TS7JY013异烟肼片微生物限度检查方法确认方案.docx

1、TS7JY013异烟肼片微生物限度检查方法确认方案项目负责人：QC主管确认类别：方法验证确认小组主要成员：部 门质量部质量部 质量部 质量部 质量部质量部姓 名职 位QC主管验证管理员确认领导小组审查汇签：姓 名部 门职务或岗位签字日期质量部QC主管质量部QA主管质量部质量受权人1. 主题内容 本方案规定了异烟肼片微生物限度检查方法的验证方法及标准。2. 验证概述 我公司生产异烟肼片微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、大肠埃希菌。参照中国药典2015版四部附录1105：微生物计数法，以及1106：控制菌检查法的规定，本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证。通过验证以确认所采用

2、的微生物限度检查方法适用性。异烟肼片处方中含有异烟肼以及常用辅料成分，异烟肼对细菌有抑菌特性，对霉菌和酵母菌无抑菌活性。异烟肼在水中易溶用薄膜过滤可去除其对微生物生长的影响。本验证方案通过试验菌株的回收率测试，首先确认常规倾注平皿法是否适用于本品的微生物限度检查；如常规倾注平皿法不适用，则进一步验证可去除供试品抑菌物质的薄膜过滤法是否适用于本品的微生物限度检查。本验证方案根据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。对异烟肼片微生物限度检查方法适用性进行验证。3. 验证依据3.1. 验证与确认管理规程、微生物限度检查SOP3.2. 中国药

3、典(2015年版) 四部：（1105）非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法；（1106）非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法。4. 验证目的验证异烟肼片（100mg）微生物限度检查方法的可靠性。5. 实施验证人员及职责 部 门人员职责及分工质量部QC检验员负责根据验证方案对微生物限度方法进行适用性检查，出据检验报告。QA主管/验证管理员负责验证文件的审核，负责确认工作的组织与协调。QC主管项目负责人，验证文件（方案）的起草，对现场对操作过程进行指导。对验证实施过程中资料和数据进行汇总并完成验证报告。质量受权人组织验证工作的实施及各部门的协调，负责验证方案及报告的批准。6. 验证内容验证前准

4、备6.1.1. 文件准备6.1.1.1. 现场备微生物限度检查法SOP、培养基及检定菌管理规程、药品微生物限度检查方法确认方案及相关的验证记录，并填写验证文件准备验证表（附表1）。6.1.2. 验证主要仪器准备：经检定或确认合格并处于有效期内的需氧菌培养箱、霉菌和酵母菌培养箱、生化培养箱、温度计等，填写主要检验仪器设备确认表，见附表2。6.1.3. 验证用空调系统及部分设备的确认/验证情况 检查微生物限度检查室空调系统已经确认并合格、用于灭菌的高压蒸汽灭菌器已经确认并合格、超净工作台、生物安全柜等已经确认并合格，填写确认相关确认记录表，见附表3。6.1.4. 确认验证用试剂、培养基等的有效期

5、确认验证用试剂、培养基等在有效期内且质量符合要求，培养基经适用性检查应符合规定。确认情况填写试剂、培养基确认表，见附表4。6.1.5. 检定菌确认确认用于试验的检定菌在有效期内并生长良好，传代代数不超过第五代。确认情况填写检定菌确认表，见附表5。6.1.6. 培训 确认方案起草人在方案批准后对本次确认相关人员进行培训，并记录在相关附件中。如果在确认中涉及到其他培训，培训记录的复印件附在确认报告中。记录见 附表6 培训记录。验证方法：6.1.7. 供试品计数方法适用性试验6.1.7.1. 试验菌液的制备和使用表试验菌株试验菌液的制备需氧菌总数计数霉菌和酵母菌总数计数金黄色葡萄球菌CMCC(B)2

