原位杂交具体步骤.docx
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原位杂交具体步骤
原位杂交流程
以下是用含有cDNA的质粒酶切出DNA片段标记探针对石蜡切片进行mRNA检
测的流程图。
这些实验操作方法很多参考书中均有但没有一本书是专为这个目的而系
统地加以总结的因此特加以综合供同行参考在具体操作过程中很多地方可酌情变更。
在临床应用中常常可以买到已经标记好的商品探针那么前面一大部分扩增基因、
酶切鉴定、标记探针的工作就可以省去从石蜡切片处理做起即可。
下面介绍的方法笔者已亲手做过数次可获满意结果。
主要操作步骤
制备感受态细菌
用含目的基因的质粒转化细菌
小量培养转化的细菌
小量提取质粒
小量酶切质粒
电泳鉴定
大量培养转化的细菌
大量提取质粒
大量酶切质粒
电泳分离、回收及纯化
标记探针
石蜡切片的处理
预杂交、杂交
杂交后处理
抗体连接、显色
制备感受态细菌
【试剂及配制】
1LB液体培养基
在900ml三蒸水中加入
胰蛋白胨(bacto-tryptone)10g
酵母提取物(bacto-extract)5g
NaCl10g
磁力搅拌使完全溶解用5molNaOH调节pH至7.0如用进口试剂则不必调。
定
容为1000ml高压灭菌20min。
20.1molCaCl2溶液
1.1g无水氯化钙溶于90ml三蒸水中定容至100ml用0.22μm滤器过滤除菌置
于灭菌试剂瓶中4℃保存。
【材料】
大肠杆菌单菌落或冻存菌种也可复苏陈旧的感受态细菌重新制备新的感受态。
【操作方法】
1从37℃培养1216h的平板中用无菌的接种环用前酒精灯烧红晾凉挑一单菌
落转入含有5mlLB培养基的无菌试管37℃振摇200r/min过夜。
次日取菌液1ml
加入含100mlLB培养基的500ml锥形烧瓶37℃振摇培养200300r/min约23h
将烧瓶取出立即置冰浴1015min
2以下均为无菌操作。
在超静工作台中将细菌转移到一个灭过的冰预冷50ml离心
管中
34℃离心5000g×10min回收细菌
4弃去培养液将管倒置于滤纸上1min流尽培养液
5用冰预冷的0.1molCaCl210ml重悬菌体置冰浴30min
64℃离心5000g×10min弃上清倒置于滤纸上1min
7加4ml用冰预冷的0.1molCaCl2重悬菌体动作要轻
8置4℃冰箱1224h即可用于转化。
感受态细菌的冻存
一次制备的感受态不能用完可冻存起来备用。
将甘油装1.5mlEP管中沸水浴
10min以杀菌。
将感受态细菌分装成400μm一份每份加30%体积的甘油充分混匀
置-70℃冰箱一年内可使用。
用含目的基因的质粒转化细菌
【试剂及配制】
1LB液体培养基
2氨苄青霉素Amp选择性培养基
LB培养基中加入1.5%的琼脂15g/L高压灭菌20min取出在无菌条件下冷
却至50℃左右时烧手但尚可忍受加入抗生素或其他必需成分如为氨苄青霉素Amp
选择性培养基则以50mg/ml的氨苄青霉素贮存液按50μg/ml的量加入即每ml培养
基加入1μl氨基苄。
3氨苄贮存液
将氨苄青霉素钠溶于三蒸水配成50mg/ml溶液以0.22μm滤纸过滤1ml一份
分装存于-20℃。
【操作方法】
1无菌状态下取新鲜感受态200μl置于无菌的10ml玻璃试管中。
如果使用冻存的
感受态细菌时将其从-70℃冰箱取出握于手中待其解冻后立即吸取200μl转移至
10ml无菌玻璃试管中剩余的感受态弃去不能再冻存复用
