医学生物化学实验教案.docx
《医学生物化学实验教案.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《医学生物化学实验教案.docx（46页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
医学生物化学实验教案
《医学生物化学实验》教案
第1次课2学时
实验项目
3，5-二硝基水杨酸法（DNS法）测定还原糖
实验性质
设计性实验
教学目的和要求
1、了解糖的还原性
2、掌握还原糖定量测定的原理和方法。
3、熟悉分光光度计的使用方法。
教学重点与难点
重点:
绘制标准曲线的方法，分光光度计的使用原理和使用方法。
难点：
标准曲线的应用。
实验材料
1.试剂
（1）1mg/mL葡萄糖标准溶液：
准确称取干燥恒重的葡萄糖100mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100mL，即含葡萄糖为1.0mg/mL。
（2）3，5-二硝基水杨酸试剂：
称取6.3g3，5-二硝基水杨酸并量取262mL2mol/LNaOH加到酒石酸钾纳的热溶液中（182g酒石酸钾纳溶于500mL水中），再加5g结晶酚和5g亚硫酸氢钠溶于其中，搅拌溶解，冷却后定容到1000mL贮于棕色瓶中。
（3）未知浓度还原糖。
2.材料
小麦淀粉或玉米淀粉。
3.器材
分光光度计，天平，水浴锅，电炉，试管若干等。
实验内容
一、实验原理★：
在NaOH和丙三醇存在下，3，5-二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。
在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。
黄色桔红色
二、实验步骤：
1.取7支具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和DNS试剂，配成不同浓度的葡萄糖反应液。
表1葡萄糖标准曲线制作
管号
1mg/ml葡萄糖标准液（mL）
蒸馏水
（mL）
DNS
（mL）
葡萄糖含量（mg）
光密度值（OD-540nm）
1
0
0.5
0.5
0
2
0.1
0.4
0.5
0.1
3
0.2
0.3
0.5
0.2
4
0.3
0.2
0.5
0.3
5
0.4
0.1
0.5
0.4
6
0.5
0
0.5
0.5
7（未知浓度还原糖）
0.5
0
0.5
0.5
将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min取出，冷却至室温，用蒸馏水补足至5mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。
调波长540nm，用1号管调零点，分别测出2~6号管的光密度值。
2.绘制标曲▲
以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线（电脑Excel完成最好）。
计算7号管还原糖的百分含量。
三、结果与计算▲：
计算出7号管光密度值的平均值，在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。
查曲线所得葡萄糖毫克数×提取液总体积/测定时取用体积
还原糖（%）=——————————————————————————×100%
样品毫克数
教学过程中师生活动设计
糖的还原性，具有还原性的糖结构有何特点？
提纲、板书设计
实验原理及反应方程式，实验步骤中表1及计算公式
作业
1、为什么要设置空白对照？
2、标准曲线的定义？
主要
参考资料
[1]《生物化学实验》，何幼鸾、汤文浩，华师出版社，2013
[2]《生物化学实验》，董晓燕主编，化学工业出版社，2010
总结分析
1、让学生理解糖定量测定的原理及方法；
2、强调标准曲线的绘制要点；
3、需要和学生一起推导还原糖浓度的公式
《医学生物化学实验》教案
第2次课2学时
实验项目
糖的呈色反应和还原糖检验
