整理家畜繁殖新技术.docx

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整理家畜繁殖新技术

家畜繁殖新技术

繁殖新技术产生的源由：

动物繁殖学为动物科学的专业基础课程

动物繁殖学三大组成部分

繁殖生理：

生殖激素生殖生理配种受精妊娠分娩

繁殖技术：

人工授精同期发情胚胎移植体外受精等

繁殖疾病：

不育不孕生殖障碍

影响繁殖技术发展的因素

繁殖学是整个畜牧学科应用技术与理论研究发展最快的一门学科，繁殖技术又是现代生物工程技术（Biotechnology）的基础。

前者体现在生殖内分泌的研究进展—下丘脑对生殖的调控作用，后者突出表现在核移植技术的成功

六次革命人类作出了三大创举：

曼哈顿计划阿波罗登月计划人类基因组计划

生物工程技术的概念：

利用生物体系应用先进的生物学和工程技术加工或不加工底物原料以提供所需的各种产品或达到某种目的的一门新型的生物科学技术。

生物工程技术的作用：

可大大提高动物的繁殖效率提高生长速度降低生产成本可改变畜产品的结构可培育人们需要的新的动物品种可用动物代替生物反应器

繁殖新技术的内容——生物工程技术在家畜繁殖上的应用

基因重组利用技术——转基因

细胞融合利用技术——嵌合体

胚胎与核移植技术——核移植

组织培养利用技术——体外受精

细胞大量培养技术——胚胎干细胞

生物反应堆与酶技术——酶工程

胚胎分割的生理基础：

胚胎发育早期的卵裂球具全能性即发育成一完整个体的能力

胚胎分割的意义在于：

可使可用胚胎数成倍生长、可获得遗传上几乎完全相同的后代、可作为生物学研究模型

胚胎分割的方法归纳为四种：

1、Willadsen的分割法

程序：

分割——移入空透明带——双层琼脂包埋——中间受体——同种受体

2、Williams的分割法

程序：

分割——移入空透明带——同种受体

3、玲木分割法

程序：

透明带内分割——注入大分子物质溶液——同种移植

4、简易分割法

胚胎分割的应用前景

1与胚胎移植结合可提高受胎率

2可得到同卵双生后代在牛避免孪生母犊不育

3可作为理想的试验研究材料

4为胚胎性别鉴定提供了条件

胚胎分割存在的一些问题

1体重并非完全相同

2毛色和斑纹往往有差异

3生出的动物出现异常与畸形

嵌合体：

两个或两个以上受精卵发育的复合个体

嵌合体的制作：

一、聚合法

1、胚胎聚合法（程序）：

1）采集胚胎2）除去透明带3）洗涤4）配对5）融合——化学融合法（聚乙二醇法.仙台病毒法.外源凝集素法）---电融合法6）培养7）移植

2、卵裂球聚合法（程序）（同胚胎聚合法））将两枚或两枚以上胚胎在除去透明带后将离散的分裂球按需要取出共同放入一空透明带内PHA集合琼脂包埋移植

二、囊胚注入法又称向囊胚内注入细胞法优点：

1）对着床需透明带的动物十分有利

2）既可制造ICM嵌合体又可使TR成为嵌合体

三、囊胚重组法

嵌合体的标记

标记物必需满足的条件

1）固定在细胞内的物质不能跑到细胞外

2）稳定存在于最初标记的细胞及因分裂而增殖的细胞

3）发育期间普遍存在于机体外组织

4）应当容易识别

5）在胚胎中应处于中性

标记方法

1）人工标记---活体染色素或油等珠状物放射性物质等

2）遗传标记---反应生物个体或群体特征的某些性状物质

体外受精：

将动物的精子与卵子置于体外在人工条件下完成受精的过程称为体外受精

体外受精的优点：

基础研究方面1能直接观察到受精的动态过程2可以得到难以得到的一些动物的受精卵应用研究方面3可以作为治疗不孕症的一种方法4可为其它新技术的应用提供更多的胚胎来源

体外受精的程序

1配子获得输卵管卵+体内获能的精子输卵管卵+体外获能的精子卵泡卵+体内获能的精子卵泡卵体+外获以能的精子