2每管加质粒50100ng轻轻旋转以混合内容物在冰上放置30min
342℃水浴热休克90s不要摇动试管
4每管加无抗生素的LB培养基1ml37℃摇床温和摇振100150r/min45min
5用无菌的弯头玻璃铺菌器用前酒精灯烧再晾凉将200μl菌液铺于含氨苄青
霉素的琼脂平板表面37℃放置20min然后倒置培养1420h37℃。
小量培养转化的细菌
【操作方法】
1取灭菌处理的10ml玻璃试管用无菌吸管加入约5mlLB液体培养基再加入
50mg/ml氨苄青霉素5μl
2用接种环或无菌牙签挑取单菌落送入培养液中晃动使细菌进入培养液封好管口
337℃摇床100200r/min约612h可过夜使生长饱和。
质粒的少量提取
【试剂及配制】
1溶液Ⅰ
葡萄糖C6H12O6·H2O1.982g
三蒸水160ml
0.5molEDTApH8.04ml
1molTris-ClpH8.05ml
以三蒸水定容至200ml高压灭菌4℃保存
0.5molEDTApH8.0的配制
Na2EDTA·H2O186.1g如无水则为175g
三蒸水700ml
边磁力搅拌边加入固体NaOH缓慢少量加入待充分溶解pH接近8.0用酸度计
调节pH8.0HCl/NaOH
1molTris-ClpH8.0的配制
Tris碱121g
三蒸水800ml
充分搅拌用浓盐酸将pH调节至8.0酸度计测量
2溶液Ⅱ
配制50ml的量现用现配。
10molNaOH1ml
三蒸水40ml
10%SDS5ml
用三蒸水定容至50ml
10molNaOH的配制
40gNaOH晶体加三蒸水至100ml
10%SDS的配制
戴口罩称10gSDS溶于80ml三蒸水中68℃助溶加数滴1molHCl调pH7.2
定容至100ml
1molHCl的配制
于通风橱中三蒸水91.4ml浓盐酸8.6ml混匀
3溶液Ⅲ
5mol乙酸钾60ml
冰乙酸11.5ml
三蒸水28.5ml
高压灭菌4℃保存
5mol乙酸钾配制200ml
乙酸钾98.14g
三蒸水160ml
搅拌溶解定容至200ml;
43ml乙酸钠NaAcpH5.2
配制500ml
乙酸钠CH3COONa·H2O201.1g
三蒸水200ml
用冰乙酸调节pH为5.2三蒸水定容至500ml高压灭菌4℃保存。
5平衡酚
在粗酚中加入0.1%8-巯基喹啉然后倒入0.1molTris-ClpH8.0避光磁力搅拌4h
静置后移去水相再加0.1molTris-ClpH8.0搅拌、去除水相反复进行直到水相pH>7.8
时为止装棕色瓶4℃保存。
6TE缓冲液pH8.0
配制最终使10mmolTris-ClpH8.0
1mmolEDTApH8.0
7其它试剂氯仿乙戊醇V/V=241、无水乙醇、70%乙醇
【操作方法】
1取1ml菌液置于1.5ml的EP管中10000g×30s离心
2控尽上清液
3加溶液Ⅰ100μl重悬菌体
4加溶液Ⅱ200μl倒转均匀
5加溶液Ⅲ150μl混匀
610000g×5min离心
7转移上清至另一EP管
8加等体积平衡酚混匀室温离心8000g×5min
9小心吸取上清转移至另一EP管中勿将酚层吸出
10重复8、9的步骤
11等体积氯仿乙戊醇混匀
12离心8000g×5min
13转移上清至另一EP管
14加1/10体积3molNaAcpH5.2和2.5倍体积的无水乙醇混匀
15置液氮10min或-20℃冰箱1h
16离心10000g×10min
17弃上清留沉淀70%乙醇洗一次
18离心10000g×10min
19弃上清留沉淀晾干
20加TEpH8.050μl溶解沉淀
