没有任何无关的序列，使我们可以对分子进行精确的研究。
本篇综述介绍了无缝融合基因和蛋白的应用，以及获得这些杂交分子的方法
前言
随着各种基因组测序项目的完成，人们越来越关注基因产物的功能分析。
基因融合技术在基因功能研究的许多方面具有重要的作用，包括基因和蛋白标记，报告基因的研究，结构域互换研究，突变研究和基因敲除或者插入实验。
传统的基因融合技术涉及到typeII限制酶消化和DNA连接反应（所谓的剪切/粘贴反应），曾被用来作为构建杂交基因的标准方法。
然而，这种方法常常会在接合处留下操作的序列，例如酶切位点。
这些多余的序列可以改变DNA元件的间隔，在接合处引入多余的氨基酸残基，可能对融合蛋白的结构和功能产生不需要的影响，因此影响对融合基因精确的研究。
这篇综述讨论了精确融合基因的应用之处，概括了实现无缝基因融合的方法。
无缝基因融合及其应用
无缝克隆和基因融合就是将两个或者更多DNA片段精确结合在一起，在DNA片段的接合处没有任何不需要的序列。
这是获得杂交基因的理想情况。
以下强调几个例子，以表明无缝基因融合的重要性。
启动子和外显子研究
基因启动子含有许多调控元件。
转录因子与它们结合并互相影响来调控转录。
启动子删除分析使我们鉴定到这些功能元件，获得关于基因调控机制的重要信息。
然而，因为不同调控元件之间的间隔常常是非常重要的，通常需要长度不变的linker来维持这些元件的间隔和螺旋面。
基因启动子的linker扫描分析需要无缝DNA融合或者序列替换技术。
分子演化方法例如外显子和DNA转移来获得具有需要生化和/或生理特征的蛋白也需要不同功能元件的无缝拼接。
在真核细胞中，通过内含子介导的RNA拼接可以构建嵌合体基因和/或蛋白。
在这些实验中RNA底物的合成和/或外显子标记核酶需要认真的设计，得到嵌合体前体基因。
只要杂合基因形成正确，无缝融合就可以通过拼接实现。
蛋白质功能研究和蛋白质工程
蛋白质由有功能结构域构成。
为了阐述一个蛋白某个结构域的功能，需要构建该结构域删除或者被相似结构域替换的突变体。
这种结构域删除或者互换实验将在很大程度上得益于相关元件的无缝融合，来消除有操作序列所带来的潜在的负面影响。
更加概括地说，不同结构域的无缝融合对于蛋白质工程是非常重要的，包括获得新的杂交分子和抗体改造。
对于抗体改造，互补决定区嫁接（CDR-grafting）和定点突变是经常要做的。
嵌合体蛋白也可以通过內含肽介导的蛋白拼接和连接获得。
只要含有內含肽的前体蛋白没有多余的序列，精确蛋白融合就可以实现。
蛋白质表达
标签和融合伴侣的使用促进了蛋白质的表达。
它们赋予蛋白的可溶性和稳定性并促进接下来的目的蛋白的亲和纯化。
在目的蛋白的活性不受到融合伴侣或者标签影响的情况下，整个融合蛋白可以直接用到接下来的研究中。
对于酶学研究和测定，通常是这种情况。
然而，在许多情况下，移除融合蛋白是必要的，这可以通过改造的蛋白酶酶切位点来完成。
这个过程需要蛋白酶切位点和目的蛋白之间无缝的连接。
为了进行功能研究，在一些情况下携带一个短标签（比如his标签）的融合蛋白被成功地结晶，移除这个标签是不必要的。
然而，如果带有标签的蛋白无法结晶，就难以估量标签的影响，标签的切除通常是必要的。
在表达成熟和有活性蛋白的过程中，常常需要表达蛋白氨基酸序列与原来的一样。
例如RANTES（调控激活，正常的T表达和分泌）蛋白，interleukin-18（IL-18），IL-1β和hirudin蛋白的表达。
在这些蛋白的N端加上甲硫氨酸残基严重地降低了这些蛋白的活性。
对于RANTES，Met-RANTES被发现是天然RANTES的拮抗剂。
如果要在大肠杆菌中表达完整N端蛋白，一个实用的方法就是将蛋白与N端标签融合表达并纯化。
纯化和重折叠（如果需要）之后，通过专一改造的蛋白酶酶切位点将标签和不需要的序列切除。
这个过程需要蛋白酶切位点和目的蛋白之间的无缝拼接。
肠激酶，Xa因子和泛素特异性蛋白酶（Ubps）是常用的酶，这些酶可以切开识别序列的C端。