1卵子的采取非激素处理法激素处理法

2精子的采取屠宰法射出的精子

2配子培养

2.1培养基单纯培养基复合培养基

2.2配子处理与培养系统

精子处理1）Percoll密度梯度离心法2）精子上游分离法

精子孵育诱发获能+体液（卵泡液、血清等）+限定培养液或合成培养液

方法1）高PH孵育法2）钙离子载体法3）肝素钙孵育法

培养系统：

开放式培养系统、封闭式培养系统和滴培养

　　滴培养：

培人皿---培养液---卵子---冲洗---石腊油---CO2培养箱培养（动物有特定温度表）

卵子成熟的标志

卵丘细胞的成熟判别：

1）卵丘细胞的分散程度2）卵丘细胞内空泡变大3）卵丘细胞异染色质增多、核孔明显、核空泡化

卵母细胞核的成熟判别：

4）核迁移至动物极质膜下成为生发泡（GerminalVesicle,GV）

卵母细胞质的成熟判别：

5）胞内皮质颗粒由匀散状态向质膜下迁移

6）高尔基复合体由核周围移向皮质迁移---消失

7）线粒体由核周围——皮质区——核周围

8）早期粗面内质网（RER）丰富成熟时RER减少

授精（分配卵子到精子悬浮液中）过程看到的现象：

1、在透明带表面可以看到很多精子

2、多精子受精频率增加

3、精子超活化现象

受精的标准

1）少数动物卵母细胞内可见到精子

2）卵母细胞质中有膨胀的精子头部

3）卵周隙内存在第二极体或明确的第一极体

4）卵子激活排出第二极体

5）雌雄原核形成并融合

6）卵周隙变大有时见到精子

4影响受精的因素：

温度精子数培养的条件

牛体外受精操作程序：

1配制配子洗涤液、培养液、受精液2采集处理配子3授精

体外受精液中有关成分的作用

1犊牛血清和血白蛋白乳酸丙酮酸

2咖啡因和肝素

3FSH和PMSG

精子注射：

把精子直接注射到透明带下卵周隙中或注意到卵细胞质中有人将前者称为精子转移或精子植入，后者称为精子注射

精子注射处理与要求：

注入细胞质的精子可以是不活动的精子或精核

注入卵周隙的精子应为活动的已获能的和已发生顶体反应的精子才能获得较高的受精率

为避免精子在注射针内移动必需限制精子活动：

一是将精子加入含有甲基纤维素的粘稠培养液中

二是将精子冷却到10oC

三是为便于精子注射可设法加大卵周隙：

生精细胞显微受精

生精细胞显微受精是利用变态前的球形精子细胞（次级精母细胞或初级精母细胞）与不同发育时期的卵母细胞进行受精它包括透明带下授精和卵母细胞质内受精

3.1意义与作用：

揭示雌雄配子间的相互作用和受精本质

保护和挽救濒危珍稀动物品种

利用初情期以前幼年动物繁殖后代

治疗老龄与先天性异常引起的雄性动物不育症

若用精细胞进行转基因所得的后代一定是全部携带目的基因的个体将分离到体外的精细胞移植到睾丸中没有精细胞的小鼠曲精细管内可获得移植精细胞发育的后代

3.2方法电融合法卵胞质内注射法

3.3技术研究与应用

细胞周期与卵激活差异

正常受精卵子停滞于第二次减数分裂中精子已完成减数分裂

显微受精

显微受精成功的动物与存在问题

成功的动物：

小鼠刘灵等仑鼠兔

存在的问题：

2/3的雄原核较小但不影响胚胎进一步发育

ICSI与IFV比较25%受精卵不能同步形成雌雄原核

7%受精卵可能形成3个原核

体外受精胚胎在体外的发育往往不能与子宫

完全同期化，在囊胚移植时需要做辅助脱出透明带处理，而且体外受精的结果不同。

核移植

1、概念：

借助显微操作和细胞融合技术把遗传型不同的胚胎细胞核和卵细胞质相结合重组成新的合子的过程得到的胚胎称为重组胚（reconstitutedembryos）或核移植胚

2目的：

1）查明胚胎细胞核和体细胞核是否保持合子细胞核的全部遗传信息

