原位杂交具体步骤.docx

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原位杂交具体步骤

原位杂交流程

以下是用含有cDNA的质粒酶切出DNA片段标记探针对石蜡切片进行mRNA检

测的流程图。

这些实验操作方法很多参考书中均有但没有一本书是专为这个目的而系

统地加以总结的因此特加以综合供同行参考在具体操作过程中很多地方可酌情变更。

在临床应用中常常可以买到已经标记好的商品探针那么前面一大部分扩增基因、

酶切鉴定、标记探针的工作就可以省去从石蜡切片处理做起即可。

下面介绍的方法笔者已亲手做过数次可获满意结果。

主要操作步骤

制备感受态细菌

用含目的基因的质粒转化细菌

小量培养转化的细菌

小量提取质粒

小量酶切质粒

电泳鉴定

大量培养转化的细菌

大量提取质粒

大量酶切质粒

电泳分离、回收及纯化

标记探针

石蜡切片的处理

预杂交、杂交

杂交后处理

抗体连接、显色

制备感受态细菌

【试剂及配制】

1LB液体培养基

在900ml三蒸水中加入

胰蛋白胨（bacto-tryptone）10g

酵母提取物（bacto-extract）5g

NaCl10g

磁力搅拌使完全溶解用5molNaOH调节pH至7.0如用进口试剂则不必调。

定

容为1000ml高压灭菌20min。

20.1molCaCl2溶液

1.1g无水氯化钙溶于90ml三蒸水中定容至100ml用0.22μm滤器过滤除菌置

于灭菌试剂瓶中4℃保存。

【材料】

大肠杆菌单菌落或冻存菌种也可复苏陈旧的感受态细菌重新制备新的感受态。

【操作方法】

1从37℃培养1216h的平板中用无菌的接种环用前酒精灯烧红晾凉挑一单菌

落转入含有5mlLB培养基的无菌试管37℃振摇200r/min过夜。

次日取菌液1ml

加入含100mlLB培养基的500ml锥形烧瓶37℃振摇培养200300r/min约23h

将烧瓶取出立即置冰浴1015min

2以下均为无菌操作。

在超静工作台中将细菌转移到一个灭过的冰预冷50ml离心

管中

34℃离心5000g×10min回收细菌

4弃去培养液将管倒置于滤纸上1min流尽培养液

5用冰预冷的0.1molCaCl210ml重悬菌体置冰浴30min

64℃离心5000g×10min弃上清倒置于滤纸上1min

7加4ml用冰预冷的0.1molCaCl2重悬菌体动作要轻

8置4℃冰箱1224h即可用于转化。

感受态细菌的冻存

一次制备的感受态不能用完可冻存起来备用。

将甘油装1.5mlEP管中沸水浴

10min以杀菌。

将感受态细菌分装成400μm一份每份加30%体积的甘油充分混匀

置-70℃冰箱一年内可使用。

用含目的基因的质粒转化细菌

【试剂及配制】

1LB液体培养基

2氨苄青霉素Amp选择性培养基