实验性质
验证性实验
教学目的和要求
1.了解糖类某些颜色反应的原理
2.学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法
教学重点与难点
重点：
颜色反应鉴别糖的方法
难点：
鉴别糖的反应原理
实验材料
1、仪器：
试管及试管架、滴管、移液管及恒温水浴锅
2、试剂：
莫氏试剂、塞氏试剂、托伦试剂；1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液、1%果糖溶液、1%阿拉伯糖溶液、1%半乳糖溶液
实验内容
一、实验原理★：
α—萘酚反应：
糖在浓无机盐作用下，脱水生成糠醛衍生物，后者在浓硫酸的作用下能与α—萘酚生成紫红色物质，在糖液面与浓硫酸液面间出现紫色环。
但一些非糖物质对此反应也呈阳性
间苯二酚反应：
在酸作用下，酮糖脱水生成羟甲基醛，后者可与间苯二酚作用生成红色物质。
此反应是酮糖的特异反应。
醛糖在同样条件下呈色反应慢。
托伦反应：
戊糖在浓酸作用下脱水生成糠醛，后者可与间苯三酚结合生成樱桃红色物质。
本反应常用来鉴定戊糖，戊糖此反应最快，可以和其他糖类区分。
二、操作步骤▲：
α—萘酚反应：
先取3支试管，分别加入1%葡萄糖溶液、1%淀粉溶液、1%蔗糖溶液，然后向3支试管中各加入2滴莫氏试剂，混匀。
另外取1支试管，只加2滴莫氏试剂作为空白对照，倾斜4支试管，沿各试管壁缓慢加入浓硫酸约1.5mL，慢慢立起试管，切勿摇动。
试管中液体分成两层，浓硫酸在试液下面。
在两液分界处有紫红色环出现。
观察、记录各管颜色。
间苯二酚反应：
取3支试管，分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%果糖溶液各0.5mL。
再向各管分别加入塞氏试剂2.5mL，混匀。
将3支试管同时置于沸水浴中，注意观察颜色的变化及变化时间。
托伦反应：
取3支试管，分别加入1%阿拉伯糖溶液、1%半乳糖溶液、1%葡萄糖溶液各0.1mL，再向各管分别加入托伦试剂1mL，混匀。
将3支试管同时置于沸水浴中，观察、记录颜色的变化及颜变化的时间。
教学过程中师生活动设计
观察和记录各管颜色及颜色变化的时间后，说出各管颜色变化的原因。
提纲、板书设计
原理及操作步骤
作业
1.简述α—萘酚反应原理。
2.可用何种颜色反应鉴别酮糖存在。
主要
参考资料
[1]《生物化学实验》，何幼鸾、汤文浩，华师出版社，2013
[2]《生物化学实验》，董晓燕主编，化学工业出版社，2010
总结分析
1、让学生掌握糖显色反应的原理；
2、给学生强调注意观察各管颜色变化的时间
《医学生物化学实验》教案
第3次课2学时
实验项目
蛋白质等电点和沉淀反应
实验性质
基础性实验
教学目的和要求
1.了解蛋白质的两性解离性质。
2.学习测定蛋白质等电点的方法。
3.了解蛋白质变性与沉淀的关系及沉淀蛋白质的方法以及其实用意义。
教学重点
与难点
重点：
学习测定蛋白质等电点的方法及沉淀蛋白质的方法。
难点：
蛋白质变性与沉淀的关系，沉淀的蛋白质不一定表现为变性；变性的蛋白质不一定表现为沉淀。
实验材料
（一）材料
新鲜鸡蛋
（二）试剂
1、0.4%酪蛋白醋酸钠溶液200mL
2、1.00mol/L醋酸溶液100mL
3、0.10mol/L醋酸溶液300mL
4、0.01mol/L醋酸溶液50mL
5、蛋白质溶液500mL
5%卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液（新鲜鸡蛋清:
水=1:
9）
6、pH4.7醋酸—醋酸钠的缓冲溶液100mL
7、3%硝酸银溶液10mL
8、5%三氯乙酸溶液50mL
9、95%乙醇250mL
10、饱和硫酸铵溶液250mL
11、硫酸铵结晶粉末10000mL
12、0.1mol/L盐酸溶液300mL
13、0.1mol/L氢氧化钠溶液300mL
14、0.05mol/L碳酸钠溶液300mL
15、甲基红溶液20mL
（三）器具
水浴锅、温度计、200mL锥形瓶、100mL容量瓶、吸管、试管及试管架
实验内容