6、6003胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基，培养温度3035，培养时间1824小时胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度3035，培养时间不超过3天，接种量不大于100cfu铜绿假单胞菌CMCC(B)10104胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基，培养温度3035，培养时间1824小时胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度3035，培养时间不超过3天，接种量不大于100cfu枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基，培养温度3035，培养时间1824小时胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度3035，培养时间不超过3天，接种量不大于100cfu白色念珠球菌CMCC(

7、F)98001沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基，培养温度2025，培养时间23天胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度3035，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度2025，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu黑曲霉CMCC(F)98003沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度2025，培养时间57天，或直到获得丰富的孢子胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度3035，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度2025，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu6.1.7.2. 需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液

8、制备：6.1.7.2.1. 菌液制备：分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10ml胰酪大豆胨液体培养基中，3035培养1824小时，取此培养液1ml加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-510-7,制成50100cfu/ml的菌悬液备用。6.1.7.2.2. 接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml沙氏葡萄糖液体培养基中，2025培养23天，取此培养液1ml加0.9无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-510-7，制成50100cfu/ml的菌悬液备用。6.1.7.2.3. 接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂

9、斜面上，2025培养57天，直到获得丰富的孢子。加入35ml含有0.05%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱，吸至无菌试管中，取1ml加含有0.05%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-510-7，制成50100cfu/m的孢子悬液备用。菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在28，可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在28，在验证过的贮存期内使用。6.1.7.3. 需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证6.1.7.3.1. 供试液制备：取供试品，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，稀释制成

10、1：10供试液。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释成1:100、1:1000。6.1.7.3.2. 试验组：取1：10的供试液1ml和6.2.1.2项下制备的50100cfu的试验菌，分别注入平皿中，立即倾注不超过45的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。置3035培养箱中培养3天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。另取1：10的供试液1ml和6.2.1.2项下制备的50100cfu的白色念珠菌、黑曲霉，分别注入平皿中，立即倾注不超过45的沙氏葡萄糖琼脂培养基20ml混匀，每株试验菌株平行制备2

11、个平皿。置2025培养箱中培养5天，点计菌落数。6.1.7.3.3. 供试品液对照组：取1：10的供试液1ml注入平皿中，立即倾注不超过45的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml混匀，平行制备2个平皿。置3035培养箱中培养5天，点计菌落数。另取1：10的供试液1ml注入平皿中，立即倾注不超过45的沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基20ml混匀，平行制备2个平皿。置2025培养箱中培养5天，点计菌落数。6.1.7.3.4. 菌液对照组：取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml和6.2.1.2项下制备的50100cfu的试验菌，分别注入平皿中，立即倾注不超过45的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml混匀，每株试验菌株

12、平行制备2个平皿。置3035培养箱中培养3天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。另取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml和7.2项下制备的50100cfu的白色念珠菌、黑曲霉，分别注入平皿中，立即倾注不超过45的沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基20ml混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。置2025培养箱中培养5天，点计菌落数。6.1.7.3.5. 接受标准：试验组菌落数减去供试品菌落数的值与对照组菌落数的比值（即试验菌的回收率）应在0.52范围内。 计算公式：稀释剂对照组菌数的回收率试验组菌数回收率= 6.1.7.3.6. 常规倾注平皿法

13、测定需氧菌总数的方法验证结果试验次数1： 异烟肼片批号: ； 胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号 ； 培养温度： ；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌72小时，白色念珠菌、黑曲霉120小时试验菌株菌种代数试验组供试品对照组菌液对照组试验菌的回收率12均值12均值12均值金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉试验人/日期： 复核人/日期：试验次数2： 异烟肼片批号: ； 胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号 ； 培养温度： ；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌72小时，白色念珠菌、黑曲霉120小时试验菌株菌种代数试

14、验组供试品对照组菌液对照组试验菌的回收率12均值12均值12均值金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉试验人/日期： 复核人/日期：试验次数3： 异烟肼片批号: ； 胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号 ； 培养温度： ；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌72小时，白色念珠菌、黑曲霉120小时试验菌株菌种代数试验组供试品对照组菌液对照组试验菌的回收率12均值12均值12均值金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉试验人/日期： 复核人/日期：6.1.7.3.7. 常规倾注平皿法测定霉菌与酵母菌总数方法验证结果试验次数1： 异烟肼片批