LB培养基中加入1.5%的琼脂15g/L高压灭菌20min取出在无菌条件下冷

却至50℃左右时烧手但尚可忍受加入抗生素或其他必需成分如为氨苄青霉素Amp

选择性培养基则以50mg/ml的氨苄青霉素贮存液按50μg/ml的量加入即每ml培养

基加入1μl氨基苄。

3氨苄贮存液

将氨苄青霉素钠溶于三蒸水配成50mg/ml溶液以0.22μm滤纸过滤1ml一份

分装存于-20℃。

【操作方法】

1无菌状态下取新鲜感受态200μl置于无菌的10ml玻璃试管中。

如果使用冻存的

感受态细菌时将其从-70℃冰箱取出握于手中待其解冻后立即吸取200μl转移至

10ml无菌玻璃试管中剩余的感受态弃去不能再冻存复用

2每管加质粒50100ng轻轻旋转以混合内容物在冰上放置30min

342℃水浴热休克90s不要摇动试管

4每管加无抗生素的LB培养基1ml37℃摇床温和摇振100150r/min45min

5用无菌的弯头玻璃铺菌器用前酒精灯烧再晾凉将200μl菌液铺于含氨苄青

霉素的琼脂平板表面37℃放置20min然后倒置培养1420h37℃。

小量培养转化的细菌

【操作方法】

1取灭菌处理的10ml玻璃试管用无菌吸管加入约5mlLB液体培养基再加入

50mg/ml氨苄青霉素5μl

2用接种环或无菌牙签挑取单菌落送入培养液中晃动使细菌进入培养液封好管口

337℃摇床100200r/min约612h可过夜使生长饱和。

质粒的少量提取

【试剂及配制】

1溶液Ⅰ

葡萄糖C6H12O6·H2O1.982g

三蒸水160ml

0.5molEDTApH8.04ml

1molTris-ClpH8.05ml

以三蒸水定容至200ml高压灭菌4℃保存

0.5molEDTApH8.0的配制

Na2EDTA·H2O186.1g如无水则为175g

三蒸水700ml

边磁力搅拌边加入固体NaOH缓慢少量加入待充分溶解pH接近8.0用酸度计

调节pH8.0HCl/NaOH

1molTris-ClpH8.0的配制

Tris碱121g

三蒸水800ml

充分搅拌用浓盐酸将pH调节至8.0酸度计测量

2溶液Ⅱ

配制50ml的量现用现配。

10molNaOH1ml

三蒸水40ml

10%SDS5ml

用三蒸水定容至50ml

10molNaOH的配制

40gNaOH晶体加三蒸水至100ml

10%SDS的配制

戴口罩称10gSDS溶于80ml三蒸水中68℃助溶加数滴1molHCl调pH7.2

定容至100ml

1molHCl的配制

于通风橱中三蒸水91.4ml浓盐酸8.6ml混匀

3溶液Ⅲ

5mol乙酸钾60ml

冰乙酸11.5ml

三蒸水28.5ml

高压灭菌4℃保存

5mol乙酸钾配制200ml

乙酸钾98.14g

三蒸水160ml

搅拌溶解定容至200ml;

