TS7JY013异烟肼片微生物限度检查方法确认方案.docx

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TS7JY013异烟肼片微生物限度检查方法确认方案

项目负责人：

QC主管

确认类别：

方法验证

确认小组主要成员：

部门

质量部

质量部

质量部质量部质量部

质量部

姓名

职位

QC主管

验证管理员

确认领导小组审查汇签：

姓名

部门

职务或岗位

签字日期

质量部

QC主管

质量部

QA主管

质量部

质量受权人

1.

主题内容

本方案规定了异烟肼片微生物限度检查方法的验证方法及标准。

2.验证概述

我公司生产异烟肼片微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、大肠埃希菌。

参照《中国药典》2015版四部附录1105：

微生物计数法，以及1106：

控制菌检查法的规定，本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证。

通过验证以确认所采用的微生物限度检查方法适用性。

异烟肼片处方中含有异烟肼以及常用辅料成分，异烟肼对细菌有抑菌特性，对霉菌和酵母菌无抑菌活性。

异烟肼在水中易溶用薄膜过滤可去除其对微生物生长的影响。

本验证方案通过试验菌株的回收率测试，首先确认常规倾注平皿法是否适用于本品的微生物限度检查；如常规倾注平皿法不适用，则进一步验证可去除供试品抑菌物质的薄膜过滤法是否适用于本品的微生物限度检查。

本验证方案根据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。

对异烟肼片微生物限度检查方法适用性进行验证。

3.验证依据

3.1.《验证与确认管理规程》、《微生物限度检查SOP》

3.2.中国药典（2015年版）四部：

（1105）非无菌产品微生物限度检查：

微生物计数法；（1106）非无

菌产品微生物限度检查：

控制菌检查法。

4.验证目的

验证异烟肼片（100mg）微生物限度检查方法的可靠性。

5.实施验证人员及职责

部门

人员

职责及分工

质量部

QC检验员

负责根据验证方案对微生物限度方法进行适用性检查，出据检

验报告。

QA主管/验证管理员

负责验证文件的审核，负责确认工作的组织与协调。

QC主管

项目负责人，验证文件（方案）的起草，对现场对操作过程进行指导。

对验证实施过程中资料和数据进行汇总并完成验证报告。

质量受权人

组织验证工作的实施及各部门的协调，负责验证方案及报告的

批准。

6.验证内容

验证前准备

6.1.1.文件准备

6.1.1.1.现场备《微生物限度检查法SOP》、《培养基及检定菌管理规程》、《药品微生物限度检查方

法确认方案》及相关的验证记录，并填写验证文件准备验证表（附表1）。

6.1.2.验证主要仪器准备：

经检定或确认合格并处于有效期内的需氧菌培养箱、霉菌和酵母菌培养箱、生化培养箱、温度计等，填写《主要检验仪器设备确认表》，见附表2。

6.1.3.验证用空调系统及部分设备的确认/验证情况

检查微生物限度检查室空调系统已经确认并合格、用于灭菌的高压蒸汽灭菌器已经确认并合格、超净工作台、生物安全柜等已经确认并合格，填写《确认相关确认记录表》，见附表3。

6.1.4.确认验证用试剂、培养基等的有效期

确认验证用试剂、培养基等在有效期内且质量符合要求，培养基经适用性检查应符合规定。

确认情况填写《试剂、培养基确认表》，见附表4。

6.1.5.检定菌确认

确认用于试验的检定菌在有效期内并生长良好，传代代数不超过第五代。

确认情况填写《检定菌确认表》，见附表5。

6.1.6.培训

确认方案起草人在方案批准后对本次确认相关人员进行培训，并记录在相关附件中。

如果在确认中涉及到其他培训，培训记录的复印件附在确认报告中。

记录见附表6培训记录。

验证方法：

6.1.7.供试品计数方法适用性试验

6.1.7.1.试验菌液的制备和使用表

试验菌株

试验菌液的制备

需氧菌总数计数

霉菌和酵母菌总数计数

金黄色葡萄球菌〔CMCC（B）26003〕

胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基，培养温度30～35℃，培养时间18～24小时

胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度30～35℃，培养时间不超过3天，接种量不大于100cfu

铜绿假单胞菌〔CMCC（B）10104〕

胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基，培养温度30～35℃，培养时间18～24小时

胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度30～35℃，培养时间不超过3天，接种量不大于100cfu