15、号: ；沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：120小时试验菌株菌种代数试验组供试品对照组菌液对照组试验菌的回收率12均值12均值12均值白色念珠菌黑曲霉试验人/日期： 复核人/日期：试验次数2： 异烟肼片批号: ；沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：120小时试验菌株菌种代数试验组供试品对照组菌液对照组试验菌的回收率12均值12均值12均值白色念珠菌黑曲霉试验人/日期： 复核人/日期：试验次数3： 异烟肼片批号: ；沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：120小时试验菌株

16、菌种代数试验组供试品对照组菌液对照组试验菌的回收率12均值12均值12均值白色念珠菌黑曲霉试验人/日期： 复核人/日期：6.1.7.3.8. 常规倾注平皿法测定需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数的方法验证总结：按照验证方案的要求进行试验，若各试验菌株的回收率在0.52范围内，则可确认常规倾注平皿法适用于本品的需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数检查。如常规倾注平皿法适用于霉菌与酵母菌总数检查，但不适用于需氧菌总数检查，则下面进一步验证可去除供试品抑菌物质的薄膜过滤法是否适用于本品的需氧菌总数检查。6.1.7.4. 需氧菌总数检查：薄膜过滤法：6.1.7.4.1. 供试液制备：取供试品，用pH7.0无菌氯化钠

17、-蛋白胨缓冲液， 胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1：10供试液。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释成1:100、1:1000。6.1.7.4.2. 试验组：取供试液1 ml，加至100 ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，混匀，全量通过薄膜（孔径0.45m混合纤维素膜）后，以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜2次（100ml/次），然后在第3次冲洗液（100mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液）中加入6.2.1.2项下制备的50100cfu的试验菌，过滤。每株试验菌株平行制备2张滤膜。取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上，3035倒置培养3天（金黄

18、色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。6.1.7.4.3. 菌液对照组：pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中300 ml，200ml通过薄膜（孔径0.45m混合纤维素膜）后，在余下的100mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液加入6.2.1.2项下制备的50100cfu的试验菌，过滤。每株试验菌株平行制备2张滤膜。取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上，3035倒置培养3天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。6.1.7.4.4. 稀释剂对照组：pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液为

19、稀释剂将各菌液稀释至含菌50100cfu/ml，取上层菌液1 m加至100 mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，混匀，全量通过薄膜（孔径0.45m混合纤维素膜）后，以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜3次（100ml/次），每株试验菌株平行制备2张滤膜。取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上，3035倒置培养3天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。6.1.7.4.5. 薄膜过滤法测定需氧菌总数方法验证的接受标准 试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值(即试验菌的回收率)应在0 .52 范围内，

20、同时稀释剂对照组与菌液对照组菌落数的比值应也在0 .52 范围内。6.1.7.4.6. 薄膜过滤法测定需氧菌总数方法验证结果：试验次数1 异烟肼片批号: ； 胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号 ； 培养温度： ；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌72小时，白色念珠菌、黑曲霉120小时试验菌株菌种代数试验组供试品对照组菌液对照组试验菌的回收率12均值12均值12均值金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉试验人/日期： 复核人/日期：试验次数2： 异烟肼片批号: ； 胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号 ； 培养温度： ；培养时长：金

21、黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌72小时，白色念珠菌、黑曲霉120小时试验菌株菌种代数试验组供试品对照组菌液对照组试验菌的回收率12均值12均值12均值金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉试验人/日期： 复核人/日期：试验次数3： 异烟肼片批号: ； 胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号 ； 培养温度： ；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌72小时，白色念珠菌、黑曲霉120小时试验菌株菌种代数试验组供试品对照组菌液对照组试验菌的回收率12均值12均值12均值金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉试验人/日期： 复核人/日