1.实验原理★：
蛋白质是两性电解质。
在蛋白质溶液中存在下列平衡：
最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。
蛋白质的沉淀反应可分为两类。
（1）可逆的沉淀反应
此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来溶剂中，并保持其天然性质而不变性。
如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。
提纯蛋白质时，常利用此类反应。
（2）不可逆沉淀反应
此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。
加热引起的蛋白质沉淀与凝固。
蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。
蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。
因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。
二、实验步骤：
（一）酪蛋白等电点的测定
（1）取同样规格的试管4支，按下表顺序分别精确地加入各试剂，然后混匀。
试管号
蒸馏水
（mL）
0.01mol/L蜡酸
（mL）
0.1mol/L蜡酸（mL）
1.0mol/L蜡酸（mL）
1
8.4
0.6
-
—
2
8.7
-
0.3
—
3
8.0
-
1.0
—
4
7.4
-
-
1.6
（2）向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL，加一管，摇匀一管。
此时1、2、3、4管的pH依次为5.9、5.5、4.7、3.5。
观察其混浊度。
静置10分钟后，再观察其混浊度。
最混浊的一管pH即为酪蛋白的等电点。
（二）蛋白质的沉淀及变性★▲
1、蛋白质的盐析
无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）的浓溶液能析出蛋白质。
盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。
如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。
由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。
加蛋白质溶液5mL于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。
倒出少量混浊沉淀，加少量水，观察是否溶解，为什么？
将管内容物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止。
此时析出沉淀为清蛋白。
取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。
2、重金属离子沉淀蛋白质：
重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。
取1支试管，加入蛋白质溶液2mL，再加3%硝酸银溶液1—2滴，振荡试管，有沉淀产生。
放置片刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？
为什么？
3、某些有机酸沉淀蛋白质
取1支试管，加入蛋白质溶液2mL，再加入1mL5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成。
放置片刻倾出清液，向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解。
4、有机溶剂沉淀蛋白质
取1支试管，加入2mL蛋白质溶液，再加入2mL95%乙醇。
观察沉淀的生成（如果沉淀不明显，加点NaCl，混匀。
5、乙醇引起的变性与沉淀
取3支试管，编号。
依下表顺序加入试剂：