枯草芽孢杆菌〔CMCC（B）63501〕

胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基，培养温度30～35℃，培养时间18～24小时

胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度30～35℃，培养时间不超过3天，接种量不大于100cfu

白色念珠球菌〔CMCC（F）〕98001]

沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基，培养温度20～25℃，培养时间2～3天

胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度30～35℃，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu

沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度20～25℃，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu

黑曲霉〔CMCC（F）98003

沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度20～25℃，培养时间5～7天，或直到获得丰富的孢子

胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度30～35℃，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu

沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度20～25℃，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu

6.1.7.2.需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备：

6.1.7.2.1.菌液制备：

分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10ml胰酪大豆胨液体培养基中，30～35℃培养18～24小时，取此培养液1ml加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-7,制成50～100cfu/ml的菌悬液备用。

6.1.7.2.2.接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养2～3天，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-7，制成50～100cfu/ml的菌悬液备用。

6.1.7.2.3.接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面上，20～25℃培养5～7天，直到获得丰富的孢子。

加入3～5ml含有0.05%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱，吸至无菌试管中，取1ml加含有0.05%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-7，制成50～100cfu/m的孢子悬液备用。

菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在2～8℃，可在24小时内使用。

黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。

6.1.7.3.需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证

6.1.7.3.1.供试液制备：

取供试品，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，稀释制成1：

10供试液。

必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释成1:

100、1:

1000。

6.1.7.3.2.试验组：

取1：

10的供试液1ml和6.2.1.2项下制备的50～100cfu的试验菌，分别注入平皿中，立即倾注不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。

置30～35℃培养箱中培养3天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。

另取1：

10的供试液1ml和6.2.1.2项下制备的50～100cfu的白色念珠菌、黑曲霉，分别注入平

皿中，立即倾注不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基20ml混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。

置20～25℃培养箱中培养5天，点计菌落数。

6.1.7.3.3.供试品液对照组：

取1：

10的供试液1ml注入平皿中，立即倾注不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml混匀，平行制备2个平皿。

置30～35℃培养箱中培养5天，点计菌落数。

另取1：

10的供试液1ml注入平皿中，立即倾注不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基20ml混匀，平行制备2个平皿。

置20～25℃培养箱中培养5天，点计菌落数。

6.1.7.3.4.菌液对照组：

取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml和6.2.1.2项下制备的50～100cfu的试验菌，分别注入平皿中，立即倾注不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。

置30～35℃培养箱中培养3天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。

另取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml和7.2项下制备的50～100cfu的白色念珠菌、黑曲霉，

分别注入平皿中，立即倾注不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基20ml混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。

置20～25℃培养箱中培养5天，点计菌落数。

6.1.7.3.5.接受标准：

试验组菌落数减去供试品菌落数的值与对照组菌落数的比值（即试验菌的回收率）应在0.5~2范围内。

计算公式：

稀释剂对照组菌数的回收率＝

试验组菌数回收率=

6.1.7.3.6.常规倾注平皿法测定需氧菌总数的方法验证结果

试验次数1：

异烟肼片批号:

；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：

培养箱型号编号；培养温度：

；

培养时长：

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌72小时，白色念珠菌、黑曲霉120小时

试验菌株

菌种代数

试验组

供试品对照组

菌液对照组

试验菌的回收率

1

2

均值

1

2

均值

1

2

均值

金黄色葡萄球菌

铜绿假单胞菌

枯草芽孢杆菌

白色念珠菌

黑曲霉

试验人/日期：

复核人/日期：

试验次数2：

异烟肼片批号:

；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：

培养箱型号编号；培养温度：

；

培养时长：

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌72小时，白色念珠菌、黑曲霉120小时

试验菌株

菌种代数

试验组

供试品对照组

菌液对照组

试验菌的回收率

1

2

均值

1

2

均值

1

2

均值

金黄色葡萄球菌

铜绿假单胞菌

枯草芽孢杆菌

白色念珠菌

黑曲霉

试验人/日期：

复核人/日期：

试验次数3：

异烟肼片批号:

；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：

培养箱型号编号；培养温度：

；

培养时长：

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌72小时，白色念珠菌、黑曲霉120小时

试验菌株

菌种

代数

试验组

供试品对照组

菌液对照组

试验菌的回收率

1

2

均值

1

2

均值

1

2

均值

金黄色葡萄球菌

铜绿假单胞菌

枯草芽孢杆菌

白色念珠菌

黑曲霉

试验人/日期：

复核人/日期：

6.1.7.3.7.常规倾注平皿法测定霉菌与酵母菌总数方法验证结果

试验次数1：

异烟肼片批号:

；沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号：

培养箱型号编号；培养温度：

；培养时长：

120小时

试验菌株

菌种代数

试验组

供试品对照组

菌液对照组

试验菌的回收率

1

2

均值

1

2

均值

1

2

均值

白色念珠菌

黑曲霉

试验人/日期：

复核人/日期：

试验次数2：

异烟肼片批号:

；沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号：

培养箱型号编号；培养温度：

；培养时长：

120小时

试验菌株

菌种代数

试验组

供试品对照组

菌液对照组

试验菌的回收率

1

2

均值

1

2

均值

1

2

均值

白色念珠菌

黑曲霉

试验人/日期：

复核人/日期：

试验次数3：

异烟肼片批号:

；沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号：

培养箱型号编号；培养温度：

；培养时长：

120小时

试验菌株

菌种代数

试验组

供试品对照组

菌液对照组

试验菌的回收率

1

2

均值

1

2

均值

1

2

均值

白色念珠菌

黑曲霉

试验人/日期：

复核人/日期：

6.1.7.3.8.常规倾注平皿法测定需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数的方法验证总结：

按照验证方案的要求进行试验，若各试验菌株的回收率在0.5～2范围内，则可确认常规倾注平皿法适用于本品的需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数检查。

如常规倾注平皿法适用于霉菌与酵母菌总数检查，但不适用于需氧菌总数检查，则下面进一步验证可去除供试品抑菌物质的薄膜过滤法是否适用于本品的需氧菌总数检查。

6.1.7.4.需氧菌总数检查：

薄膜过滤法：

6.1.7.4.1.供试液制备：

取供试品，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1：

10供试液。

必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释成1:

100、1:

1000。

6.1.7.4.2.试验组：

取供试液1ml，加至100mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，混匀，全量通

过薄膜（孔径0.45μm混合纤维素膜）后，以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜2次（100ml/次），然后在第3次冲洗液（100mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液）中加入6.2.1.2项下制备的50～100cfu的试验菌，过滤。

每株试验菌株平行制备2张滤膜。

取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上，30～35℃倒置培养3天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。

6.1.7.4.3.菌液对照组：

pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中300ml，200ml通过薄膜（孔径0.45μm

混合纤维素膜）后，在余下的100mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液加入6.2.1.2项下制备的50～100cfu的试验菌，过滤。

每株试验菌株平行制备2张滤膜。

取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上，30～35℃倒置培养3天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。

6.1.7.4.4.稀释剂对照组：

pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液为稀释剂将各菌液稀释至含菌50～100cfu/ml，取上层菌液1m加至100mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，混匀，全量通过薄膜（孔径0.45μm混合纤维素膜）后，以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜3次（100ml/次），每株试验菌株平行制备2张滤膜。

取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上，30～35℃倒置培养3天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。

6.1.7.4.5.薄膜过滤法测定需氧菌总数方法验证的接受标准

试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值（即试验菌的回收率）应在0.5〜2范围内，同时稀释剂对照组与菌液对照组菌落数的比值应也在0.5〜2范围内。

6.1.7.4.6.薄膜过滤法测定需氧菌总数方法验证结果：

试验次数1

异烟肼片批号:

；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：

培养箱型号编号；培养温度：

；

培养时长：

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌72小时，白色念珠菌、黑曲霉120小时

试验菌株

菌种代数

试验组

供试品对照组

菌液对照组

试验菌的回收率

1

2

均值

1

2

均值

1

2

均值

金黄色葡萄球菌

铜绿假单胞菌

枯草芽孢杆菌

白色念珠菌

黑曲霉

试验人/日期：

复核人/日期：

试验次数2：

异烟肼片批号:

；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：

培养箱型号编号；培养温度：

；

培养时长：

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌72小时，白色念珠菌、黑曲霉120小时

试验菌株

菌种代数

试验组

供试品对照组

菌液对照组

试验菌的回收率

1

2

均值

1

2

均值

1

2

均值

金黄色葡萄球菌

铜绿假单胞菌

枯草芽孢杆菌

白色念珠菌

黑曲霉

试验人/日期：

复核人/日期：

试验次数3：

异烟肼片批号:

；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：

培养箱型号编号；培养温度：

；

培养时长：

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌72小时，白色念珠菌、黑曲霉120小时

试验菌株

菌种代数

试验组

供试品对照组

菌液对照组

试验菌的回收率

1

2

均值

1

2

均值

1

2

均值

金黄色葡萄球菌

铜绿假单胞菌

枯草芽孢杆菌

白色念珠菌

黑曲霉

试验人/日期：

复核人/日期：

6.1.7.4.7.薄膜过滤法测定需氧菌总数方法验证总结：

按照验证方案的要求进行试验，若试验组各试验菌株的回收率在0.5～2范围内，稀释剂对照组各试验菌株的的回收率也在0.5～2范围内，则可确认薄膜过滤法适用于本品的需氧菌总数检查。

异烟肼片照此验证过的供试液制备方法及计数方法进行需氧菌总数计数。

6.1.8.控制菌检查方法验证：

如在以上方法中证实了异烟肼片有抑菌性，不能使用常规倾注平皿法进行需氧菌总数检查，则为了确保控制菌检查的可靠性，采用可去除供试品抑菌物质的薄膜过滤法进行控制菌检查，按照以下方案进行方法学验证。

6.1.8.1.菌种及菌液制备：

6.1.8.1.1.菌种：

试验用菌株的传代次数不得超过5代，并采用适宜的菌种保藏进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。

菌株有：

金黄色葡萄球菌〔CMCC（B）26003〕、铜绿假单胞菌〔CMCC（B）10104〕、大肠埃希菌〔CMCC（B）44102〕、乙型副伤寒沙门菌〔CMCC（B）50094〕

6.1.8.1.2.菌液制备：

将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌分别接种于胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上，30～35℃培养18～24小时；上述培养物用pH7.0无菌氯化钠一蛋白陈缓冲液制成适宜浓度的菌悬液。

菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在2～8℃，可在24小时内使用。

6.1.8.1.3.阴性对照：

为了确认试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌

生长。

如阴性对照试验有菌生长，应进行偏差调查。

6.1.8.2.大肠埃希菌检查方法适用性试验

6.1.8.2.1.供试液制备：

取供试品，照6.2.1.3供试液制备制成1:

10供试液。

6.1.8.2.2.试验组：

取上述1：

10供试液10ml供试液取供试液10ml，加至pH7.0无菌氯化钠一蛋白陈缓冲液100ml，混匀，全量通过薄膜后，以pH7.0无菌氯化钠一蛋白陈缓冲液冲洗滤膜2次（100ml/次），然后在第3次冲洗液（100mlpH7.0无菌氯化钠一蛋白陈缓冲液）中加入项下制备的50～100cfu的大肠埃希菌，过滤。

取膜接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18～24小时。

取上述增菌培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中,42～44℃培养24～48小时。

取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时。

麦康凯琼脂培养基平板上应有大肠埃希菌典型菌落生长。

6.1.8.2.3.阳性对照组：

照项下菌液制备方法，以pH7.0无菌氯化钠一蛋白陈缓冲液为稀释液，将大肠埃希菌液稀释至含菌50～100cfu/ml，取上层菌液作下面的试验。

取上层菌液1ml，加至100mlpH7.0无菌氯化钠一蛋白陈缓冲液中混匀，全量通过薄膜（孔径0.45μm混合纤维素膜）后，以pH7.0无菌氯化钠一蛋白陈缓冲液冲洗滤膜3次（100ml/次）。

取膜接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18～24小时。

取上述增菌培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中,42～44℃培养24～48小时。

取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时。

麦康凯琼脂培养基平板上应有大肠埃希菌典型菌落生长。

6.1.8.2.4.阴性对照：

取pH7.0无菌氯化钠一蛋白陈缓冲液300ml，全量通过薄膜（孔径0.45μm混合纤维素膜）后，取膜接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18～24小时。

阴性对照应无菌生长。

6.1.8.2.5.薄膜过滤法测定大肠埃希菌方法验证结果

试验次数1：

异烟肼片批号:

大肠埃希菌对照菌来源批号（菌种编号）

培养箱编号温度℃

过程

增菌培养

选择培养

分离培养

结果判断

培养基

胰酪大豆胨液体培养基

配制批号

麦康凯液体培养基

配制批号

麦康凯琼脂培养基

平板配制批号

培养时间

开始月日时

结束月日时

开始月日时

结束月日时

开始月日时

结束月日时

试验组

阳性

对照组

阴性