22、期：6.1.7.4.7. 薄膜过滤法测定需氧菌总数方法验证总结： 按照验证方案的要求进行试验，若试验组各试验菌株的回收率在0.52范围内，稀释剂对照组各试验菌株的的回收率也在0.52范围内，则可确认薄膜过滤法适用于本品的需氧菌总数检查。异烟肼片照此验证过的供试液制备方法及计数方法进行需氧菌总数计数。 6.1.8. 控制菌检查方法验证：如在以上方法中证实了异烟肼片有抑菌性，不能使用常规倾注平皿法进行需氧菌总数检查，则为了确保控制菌检查的可靠性，采用可去除供试品抑菌物质的薄膜过滤法进行控制菌检查，按照以下方案进行方法学验证。6.1.8.1. 菌种及菌液制备：6.1.8.1.1. 菌种：试验用菌株的

23、传代次数不得超过5代，并采用适宜的菌种保藏进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。菌株有：金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003、铜绿假单胞菌CMCC(B)10104、大肠埃希菌CMCC(B)44102、乙型副伤寒沙门菌CMCC(B)500946.1.8.1.2. 菌液制备：将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌分别接种于胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上，3035培养1824小时；上述培养物用pH7.0无菌氯化钠一蛋白陈缓冲液制成适宜浓度的菌悬液。菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在28，可在24小时内使用。6.1.8.1.3. 阴性对照：为了确认试验条

24、件是否符合要求，应进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。如阴性对照试验有菌生长，应进行偏差调查。6.1.8.2. 大肠埃希菌检查方法适用性试验6.1.8.2.1. 供试液制备：取供试品，照6.2.1.3供试液制备制成1:10供试液。6.1.8.2.2. 试验组 ：取上述1：10供试液10ml供试液取供试液10ml，加至pH7.0无菌氯化钠一蛋白陈缓冲液100 ml，混匀，全量通过薄膜后，以pH7.0无菌氯化钠一蛋白陈缓冲液冲洗滤膜2次（100ml/次），然后在第3次冲洗液（100mlpH7.0无菌氯化钠一蛋白陈缓冲液）中加入项下制备的50100cfu的大肠埃希菌，过滤。取膜接种至100ml

25、胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，3035培养1824小时。取上述增菌培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中,4244培养2448小时。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，3035培养1872小时。麦康凯琼脂培养基平板上应有大肠埃希菌典型菌落生长。6.1.8.2.3. 阳性对照组：照项下菌液制备方法，以pH7.0无菌氯化钠一蛋白陈缓冲液为稀释液，将大肠埃希菌液稀释至含菌50100cfu/ml，取上层菌液作下面的试验。取上层菌液1 ml，加至100 ml pH7.0无菌氯化钠一蛋白陈缓冲液中混匀，全量通过薄膜（孔径0.45m混合纤维素膜）后，以pH7.0无菌氯化钠一蛋白陈缓冲

26、液冲洗滤膜3次（100ml/次）。取膜接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，3035培养1824小时。取上述增菌培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中,4244培养2448小时。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，3035培养1872小时。麦康凯琼脂培养基平板上应有大肠埃希菌典型菌落生长。6.1.8.2.4. 阴性对照：取pH7.0无菌氯化钠一蛋白陈缓冲液300 ml，全量通过薄膜（孔径0.45m混合纤维素膜）后，取膜接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，3035培养1824小时。阴性对照应无菌生长。6.1.8.2.5. 薄膜过滤法测定大肠埃希菌方法验证结果试验次数1：异烟肼片批号: 大肠埃希菌对照菌来源 批号（菌种编号） 培养箱编号 温度 过程增菌培养选择培养分离培养结果判断培养基胰酪大豆胨液体培养基配制批号 麦康凯液体培养基配制批号 麦康凯琼脂培养基平板 配制批号 培养时间开始 月 日 时结束 月 日 时开始 月 日 时结束 月 日 时开始 月 日 时结束 月 日 时试验组阳性对照组阴性