试剂（mL）
管号
蛋白质
溶液
0.1mol/L氢氧化钠溶液
0.1mol/L盐酸溶液
95%乙醇
pH4.7缓冲溶液
1
2
3
1
1
1
—
1
—
—
—
1
1
1
1
1
—
—
振摇混匀后，观察各管有何变化。
放置片刻向各管内加入水8mL，然后在第2，3号管中各加一滴甲基红，再分别用0.1mol/L醋酸溶液及0.05mol/L碳酸钠溶液中和之。
观察各管颜色的变化和沉淀的生成。
每管再加0.1mol/L盐酸溶液数滴，观察沉淀的再溶解。
解释各管发生的全部现象。
教学过程中师生活动设计
蛋白质沉淀原理，什么是蛋白质变性？
根据性质推测其应用
提纲、板书设计
原理及简要操作步骤
作业
1.什么是等电点？
2.临床上为什么可以用蛋清或牛乳解救误服金属盐的病人？
主要
参考资料
[1]《生物化学实验》，何幼鸾、汤文浩，华师出版社，2013
[2]《生物化学实验教程》，王金亭，方俊主编，华中科技大学出版社，2010
总结分析
1、通过原理分析，帮助学生理解“沉淀的蛋白质不一定表现为变性；变性的蛋白质不一定表现为沉淀”；
2、重点区别：
“可逆沉淀”与“不可逆沉淀”
《医学生物化学实验》教案
第4次课2学时
实验项目
蛋白质和氨基酸显色反应
实验性质
基础性实验
教学目的和要求
1.学习和了解常用的几种鉴定蛋白质与氨基酸的方法。
2.了解蛋白质与氨基酸的显色反应原理。
教学重点与难点
重点：
蛋白质与氨基酸的显色反应原理。
难点：
鉴定蛋白质与氨基酸的方法。
实验材料
试剂：
0.5%醋酸铅1mL、10%NaOH、1%CuSO4
器具：
水浴锅、温度计、200mL锥形瓶、100mL容量瓶、吸管、试管及试管架
实验内容
一、实验原理★：
1.双缩脲反应（biuretreaction）
蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。
2.苯环的黄色反应
Tyr（Trp）+浓硝酸
黄色
Phe+少量浓硫酸+浓硝酸
黄色
3.醋酸铅反应（半胱氨酸和胱氨酸）
R-SH+2NaOH
R-OH+Na2S+H2O
Na2S+Pb2+
PbS+2Na+
PbS+2HCl
PbCl2+H2S
二、实验步骤▲：
1.双缩脲反应（biuretreaction）
取1支试管，加乳蛋白溶液（蛋清:
水=1:
9）约1mL和10%NaOH约2mL，摇匀，再加1%CuSO4溶液2滴，随加随摇。
观察现象，记录。
2.苯环的黄色反应
向6个试管中按下表加试剂，观察现象并记录。
鸡蛋清溶液（蛋清:
水=1:
9）
管号
1
2
3
4
5
6
材料
鸡蛋清液
指甲
头发
0.5%苯酚
0.3%色氨酸
0.3%酪氨酸
（滴）
4
少许
少许
4
4
4
浓硝酸（滴）
2
20
20
4
4
4
现象
逐滴加10%NaOH后现象变化
3.醋酸铅反应
0.5%醋酸铅1mL、10%NaOH1mL、卵清蛋白1mL三样试剂混匀加热，观察现象。
然后冷却至20~30℃，加10滴浓HCL，再将湿润的醋酸铅试纸放于管口，加热，嗅其气味同时观察试纸颜色变化。
教学过程中师生活动设计
含苯环的氨基酸有哪些？
双缩脲反应颜色与什么相关？
提纲、板书设计
原理及简要操作步骤
作业
1.在实验室如何区分核酸和蛋白质？
2.黄色反应中为何会出现深浅不一的黄色？
主要
参考资料
[1]《生物化学实验》，何幼鸾、汤文浩，华师出版社，2013
[2]《生物化学实验教程》，王金亭，方俊主编，华中科技大学出版社，2010
总结分析
1、实验过程中让学生重点观察颜色变化的过程；
2、醋酸铅反应的每一步都要记录现象
《医学生物化学实验》教案
第5次课2学时
实验项目
糖的薄层层析
实验性质
基础性实验
教学目的和要求
1.了解薄层层析的基本原理。
2.熟悉薄层层析的操作过程。
教学重点与难点
重点：
掌握薄层层析的吸附原理。
难点：
掌握分配系数，Rf值。
实验材料
四种糖样品、染色液、扩展剂、层析缸、层析板等
实验内容
一、实验原理★：
薄层层析（简称TLC）是在吸附层析基础上发展起来的一种微量而快速的层析法，它是在吸附剂或支持剂均匀涂布的薄层上进行的，故称薄层层析。