2）体细胞核是否能代替合子核所起的作用

3）转移供体核基因生产多个同基因动物

4）作为动物和人类疾病模型5）作为生产药物的天然工厂

现代生物学中克隆技术又称为“生物放大技术”它经历三个发展阶段：

1）微生物克隆2）生物技术克隆3）动物克隆

克隆技术发展的过程

哺乳动物核移植的起始人Mcgranth和Solter

第一个报道成功的是Illmensee和Hope

二核移植必须具备的条件

1显微操作设备2制作吸管装置3体外培养系统

三核移植的方法

1核供/受体细胞来源与当前需要解决的问题

核供体：

胚胎细胞：

目前主要是用桑椹期前的卵裂球

成体细胞：

胎儿的成纤维细胞

乳腺上皮细胞输卵管细胞

卵丘细胞孤雌生殖细胞

成体细胞从增殖的角度可分为三类：

1）连续分裂细胞2）休眠细胞3）分化细胞

核受体：

处于中期Ⅱ的卵母细胞

调节细胞周期的方法

其一采用人工捕获的方法，即通过限制细胞培养基中某些成份，从而使大部分细胞滞留在细胞周期的某一阶段；

其二通过选择细胞类型来获得

当前需要解决的问题：

远缘细胞核移植受体细胞选择

关于核供体和核受体细胞质的协调性

重构胚的卵裂速度与供核体细胞的发育速度一致

与生殖系统关系越密切的细胞重构胚发育潜力越大

核质重构后代性状主要与供体相似或为核质混合状态

性别控制方法

X和Y精子的分离

X和Y精子的分离方法A沉降法B密度梯度离心法：

C电泳法D流式细胞分选法

性别鉴定1非损害性方法

1）测定与X染色体相关联的酶的活性

2）免疫法（H—Y抗原法或单克隆抗体法）

方法：

①免疫动物选择（高度近交系）②制备抗血清③H—Y抗原检测

A细胞毒性分析法

B免疫荧光分析法

C囊胚形成抑制法；

2损害性方法

1）细胞遗传学分析（又称核型鉴定）

特点准确率100%

获得高质量的中期染色体分裂相难

取样①滋养层细胞②卵裂球③分割半胚

2）分子生物学分析法（DNA探针（原位杂交技术FISH））

方法以待检测的核酸序列为模板　用TAQ酶催化引物　限制DNA合成经变性　退火　延伸三个步骤可使扩增片断以2N的指数积累即在2小时内使待检测的核酸扩展数百万倍

特点特异好灵敏度高简便快速

难点分离Y染色体序列分离SRY序列确定序列位置及拷贝数

转基因是将特定的外源基因导入动物受精卵或胚胎使之稳定整合于动物的染色体组并能遗传给后代的技术。

能检测出导入新DNA的动物就称为转基因动物。

通过使用实验手段将外源基因导入动物的生殖细胞并由此发育成个体且整合外源基因又能向后代遗传的动物称为转基因动物。

携带外源基因并能表达遗传的动物称为转基因动物而外源基因可能只整合入动物部分组织、细胞的基因组，称为嵌合体动物。

转基因的意义

经典育种方法的限制性遗传信息只能在同种或亲缘关系很近的种间才有可能交换重组选择的条件是变异或突变自然变异的比例不足1%可在没有亲缘关系的种间进行遗传信息交换和重组可在很短时间产生服从于人们需要的突变

具体表现在：

可作为生命现象解密的工具

1）转基因动物疾病模型可用来进行疾病发病学和治疗性研究；

2）可以提高家畜的经济性状

3）可从遗传上改变畜产品的组成结构

4）以家畜为宿主生产有用的生理活性物质

　　转基因技术的优点：

可以培育出生产性状优良的超级动物群

可以制备出高增殖的蛋白和激素类药物

可以按人的需求提供动物产品

二家畜转基因的方法

原生质体融合法重组病毒感染法微细胞介导法高速冷冻法细胞融合法显微注射法精子载体法胚胎细胞介导法逆转录病毒法等乳腺暂态表达

家畜转基因的方法

1显微注射法（microinjection）

在显微镜下借助玻璃微吸管将外源基因注射进细胞的一种方法。

这种方法是建立得最早也是最有效的方法其最大