21加RNaseA(10mg/ml)35μl混匀稍离心
2237℃水浴30min
23-20℃保存待用。
小量酶切质粒
鉴定常用20μl反应体系。
【操作方法】
1在灭菌的新EP管中加入7μl三蒸水
2加入10×缓冲液2μl
3加限制酶5μl
4最后加入质粒DNA10μl
5稍离心混匀
637℃水浴11.5h
7无水乙醇沉淀2.5倍体积无水乙醇混匀液氮10min或-20℃30min离心
8弃上清晾干加10μlTE建立第二个酶切体系37℃11.5h
电泳鉴定
【试剂及配制】
10.5×TBE
先配5×TBE贮存液然后用三蒸水稀释10倍
5×TBE配制1000ml
Tris碱54g
硼酸27.5g
0.5molEDTApH8.02ml
2EB10mg/ml
3琼脂糖
4上样缓冲液
0.25%溴酚蓝
0.25%二甲苯青FF
30%甘油
【操作方法】
1用胶带纸封住洗净、晾干的电泳胶盒两端放好梳齿水平放置于工作台上
20.5×TBE+琼脂糖1%电炉上融化勿暴沸待其冷却至5060℃时加
入EB约5μl充分混匀
3将凝胶倒入胶模厚约35mm避免产生气泡
4在室温中放置3045min撕去胶带纸放入电泳槽电泳槽内为0.5×TBE应
没过凝胶去除梳齿预电泳10min
5将DNA样品与上样缓冲液混合加进上样孔内应设一marker作对照
660100V恒压电泳使DNA向阳极移动黑线为负极红线为正极
7电泳完成后戴塑料手套取出胶盒将凝胶放紫外灯下观察有无切出的电泳带。
大量培养转化的细菌
小量酶切鉴定证实细菌内含有目的基因即可大量培养。
【操作方法】
在500ml灭菌处理过的培养瓶中加LB培养基200ml加入50mg/ml的氨苄贮存液
200μl将小量培养的菌液取2ml加入瓶中37℃200300r/min振摇培养610h
可过夜。
大量提取质粒
常用碱裂解法。
【试剂及配制】
1.溶液Ⅰ
2.溶液Ⅱ
3.溶液Ⅲ
4.异丙醇
5.3molNaAcpH5.2
6.平衡酚pH8.0
7.氯仿乙戊醇241
8.无水乙醇
9.70%乙醇
10.TEpH8.0
11.RNaseA(10mg/ml)
12.溶菌酶
取100mg溶菌酶用2ml三蒸水溶解分装成200μl/管贮存于-20℃备用
【操作方法】
1扩增好的菌液装入50ml离心管中置冰浴10min
24℃离心5000×10min
3将沉底的细菌收集到一只50ml离心管中再离心弃上清将离心管倒置滤纸
上1min控干残液
4加入6ml冰预冷的溶液Ⅰ200μl溶菌酶充分振摇混匀
5加溶液Ⅱ10ml缓慢振摇以充分混匀内容物室温放置10min
6加入8ml冰预冷的溶液Ⅲ小心摇动离心管以混匀内容物置冰酒精浴10min
74℃离心10000g×10min
8小心倒出上清弃沉淀如有沉淀再次离心
9加入0.6体积异丙醇充分混匀-20℃放置20min
104℃离心10000g×10min
11弃上清晾干2mlTEpH8.0溶解沉淀
12加入2ml冰预冷的5molLiCl溶液并混匀
134℃离心10000g×10min
14将上清转移至另一离心管加入0.6体积异丙醇充分混匀-20℃放置20min
154℃离心10000g×10min
16弃上清70%乙醇洗一次4℃离心10000g×10min弃上清晾干
17将沉淀溶于1.2mlTEpH8.0中
18加RNaseA30μl封管口37℃水浴30min
19将样品分装2个EP管各加等体积平衡酚混合
20室温离心5000g×5min
21将上层水相转移至另一EP管小心勿吸出酚相
22重复平衡酚抽提