43ml乙酸钠NaAcpH5.2

配制500ml

乙酸钠CH3COONa·H2O201.1g

三蒸水200ml

用冰乙酸调节pH为5.2三蒸水定容至500ml高压灭菌4℃保存。

5平衡酚

在粗酚中加入0.1%8-巯基喹啉然后倒入0.1molTris-ClpH8.0避光磁力搅拌4h

静置后移去水相再加0.1molTris-ClpH8.0搅拌、去除水相反复进行直到水相pH>7.8

时为止装棕色瓶4℃保存。

6TE缓冲液pH8.0

配制最终使10mmolTris-ClpH8.0

1mmolEDTApH8.0

7其它试剂氯仿乙戊醇V/V=241、无水乙醇、70%乙醇

【操作方法】

1取1ml菌液置于1.5ml的EP管中10000g×30s离心

2控尽上清液

3加溶液Ⅰ100μl重悬菌体

4加溶液Ⅱ200μl倒转均匀

5加溶液Ⅲ150μl混匀

610000g×5min离心

7转移上清至另一EP管

8加等体积平衡酚混匀室温离心8000g×5min

9小心吸取上清转移至另一EP管中勿将酚层吸出

10重复8、9的步骤

11等体积氯仿乙戊醇混匀

12离心8000g×5min

13转移上清至另一EP管

14加1/10体积3molNaAcpH5.2和2.5倍体积的无水乙醇混匀

15置液氮10min或-20℃冰箱1h

16离心10000g×10min

17弃上清留沉淀70%乙醇洗一次

18离心10000g×10min

19弃上清留沉淀晾干

20加TEpH8.050μl溶解沉淀

21加RNaseA（10mg/ml）35μl混匀稍离心

2237℃水浴30min

23-20℃保存待用。

小量酶切质粒

鉴定常用20μl反应体系。

【操作方法】

1在灭菌的新EP管中加入7μl三蒸水

2加入10×缓冲液2μl

3加限制酶5μl

4最后加入质粒DNA10μl

5稍离心混匀

637℃水浴11.5h

7无水乙醇沉淀2.5倍体积无水乙醇混匀液氮10min或-20℃30min离心

8弃上清晾干加10μlTE建立第二个酶切体系37℃11.5h

电泳鉴定

【试剂及配制】

10.5×TBE

先配5×TBE贮存液然后用三蒸水稀释10倍

5×TBE配制1000ml

Tris碱54g

硼酸27.5g

0.5molEDTApH8.02ml

2EB10mg/ml

3琼脂糖

4上样缓冲液

0.25%溴酚蓝

0.25%二甲苯青FF

30%甘油

【操作方法】

1用胶带纸封住洗净、晾干的电泳胶盒两端放好梳齿水平放置于工作台上

20.5×TBE+琼脂糖1%电炉上融化勿暴沸待其冷却至5060℃时加

入EB约5μl充分混匀

3将凝胶倒入胶模厚约35mm避免产生气泡

4在室温中放置3045min撕去胶带纸放入电泳槽电泳槽内为0.5×TBE应

没过凝胶去除梳齿预电泳10min

5将DNA样品与上样缓冲液混合加进上样孔内应设一marker作对照

660100V恒压电泳使DNA向阳极移动黑线为负极红线为正极

7电泳完成后戴塑料手套取出胶盒将凝胶放紫外灯下观察有无切出的电泳带。

大量培养转化的细菌

小量酶切鉴定证实细菌内含有目的基因即可大量培养。

【操作方法】

在500ml灭菌处理过的培养瓶中加LB培养基200ml加入50mg/ml的氨苄贮存液

200μl将小量培养的菌液取2ml加入瓶中37℃200300r/min振摇培养610h

可过夜。

大量提取质粒

常用碱裂解法。

【试剂及配制】

1.溶液Ⅰ

2.溶液Ⅱ

3.溶液Ⅲ

4.异丙醇

5.3molNaAcpH5.2

6.平衡酚pH8.0

7.氯仿乙戊醇241

8.无水乙醇

9.70%乙醇

10.TEpH8.0

11.RNaseA（10mg/ml）

12.溶菌酶

取100mg溶菌酶用2ml三蒸水溶解分装成200μl/管贮存于-20℃备用

【操作方法】

1扩增好的菌液装入50ml离心管中置冰浴10min

24℃离心5000×10min

3将沉底的细菌收集到一只50ml离心管中再离心弃上清将离心管倒置滤纸

上1min控干残液

4加入6ml冰预冷的溶液Ⅰ200μl溶菌酶充分振摇混匀