烟草蚀刻病毒蛋白酶对于酶切位点下游的氨基酸残基要求比较宽松，也可以用来去除融合标签。
ubiquitin/Ubp可能是第一个用来在体内和体外获得完整N端蛋白蛋白的系统。
在大肠杆菌中表达成熟的人类ApoA-I蛋白，Mogilevsky和同事发现泛素标签系统是最直接的方法之一。
基因组操纵
在模式生物中目的基因的敲除和敲入技术是体内分析基因功能的有力工具。
这个过程常常包括整个开放阅读框或者一部分编码特殊结构结构域的基因的删除，在一些情况下利用一个等位基因突变体或者同源基因序列的替换。
这些研究需要产生敲出和敲入的载体，在其中所有的功能元件包括侧翼序列，需要同源重组精确地连接到一起。
无缝基因融合技术将会显著地促进载体构建。
Link及其同事利用重叠PCR技术获得基因精确删除的载体，用以在大肠杆菌基因组中进行功能研究。
为了进行动物病毒繁荣分子和病理学研究和疫苗载体开发，经常需要合成整个病毒基因组或者改造杂交病毒载体。
利用无缝基因融合技术看，Tount和同事用PCR片段成功地拼接了31.5Kb的重组病毒基因。
无缝基因融合技术
在PCR技术发明之前，DNA片段的无缝融合是通过复杂的程序完成的，涉及到利用细菌的基于噬菌体M113的定点突变，多核苷酸引物，linker和核酸外切酶，质粒在大肠杆菌中扩增。
在一些情况下需要利用RecA依赖的同源重组。
这些过程需要仔细的设计载体，需要复杂的程序。
由于传统方法的局限，仅仅有几例利用这些方法进行无缝基因融合。
一个例子就是利用一组突变载体进行基因启动子的link扫描分析，另一个就是酵母中蛋白稳定性分析。
随着PCR技术的出现，无缝基因融合有了很大的发展。
已经发展了几种无缝基因融合的方法，许多其他方法经过修饰也可以用于此目的。
这些方法将在下面讨论并列举在表1中。
PCR常常是用来进行精确的DNA操控或者修饰DNA元件的末端用来进行合适的基因融合。
利用这些创新的方法，我们操控DNA序列的水平达到了一个前所未有的水平。
例如，在研究P1’氨基酸残基对肠激酶酶切融合蛋白的影响中，通过一种PCR和连接不依赖克隆的无缝基因融合技术构建了20个GST–EK–X–calmodulin融合基因（其中X代表20个氨基酸的一种，GST是谷胱甘肽-S转移酶）。
重叠PCR
在PCR技术发明之后就出现了重叠PCR技术。
重叠PCr是一种非常有效的过程，不依赖与任和限制性酶切位点，在片段都可以扩增的前体下，任何两个片段都可以在任何确定的位点自由地结合到一起。
利用相同的原则，多个DNA片段可以无缝拼接到一起，并成功地获得了20kB的重组融合基因。
重叠PCR已经被用以无缝的方式来进行点突变，插入，删除和替换到一个基因的任何位置。
PCR获得的融合基因随后可以克隆到合适的载体以进行下游应用。
需要主意的是，重叠PCR的一个特例是基因合成，互相重叠的多核苷酸被用来作为PCR模板进行基因拼接。
如果没有合适的模板DNA进行PCR扩增，或/和杂交基因相对较短（500bp），就可以采用这种方法。
定点突变
定点突变，包括点突变，插入，删除和替换，是在包含一个目的基因的环形质粒模板上进行。
删除，插入或者替换突变通常是通过PCR完成。
反相PCR利用两个方向相反的引物去扩增质粒，得到质粒任何位点点突变，删除和插入的突变体。
然而，PCR步骤会潜在地在质粒中引入错误序列。
这个问题可以通过QuickChangeemutagenesistechnology解决。
如图2所示，该方法依赖于两条完全互补的突变引物和PfuDNA聚合酶。
因为引物彼此是完全互补的而且Pfu没有链替换活性，在热循环过程中，突变的双链是以原始DNA为模板线性扩增的。
因此，这种设计避免了DNA合成过程中错误的扩增。
QuickChange技术及其改进技术可以用来在模板DNA的任何位点进行DNA插入，删除或者序列替换，甚至可以同时将多个片段插入模板中。
IIS型内切酶的应用
IIS型限制性内切酶是一类可以从酶切位点外部将DNA切开的酶，例如SapI,BsaIa和FokI。
