原位杂交具体步骤.docx

1、原位杂交具体步骤原位杂交流程 以下是用含有cDNA的质粒酶切出DNA片段标记探针对石蜡切片进行mRNA检测的流程图。这些实验操作方法很多参考书中均有但没有一本书是专为这个目的而系统地加以总结的因此特加以综合供同行参考在具体操作过程中很多地方可酌情变更。 在临床应用中常常可以买到已经标记好的商品探针那么前面一大部分扩增基因、酶切鉴定、标记探针的工作就可以省去从石蜡切片处理做起即可。 下面介绍的方法笔者已亲手做过数次可获满意结果。 主要操作步骤 制备感受态细菌 用含目的基因的质粒转化细菌 小量培养转化的细菌 小量提取质粒 小量酶切质粒 电泳鉴定 大量培养转化的细菌 大量提取质粒 大量酶切质粒 电泳

2、分离、回收及纯化 标记探针 石蜡切片的处理 预杂交、杂交 杂交后处理 抗体连接、显色 制备感受态细菌 【试剂及配制】 1LB液体培养基 在900ml三蒸水中加入 胰蛋白胨(bacto-tryptone) 10g 酵母提取物(bacto-extract) 5g NaCl 10g 磁力搅拌使完全溶解用5mol NaOH调节pH至7.0如用进口试剂则不必调。定容为1000ml高压灭菌20min。 20.1mol CaCl2溶液 1.1g无水氯化钙溶于90ml三蒸水中定容至100ml用0.22m滤器过滤除菌置于灭菌试剂瓶中4保存。【材料】 大肠杆菌单菌落或冻存菌种也可复苏陈旧的感受态细菌重新制备新的感

3、受态。 【操作方法】 1从37培养1216h的平板中用无菌的接种环用前酒精灯烧红晾凉挑一单菌落转入含有5ml LB培养基的无菌试管37振摇 200r/min过夜。次日取菌液1ml加入含100ml LB培养基的500ml 锥形烧瓶37振摇培养200300r/min约23h将烧瓶取出立即置冰浴1015min 2以下均为无菌操作。在超静工作台中将细菌转移到一个灭过的冰预冷50ml离心管中 34离心5000g 10min回收细菌 4弃去培养液将管倒置于滤纸上1min流尽培养液 5用冰预冷的0.1mol CaCl2 10ml 重悬菌体置冰浴30min 64离心5000g 10min弃上清倒置于滤纸上1m

4、in 7加4ml 用冰预冷的0.1mol CaCl2 重悬菌体动作要轻 8置4冰箱1224h即可用于转化。 感受态细菌的冻存 一次制备的感受态不能用完可冻存起来备用。将甘油装1.5ml EP 管中沸水浴10min以杀菌。将感受态细菌分装成400m一份每份加30%体积的甘油充分混匀置-70冰箱一年内可使用。 用含目的基因的质粒转化细菌 【试剂及配制】 1LB液体培养基 2氨苄青霉素Amp选择性培养基 LB培养基中加入1.5%的琼脂15g/L高压灭菌20min取出在无菌条件下冷却至50左右时烧手但尚可忍受加入抗生素或其他必需成分如为氨苄青霉素Amp选择性培养基则以50mg/ml的氨苄青霉素贮存液按

5、50g/ml的量加入即每ml培养基加入1l氨基苄。 3氨苄贮存液 将氨苄青霉素钠溶于三蒸水配成50mg/ml溶液以0.22m滤纸过滤1ml一份分装存于-20。 【操作方法】 1无菌状态下取新鲜感受态200l置于无菌的10ml玻璃试管中。如果使用冻存的感受态细菌时将其从-70冰箱取出握于手中待其解冻后立即吸取200l 转移至10ml无菌玻璃试管中剩余的感受态弃去不能再冻存复用 2每管加质粒50100ng轻轻旋转以混合内容物在冰上放置30min 342 水浴热休克90s不要摇动试管 4每管加无抗生素的LB培养基1ml37摇床温和摇振100150r/min45min 5用无菌的弯头玻璃铺菌器用前酒精