5加溶液Ⅱ10ml缓慢振摇以充分混匀内容物室温放置10min

6加入8ml冰预冷的溶液Ⅲ小心摇动离心管以混匀内容物置冰酒精浴10min

74℃离心10000g×10min

8小心倒出上清弃沉淀如有沉淀再次离心

9加入0.6体积异丙醇充分混匀-20℃放置20min

104℃离心10000g×10min

11弃上清晾干2mlTEpH8.0溶解沉淀

12加入2ml冰预冷的5molLiCl溶液并混匀

134℃离心10000g×10min

14将上清转移至另一离心管加入0.6体积异丙醇充分混匀-20℃放置20min

154℃离心10000g×10min

16弃上清70%乙醇洗一次4℃离心10000g×10min弃上清晾干

17将沉淀溶于1.2mlTEpH8.0中

18加RNaseA30μl封管口37℃水浴30min

19将样品分装2个EP管各加等体积平衡酚混合

20室温离心5000g×5min

21将上层水相转移至另一EP管小心勿吸出酚相

22重复平衡酚抽提

23等体积氯仿异戊醇241抽提

24室温离心5000g×5min

25回收上层水相勿吸出氯仿

26加1/10体积3molNaAC（pH5.2）再加2.5体积无水乙醇充分混匀置-20℃30min

或液氮10min

27室温离心12000g×15min

28弃上清70%乙醇洗一次再离心

29晾干溶于500μlTEpH8.0-20℃保存

30取2μl稀释至200μl用紫外分光光度计测260nm、280nmOD值

OD260/OD280=1.72.0如小于1.7蛋白未提净大于2.0有机溶剂多。

DNA含量为

OD260×50μg/ml。

大量酶切质粒

【操作方法】

1在新的灭菌EP管中依次加入

三蒸水70μl

10×缓冲液10μl

限制酶5μl

质粒DNA2μg/μl15μl

稍离心以混匀

237℃水浴1.52h

3取5μl电泳鉴定酶解效果如不完全可延长时间或加限制酶

4双酶解反应如两种酶可用同一缓冲液则可同时加入一个体系稍增加反应体

积否则以乙醇沉淀晾干重建第二个反应体系。

电泳分离、回收及纯化DNA片段

电泳的方法如前述不同点在于①使用低熔点琼脂糖在4℃冰箱中电泳②将

23个梳齿用透明胶布粘在一起以增加上样量。

从低熔点琼脂糖中回收及纯化DNA

【操作方法】

1在紫外灯下将含有所需DNA片段的凝胶条切下放入EP管中加入2倍体积的

TE缓冲液在70℃保温10min使凝胶条融化

2冷却至室温加等体积平衡酚充分混匀后以6000g离心10min回收水相注

意不要将界面处的白色物质即粉状的琼脂糖吸出再用等体积的氯仿/乙戊醇抽提一

次

3将上清液转移到一个新的离心管中加入0.2体积的10mol的乙酸胺和2倍体积

的无水乙醇置-20℃冰箱20min离心沉淀核酸晾干后以TE溶解。

取2μl稀释至

200μl测DNA浓度。

标记探针

使用BoehringerMannheim地高辛标记探针试剂盒。

【操作方法】

11μl模板DNA加灭菌三蒸水至最终体积为16μl

210min沸水浴立即冰乙醇冷轧

3加入4μl探针标记液试剂盒中vial1稍微离心混匀

437℃水浴20h

5加入2μl0.2molEDTApH8.0或加热65℃10min以终止反应。

石蜡切片的处理

【试剂及配制】

1二甲苯

2乙醇100%95%90%75%

3甲醇

40.2molHCl

50.1%TritonX-100

60.2%甘氨酸PBS

75mmolMgCl2-PBS

8PBS

配制配成10×的贮存液用时稀释10倍

NaCl80g137mmol

KCl2g2.7mmol

Na2HPO4·7H2O11.5g4.3mmol

KH2PO42g1.4mmol

配成1000mlpH7.3高压灭菌。

9蛋白酶K

0.1molTris-ClpH8.0加50mmolEDTApH8.0配制浓度为1μg/ml。

104%多聚甲醛

在通风橱中配制称40g多聚甲醛溶于装有500mlDEPC水的烧瓶中加热65℃并

磁力搅拌使成乳白色悬液用1molNaOH调节pH7.0呈清亮状再加入约450ml的