它们被用来得到PCR片段的粘性末端，进行基因和病毒基因组的拼接。
对于一些通用的基因，例如用于蛋白表达的纯化标签（例如麦芽糖结合蛋白），这个基因通常先插入表达载体。
然后，这个载体可以作为受体，将不同的片段通过无缝克隆插入该载体。
Stratagene的pCal.n.EK载体是一个大肠杆菌表达载体，包含T7/lacO–CBP–EK–MCS表达序列（CBP：
钙结合肽。
MCS：
开放阅读框）。
利用typeIIS内切酶Eam1104可以将目的基因DRF无缝地融合到CBP-EK的下游。
CBP-EK-ORF融合蛋白表达和纯化后，用肠激酶切除CBP-EK多肽，可以得到完整的目的重组蛋白。
在IMPACTM载体pTYB和pTWIN中，利用SapI可以使目的蛋白的ORF与內含肽无缝融合，以进行蛋白表达和随后的蛋白拼接。
IIS型限制性酶切位点也被用来构建目的载体以进行无缝克隆，使一个DNA片段与载体中已存在的DNA片段无缝融合。
这是通过在质粒上的反向PCR实现的，引物包含IIS型限制位点。
然后进行限制性酶切，得到带有所需要粘性末端的载体。
值得一提的是，基于IIS型限制性内切酶的方法需要同时消化载体和待插入的DNA片段。
如果在DNA片段内部含有某种IIS型内切酶的酶切位点，可以将该位点甲基化，来抑制酶将片段从中间切开。
或者换一种IIS型内切酶。
片段和载体可以如图3a所示拼接在一起。
连接非依赖克隆（LIC）
为了克服传统构建杂交基因的剪切/粘贴方法的限制，人们开发了LIC克隆，不依赖与限制性内切酶和连接，将PCR片段克隆到载体中。
该方法依赖于具有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶（T4或者Pfu聚合酶）,在DNA片段5’端产生12个碱基的单链。
因为其独特的特征，LIC已经被用来无缝连接编码蛋白结构域的ORF，进行蛋白质的表达。
利用含有核糖核苷的嵌合引物进行PCR，用其他试剂比如尿嘧啶DNA糖苷酶或者rare-earthmetalions处理PCR产物，也可以得到粘性末端。
Jarrell及其同事采用包含三个连续的核糖核苷或者一个2’-O-甲基化核糖核苷来终止DNA在互补链的合成，在PCR过程中得到单链末端。
应为这种方法简单，可以促进高通量克隆实验。
In-FusionTMPCR克隆系统可以将末端含有与载体片段末端有15bp同源序列的片段克隆到任何线性化载体。
然而，这种酶的成分还没有公开。
因为末端对于这种反省是非常重要的，载体片段需要特殊的处理，来实现插入片段与载体中已存在的ORF无缝融合。
载体片段可以通过反向PCR制备或者用IIS型限制性内切酶处理，去除不需要的序列。
In-FusionTM是迄今为止最为直接的PCR克隆系统，它将会促进PCR克隆的自动化。
体内重组
同源重组可以使含有同源区域的分子中的遗传序列相互交换。
因为同源重组的位点可以自由地选择，利用同源重组可以进行基因的无缝操作。
这个过程曾被用于等位基因的替换，研究大肠杆菌和酵母细胞中基因的功能。
这通常是一个两步同源重组的过程。
首先将带有正选择标记和负选择标记的环形质粒整合到染色体或者附加型载体目的ORF的特异位点上。
重组子通过正选择标记筛选。
接下来，通过负选择标记反向选择，用另外一个包含修饰ORF的片段替换选择的片段。
在这个过程中，基因是以无缝的方式在染色体上操作的。
在酵母中，基因的在质粒上的操作是通过一步缺口修复完成，只需要30bp的同源臂。
使用PCR技术，用来进行缺口修复实验的杂交载体可以利用删除，插入和序列替换构建。
酵母-大肠杆菌-哺乳动物穿梭载体，被用来在酿酒酵母中构建无缝融合基因，然后在大肠杆菌回收质粒。
大肠杆菌中的同源重组有三种机制：
RecA依赖,RecA非依赖和Red/ET依赖。
RecA结合到单链DNA片段，促进单链侵入并在同源序列见交换。
RecA-
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