6、灯烧再晾凉将200l菌液铺于含氨苄青霉素的琼脂平板表面37放置20min然后倒置培养1420h37。 小量培养转化的细菌 【操作方法】 1取灭菌处理的10ml 玻璃试管用无菌吸管加入约5ml LB液体培养基再加入50mg/ml 氨苄青霉素5l 2用接种环或无菌牙签挑取单菌落送入培养液中晃动使细菌进入培养液封好管口 337摇床100200r/min约612h可过夜使生长饱和。 质粒的少量提取 【试剂及配制】 1溶液 葡萄糖C6H12O6H2O 1.982g 三蒸水 160ml 0.5mol EDTA pH8.0 4ml 1mol Tris-Cl pH8.0 5ml 以三蒸水定容至200ml高压灭

7、菌4保存 0.5 mol EDTA pH8.0 的配制 Na2EDTAH2O 186.1g 如无水则为175g 三蒸水 700ml 边磁力搅拌边加入固体NaOH缓慢少量加入待充分溶解pH接近8.0用酸度计调节pH8.0 HCl/NaOH 1mol Tris-Cl pH8.0 的配制 Tris 碱 121g 三蒸水 800ml 充分搅拌用浓盐酸将pH调节至8.0酸度计测量 2溶液配制50ml的量现用现配。 10 mol NaOH 1ml 三蒸水 40ml 10% SDS 5ml 用三蒸水定容至50ml 10mol NaOH 的配制 40g NaOH晶体加三蒸水至100ml 10% SDS 的配制

8、 戴口罩称10g SDS溶于80ml三蒸水中68助溶加数滴1mol HCl调pH7.2定容至100ml 1mol HCl 的配制 于通风橱中三蒸水91.4ml浓盐酸8.6ml混匀 3溶液 5mol 乙酸钾 60ml 冰乙酸 11.5ml 三蒸水 28.5ml 高压灭菌4保存 5mol 乙酸钾配制200ml 乙酸钾 98.14g 三蒸水 160ml 搅拌溶解定容至200ml; 43ml 乙酸钠NaAcpH5.2 配制500ml 乙酸钠CH3COONaH2O 201.1g 三蒸水 200ml 用冰乙酸调节pH为5.2三蒸水定容至500ml高压灭菌4保存。 5平衡酚 在粗酚中加入0.1% 8-巯基喹

9、啉然后倒入0.1mol Tris-Cl pH8.0避光磁力搅拌4h静置后移去水相再加0.1mol Tris-Cl pH8.0搅拌、去除水相反复进行直到水相pH7.8时为止装棕色瓶4保存。 6TE 缓冲液 pH8.0 配制最终使10mmol Tris-Cl pH8.0 1mmol EDTA pH8.0 7其它试剂氯仿乙戊醇V/V=241、无水乙醇、70%乙醇 【操作方法】 1取1ml菌液置于1.5ml的EP管中10000g30s 离心 2控尽上清液 3加溶液 100l重悬菌体4加溶液 200l 倒转均匀 5加溶液 150l 混匀 610000g5min 离心 7转移上清至另一EP管 8加等体积平

10、衡酚混匀室温离心8000g5min 9小心吸取上清转移至另一EP管中勿将酚层吸出 10重复8、9的步骤 11等体积氯仿乙戊醇混匀 12离心8000g5min 13转移上清至另一EP管 14加1/10体积3mol NaAc pH5.2 和2.5倍体积的无水乙醇混匀 15置液氮10min 或-20冰箱1h 16离心10000g10min 17弃上清留沉淀70%乙醇洗一次 18离心10000g10min 19弃上清留沉淀晾干 20加TE pH8.0 50l 溶解沉淀 21加RNase A (10mg/ml) 35l 混匀稍离心 2237 水浴30 min 23-20 保存待用。 小量酶切质粒 鉴定常