2×PBS充分混匀再检查pH过滤后定容至1000ml4℃保存。

【操作方法】

1将烤好的切片入二甲苯Ⅰ30min二甲苯Ⅱ、Ⅲ各10min

2逐级酒精入水100%、95%、90%、75%各5min甲醇冲洗5min×2

3用三蒸水或PBS快速洗2次

40.2molHCl室温作用10min0.1%TritonX-100作用15min

50.2%甘氨酸-PBS室温孵育15min

6蛋白酶K37℃消化1530min

70.2%甘氨酸-PBS室温孵育15min

8PBS-5mmolMgCl2洗2次各10min

94%多聚甲醛室温下固定15min

10PBS-5mmolMgCl2洗2次各10min

11逐级酒精脱水37℃烤干保存。

预杂交、杂交

【试剂及配制】

12×SSC

先配制20×SSC贮存液用时稀释。

NaCl175g3mol

枸椽酸三钠·2H2O88g0.3mol

三蒸水加至1000ml用1molHCl调pH7.0

24×SSC/50%去离子甲酰胺V/V

去离子甲酰胺的配制500ml甲酰胺与25gBio-RadAG501-X8（2050目）混合室

温避光搅拌4h过滤分装为50ml-20℃存放

3100×Denhardt液

聚蔗糖10g

聚乙烯吡咯烷酮10g

牛血清白蛋白10g

消毒三蒸水定容至100ml

4预杂交液

去离子甲酰胺5ml

20×SSC2.5ml

加温至50℃加入硫酸葡聚糖1g

聚合物溶解后加入100×Denhardt500μl

10%SDS500μl

10mg/ml变性鲱鱼精子DNA100μl

消毒三蒸水400μl

充分混合

5杂交液

将标记好的探针用沸水浴10min立即冰酒精冷轧用预杂交液将探针稀释至0.5

5ng/μl。

【操作方法】

1用2×SSC简洗15min

24×SSC/50%去离子甲酰胺37℃孵育15min

3每片加预杂交液50μl放入湿盒42℃孵育2h

4去除预杂交液每片加杂交液50μl放湿盒中42℃杂交1218h不能超过

24h。

杂交后处理

【试剂及配制】

12×SSC

22×SSC/50%去离子甲酰胺

31×SSC/50%去离子甲酰胺

4PBS

54×SSC/10mmolDTT

先配制1molDTT通风橱中称3.1gDTT溶于20ml消毒三蒸水中用时取2ml加

入198ml4×SSC

【操作方法】

1杂交完毕后用2×SSC洗涤12min

22×SSC/50%去离子甲酰胺42℃10min

31×SSC/50%去离子甲酰胺37℃30min

44×SSC/10mmolDTT1h

50.1×SSC40℃2×30min

6PBS洗10min然后置于PBS中直到进行下一步。

抗体连接、显色

【试剂及配制】

1缓冲液Ⅰ

配1000ml,需加入

顺丁烯二酸11.6g

NaCl8.8g

用10molNaOH将pH调至7.5高压消毒

2缓冲液Ⅱ

先制备阻断剂储存液取试剂盒中阻断剂按10%V/V加入溶液Ⅰ混匀用微

波炉加热使其完全溶解高压消毒后4℃或-20℃保存。

用时取上述10%阻断剂储存液

用缓冲液Ⅰ按110稀释即制成缓冲液Ⅱ

3缓冲液ⅢpH9.5

配制1000ml

Tris-Cl12.1g100mmol

NaOH5.84g100mmol

MgCl210.2g50mmol

4缓冲液ⅣpH8.0

Tris-Cl（pH8.0）10mmol

EDTA（pH8.0）1mmol

【操作方法】

12×SSC洗涤2×5min40℃

20.1×SSC2×30min40℃

3缓冲液Ⅰ洗室温2min振摇

4缓冲液Ⅱ洗室温30min振摇

5擦去组织周围缓冲液加抗地高辛抗体vial415005000用缓冲液Ⅱ稀

释室温下于湿盒内2h

6缓冲液Ⅰ室温洗2×15min

7缓冲液Ⅲ室温洗3min

8擦去组织周围缓冲液加显色液vial5200μl用缓冲液Ⅱ稀释至10ml放

湿盒中室温避光显色2h至过夜

9显微镜下检查阳性颗粒显深蓝色获满意结果后终止反应

10缓冲液Ⅰ洗涤室温5min

11缓冲液Ⅳ洗涤室温2min

12用中性红或核固红复染细胞核数秒水冲洗晾干后甘油封片。