为了使所要分析的样品各组分得到分离，必须选择合适的吸附剂。
硅胶、氧化铝和聚酰胺是广泛采用的吸附剂，在吸附剂或支持剂中添加合适的粘合剂后再涂布，可使薄层紧贴在玻璃板上。
糖是多羟基化合物在硅胶G薄层上展层时，被吸附的强弱有差异，同时在展开剂中溶解性质也有差异。
吸附力主要与糖的相对分子质量和羟基数有关，一般为三糖〉二糖〉单糖，醛糖〉酮糖〉脱氧糖。
经过适当的溶剂展开后，糖在薄板上的移动速度是戊糖＞己糖＞双糖＞三糖。
薄层层析与其他方法比有明显的优点：
层析时间短、样品用量范围大（1μg-0.5g）、观察结果方便、可以分离多种化合物等，其灵敏度比纸层析高10-100倍，显色方法甚至可以用腐蚀性显色剂。
而且薄层层析法操作方便，设备简单，所以薄层层析法目前应用范围相当广泛。
二、实验步骤▲：
1．点样
选取制备好的薄板一块，在距底边1.5cm的直线上均匀选4个点。
用毛细管分别点上不同的糖样品于4个点，样品量控制在5-10μg，斑点直径不超过3mm。
点样完毕，立即用电热吹风机吹干样点。
2．展层
将薄板置于盛有层析溶剂的层折缸中，自下向上展层，当展层溶剂到达离薄板顶端约1cm处时取出薄板，在溶剂前沿处作一记号，于80℃下烘干5min。
3．显色
除尽溶剂后，向薄层板上喷雾糖显色剂，于80℃下烘干10min，则各种糖分别显出不同的颜色。
三、实验结果▲：
（1）记下各斑点的位置、颜色，计算Rf值。
（2）鉴定混合糖中糖的种类，并绘出层析图谱。
教学过程中师生活动设计
还有哪些层板方法？
提纲、板书设计
原理及简要操作步骤
作业
何谓Rf值？
Rf值与什么因素有关？
主要参考资料
[1]《生物化学实验》，董晓燕主编，化学工业出版社，2010
[2]《生物化学实验教程》，王金亭，方俊主编，华中科技大学出版社，2010
总结分析
1、点样是本实验的关键，教师在指导学生操作时，强调点样要轻、快，稳、小并且点样点要集中；
2、放展板时，点样点不要浸如展层溶液中
《医学生物化学实验》教案
第6次课2学时
实验项目
酶的特性
实验性质
基础性实验
教学目的和要求
掌握酶促反应速度的几个主要影响因素
了解淀粉水解程度的鉴定。
教学重点与难点
重点：
唾液淀粉酶催化的酶促反应；淀粉水解程度的判断。
难点：
酶活性的影响因素。
实验材料
仪器：
水浴锅、电炉、白瓷板、试管、量筒、漏斗、脱脂棉。
试剂：
0.2%、0.5%淀粉液、0.3%NaCl、0.85%NaCl溶液、1%CuSO4溶液、1%Na2SO4、pH=5.0、pH=8.0、pH=6.8缓冲溶液。
实验内容
一、实验原理★：
温度与酶促反应速度关系密切。
温度降低时，酶促反应速度降低以至完全停止；随着温度升高，反应速度逐渐加快。
在某一温度时反应速度达到最大值，此温度称酶作用的最适温度。
温度继续升高，反应速度反而下降。
人体内大多数酶的最适温度在37℃左右。
pH值也会影响酶促反应速度。
因为酶本身是蛋白质，pH不仅影响酶蛋白分子某些基团的解离，也影响底物的解离程度，从而影响酶与底物的结合。
当酶促反应速度达到最大值时的溶液pH值，称为该酶的最适pH。
不同的酶最适pH值不尽相同，人体多数酶的最适pH值在7.0左右。
例如唾液淀粉酶的最适pH值为6.8。
凡是能够提高酶活性，加快酶促反应速度的物质都称为酶的激活剂。
例如Cl-是唾液淀粉酶的激活剂。
凡是能够降低酶的活性，使酶促反应速度减慢，又不使酶变性的物质称为酶的抑制剂。
例如Cu2+是唾液淀粉酶的抑制剂。
在不同温度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度不同，可由水解混合物遇碘显现的颜色不同来判断：
淀粉（蓝色）
红色糊精（红色）
无色糊精（不显色）
麦芽糖（不显色）
葡萄糖（不显色）
二、实验步骤：
1.制备稀释50倍的唾液淀粉酶：
用蒸馏水漱口清除食物残渣，再含一口蒸馏水一分钟
后使其流入量筒并稀释50倍，混匀备用。
2.温度对酶促反应速度影响实验
（1）取试管3支，编号，各管按下表依次加入各种试剂。
温度对酶促反应速度影响实验加样表