23等体积氯仿异戊醇241抽提
24室温离心5000g×5min
25回收上层水相勿吸出氯仿
26加1/10体积3molNaAC(pH5.2)再加2.5体积无水乙醇充分混匀置-20℃30min
或液氮10min
27室温离心12000g×15min
28弃上清70%乙醇洗一次再离心
29晾干溶于500μlTEpH8.0-20℃保存
30取2μl稀释至200μl用紫外分光光度计测260nm、280nmOD值
OD260/OD280=1.72.0如小于1.7蛋白未提净大于2.0有机溶剂多。
DNA含量为
OD260×50μg/ml。
大量酶切质粒
【操作方法】
1在新的灭菌EP管中依次加入
三蒸水70μl
10×缓冲液10μl
限制酶5μl
质粒DNA2μg/μl15μl
稍离心以混匀
237℃水浴1.52h
3取5μl电泳鉴定酶解效果如不完全可延长时间或加限制酶
4双酶解反应如两种酶可用同一缓冲液则可同时加入一个体系稍增加反应体
积否则以乙醇沉淀晾干重建第二个反应体系。
电泳分离、回收及纯化DNA片段
电泳的方法如前述不同点在于①使用低熔点琼脂糖在4℃冰箱中电泳②将
23个梳齿用透明胶布粘在一起以增加上样量。
从低熔点琼脂糖中回收及纯化DNA
【操作方法】
1在紫外灯下将含有所需DNA片段的凝胶条切下放入EP管中加入2倍体积的
TE缓冲液在70℃保温10min使凝胶条融化
2冷却至室温加等体积平衡酚充分混匀后以6000g离心10min回收水相注
意不要将界面处的白色物质即粉状的琼脂糖吸出再用等体积的氯仿/乙戊醇抽提一
次
3将上清液转移到一个新的离心管中加入0.2体积的10mol的乙酸胺和2倍体积
的无水乙醇置-20℃冰箱20min离心沉淀核酸晾干后以TE溶解。
取2μl稀释至
200μl测DNA浓度。
标记探针
使用BoehringerMannheim地高辛标记探针试剂盒。
【操作方法】
11μl模板DNA加灭菌三蒸水至最终体积为16μl
210min沸水浴立即冰乙醇冷轧
3加入4μl探针标记液试剂盒中vial1稍微离心混匀
437℃水浴20h
5加入2μl0.2molEDTApH8.0或加热65℃10min以终止反应。
石蜡切片的处理
【试剂及配制】
1二甲苯
2乙醇100%95%90%75%
3甲醇
40.2molHCl
50.1%TritonX-100
60.2%甘氨酸PBS
75mmolMgCl2-PBS
8PBS
配制配成10×的贮存液用时稀释10倍
NaCl80g137mmol
KCl2g2.7mmol
Na2HPO4·7H2O11.5g4.3mmol
KH2PO42g1.4mmol
配成1000mlpH7.3高压灭菌。
9蛋白酶K
0.1molTris-ClpH8.0加50mmolEDTApH8.0配制浓度为1μg/ml。
104%多聚甲醛
在通风橱中配制称40g多聚甲醛溶于装有500mlDEPC水的烧瓶中加热65℃并
磁力搅拌使成乳白色悬液用1molNaOH调节pH7.0呈清亮状再加入约450ml的
2×PBS充分混匀再检查pH过滤后定容至1000ml4℃保存。
【操作方法】
1将烤好的切片入二甲苯Ⅰ30min二甲苯Ⅱ、Ⅲ各10min
2逐级酒精入水100%、95%、90%、75%各5min甲醇冲洗5min×2
3用三蒸水或PBS快速洗2次
40.2molHCl室温作用10min0.1%TritonX-100作用15min
50.2%甘氨酸-PBS室温孵育15min
6蛋白酶K37℃消化1530min