管号123
0.1％淀粉溶液（mL）1.51.51.5
稀释唾液（ml）111
煮沸唾液——1
摇匀
水浴温度37℃0℃37℃
（2）水浴8min后，向各管中各滴加1滴KI-I2溶液，混匀，观察各管颜色并解释结果▲
3.pH对酶促反应速度的影响实验
（1）取试管3支，编号，按下表依次加入各种试剂。
pH对酶促反应速度影响实验加样表
管号123
0.2％淀粉液（mL）222
PH5.0缓冲液（mL）3——
PH6.8缓冲液（mL）—3—
PH8.0缓冲液（mL）——3
稀释唾液酶（mL）222
（2）混匀后，将各管置于37℃水浴5分钟后，取2号管中混合液1滴于点滴板上，加1滴KI-I2溶液显色，以检验淀粉的水解程度。
若不是棕黄色，则继续保温，然后每隔1min继续取2号管的混合液1滴于点滴板上，加1滴KI-I2溶液显色，直至变成棕黄色时，向所有试管内依次滴加2滴KI-I2溶液显色。
观察各管颜色并解释结果▲。
4.激活剂和抑制剂对酶促反应速度的影响
（1）取试管4支，编号，按下表依次加入各种试剂。
激活剂和抑制剂对酶促反应速度影响实验加样表
管号1234
0.1％淀粉液（mL）1.51.51.51.5
1％NaCl溶液（mL）2———
1％Na2SO4溶液（mL）—2——
1％CUSO4溶液（mL）——2—
蒸馏水（mL）———2
稀释唾液酶（mL）0.50.50.50.5
（2）混匀后，将各管置于37℃水浴8分钟后，取1号管中混合液1滴于点滴板上，加1滴KI-I2溶液显色，以检验淀粉的水解程度。
若不是棕黄色，则继续保温，然后每隔1min继续取1号管的混合液1滴于点滴板上，加1滴KI-I2溶液显色，直至变成棕黄色时，向所有试管依次滴加1滴KI-I2溶液显色。
观察各管颜色并解释结果▲。
教学过程中师生活动设计
随着淀粉水解，为什么与碘有颜色反应变化？
提纲、板书设计
原理及简要操作步骤
作业
1在作离子对酶活的影响时3、4号管有何作用？
2.在激活剂和抑制剂对酶促反应速度的影响实验中如何证明Cl-是唾液淀粉酶的激活剂？
3.酶的抑制剂与变性剂有何区别？
主要参考资料
[1]《生物化学实验》，董晓燕主编，化学工业出版社，2010
[2]《生物化学实验教程》，王金亭，方俊主编，华中科技大学出版社，2010
总结分析
1、对照实验要注意同步性；
2、不同人的唾液淀粉酶活性不尽相同，让学生注意到样本差异；
3、重点分析激活剂和抑制剂对酶促反应速度的影响
《医学生物化学实验》教案
第7次课2学时
实验项目
Folin-酚试剂法测蛋白质浓度
实验性质
综合性实验
教学目的
和要求
1.学习会用Folin-酚试剂法测蛋白质浓度的方法。
2.巩固分光光度计的使用。
教学重点
与难点
1、重点：
分光光度计的使用
2、难点：
标准曲线的绘制
实验材料
试剂：
标准蛋白溶液，Folin-酚试剂，样品液蛋白质
器材：
分光光度计、恒温水浴锅、试管、移液管
实验内容
一、实验原理★
Folin-酚试剂法测蛋白质浓度的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin-酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。
这两种显色反应产生深兰色的原因是：
在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。
Folin-酚试剂中的磷钼酸盐-磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。
在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。
二、实验步骤▲
1.曲线的测定：
取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）。
用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20～25℃）放置10分钟。
再逐管加入0.5毫
升级会员 