70.2%甘氨酸-PBS室温孵育15min
8PBS-5mmolMgCl2洗2次各10min
94%多聚甲醛室温下固定15min
10PBS-5mmolMgCl2洗2次各10min
11逐级酒精脱水37℃烤干保存。
预杂交、杂交
【试剂及配制】
12×SSC
先配制20×SSC贮存液用时稀释。
NaCl175g3mol
枸椽酸三钠·2H2O88g0.3mol
三蒸水加至1000ml用1molHCl调pH7.0
24×SSC/50%去离子甲酰胺V/V
去离子甲酰胺的配制500ml甲酰胺与25gBio-RadAG501-X8(2050目)混合室
温避光搅拌4h过滤分装为50ml-20℃存放
3100×Denhardt液
聚蔗糖10g
聚乙烯吡咯烷酮10g
牛血清白蛋白10g
消毒三蒸水定容至100ml
4预杂交液
去离子甲酰胺5ml
20×SSC2.5ml
加温至50℃加入硫酸葡聚糖1g
聚合物溶解后加入100×Denhardt500μl
10%SDS500μl
10mg/ml变性鲱鱼精子DNA100μl
消毒三蒸水400μl
充分混合
5杂交液
将标记好的探针用沸水浴10min立即冰酒精冷轧用预杂交液将探针稀释至0.5
5ng/μl。
【操作方法】
1用2×SSC简洗15min
24×SSC/50%去离子甲酰胺37℃孵育15min
3每片加预杂交液50μl放入湿盒42℃孵育2h
4去除预杂交液每片加杂交液50μl放湿盒中42℃杂交1218h不能超过
24h。
杂交后处理
【试剂及配制】
12×SSC
22×SSC/50%去离子甲酰胺
31×SSC/50%去离子甲酰胺
4PBS
54×SSC/10mmolDTT
先配制1molDTT通风橱中称3.1gDTT溶于20ml消毒三蒸水中用时取2ml加
入198ml4×SSC
【操作方法】
1杂交完毕后用2×SSC洗涤12min
22×SSC/50%去离子甲酰胺42℃10min
31×SSC/50%去离子甲酰胺37℃30min
44×SSC/10mmolDTT1h
50.1×SSC40℃2×30min
6PBS洗10min然后置于PBS中直到进行下一步。
抗体连接、显色
【试剂及配制】
1缓冲液Ⅰ
配1000ml,需加入
顺丁烯二酸11.6g
NaCl8.8g
用10molNaOH将pH调至7.5高压消毒
2缓冲液Ⅱ
先制备阻断剂储存液取试剂盒中阻断剂按10%V/V加入溶液Ⅰ混匀用微
波炉加热使其完全溶解高压消毒后4℃或-20℃保存。
用时取上述10%阻断剂储存液
用缓冲液Ⅰ按110稀释即制成缓冲液Ⅱ
3缓冲液ⅢpH9.5
配制1000ml
Tris-Cl12.1g100mmol
NaOH5.84g100mmol
MgCl210.2g50mmol
4缓冲液ⅣpH8.0
Tris-Cl(pH8.0)10mmol
EDTA(pH8.0)1mmol
【操作方法】
12×SSC洗涤2×5min40℃
20.1×SSC2×30min40℃
3缓冲液Ⅰ洗室温2min振摇
4缓冲液Ⅱ洗室温30min振摇
5擦去组织周围缓冲液加抗地高辛抗体vial415005000用缓冲液Ⅱ稀
释室温下于湿盒内2h
6缓冲液Ⅰ室温洗2×15min
7缓冲液Ⅲ室温洗3min
8擦去组织周围缓冲液加显色液vial5200μl用缓冲液Ⅱ稀释至10ml放
湿盒中室温避光显色2h至过夜
9显微镜下检查阳性颗粒显深蓝色获满意结果后终止反应
10缓冲液Ⅰ洗涤室温5min
11缓冲液Ⅳ洗涤室温2min
12用中性红或核固红复染细胞核数秒水冲洗晾干后甘油封片。