11、用20l反应体系。 【操作方法】 1在灭菌的新EP管中加入7l三蒸水 2加入10缓冲液2l 3加限制酶5l 4最后加入质粒DNA10l 5稍离心混匀 637水浴11.5h 7无水乙醇沉淀2.5倍体积无水乙醇混匀液氮10min或-20 30min离心 8弃上清晾干加10l TE建立第二个酶切体系37 11.5h 电泳鉴定【试剂及配制】 10.5 TBE 先配5 TBE贮存液然后用三蒸水稀释10倍 5 TBE配制1000ml Tris 碱 54g 硼酸 27.5g 0.5mol EDTA pH8.0 2ml 2EB 10mg/ml 3琼脂糖 4上样缓冲液 0.25% 溴酚蓝 0.25% 二甲苯青F

12、F 30%甘油 【操作方法】 1用胶带纸封住洗净、晾干的电泳胶盒两端放好梳齿水平放置于工作台上 20.5 TBE + 琼脂糖 1%电炉上融化勿暴沸待其冷却至5060 时加入EB约5l 充分混匀 3将凝胶倒入胶模厚约35mm避免产生气泡 4在室温中放置3045min撕去胶带纸放入电泳槽电泳槽内为0.5 TBE应没过凝胶去除梳齿预电泳10min 5将DNA样品与上样缓冲液混合加进上样孔内应设一marker作对照 660100V恒压电泳使DNA向阳极移动黑线为负极红线为正极 7电泳完成后戴塑料手套取出胶盒将凝胶放紫外灯下观察有无切出的电泳带。 大量培养转化的细菌 小量酶切鉴定证实细菌内含有目的基因即

13、可大量培养。 【操作方法】 在500ml灭菌处理过的培养瓶中加LB培养基200ml加入50mg/ml的氨苄贮存液200l 将小量培养的菌液取2ml加入瓶中37 200300r/min振摇培养610h可过夜。 大量提取质粒 常用碱裂解法。【试剂及配制】 1.溶液 2.溶液 3.溶液 4.异丙醇 5.3mol NaAc pH5.2 6.平衡酚 pH8.0 7.氯仿乙戊醇 241 8.无水乙醇 9.70%乙醇 10.TE pH8.0 11.RNase A (10mg/ml) 12.溶菌酶 取100mg 溶菌酶用2ml三蒸水溶解分装成200l /管贮存于-20 备用 【操作方法】 1扩增好的菌液装入5

14、0ml离心管中置冰浴10min 24离心5000 10 min 3将沉底的细菌收集到一只50ml离心管中再离心弃上清将离心管倒置滤纸上1 min控干残液 4加入6ml冰预冷的溶液 200l 溶菌酶充分振摇混匀 5加溶液10ml缓慢振摇以充分混匀内容物室温放置10min 6加入8ml冰预冷的溶液 小心摇动离心管以混匀内容物置冰酒精浴10min 74离心10000g 10min 8小心倒出上清弃沉淀如有沉淀再次离心 9加入0.6体积异丙醇充分混匀-20 放置20min 104离心10000g 10min 11弃上清晾干2ml TE pH8.0 溶解沉淀 12加入2ml冰预冷的5mol LiCl 溶

15、液并混匀 134离心10000g 10min 14将上清转移至另一离心管加入0.6体积异丙醇充分混匀-20 放置20min 154离心10000g 10min 16弃上清70%乙醇洗一次4离心10000g 10min弃上清晾干 17将沉淀溶于1.2ml TE pH8.0中 18加RNase A 30l 封管口37 水浴30min 19将样品分装2个EP管各加等体积平衡酚混合 20室温离心5000g 5min 21将上层水相转移至另一EP管小心勿吸出酚相22重复平衡酚抽提 23等体积氯仿异戊醇241抽提 24室温离心5000g 5min 25回收上层水相勿吸出氯仿 26加1/10体积3mol N

16、aAC (pH5.2)再加2.5体积无水乙醇充分混匀置-20 30min或液氮10min 27室温离心12000g 15min 28弃上清70%乙醇洗一次再离心 29晾干溶于500l TE pH8.0-20 保存 30取2 l 稀释至200l 用紫外分光光度计测260nm、280nm OD值OD260/OD280=1.72.0如小于1.7蛋白未提净大于2.0有机溶剂多。DNA含量为OD260 50 g /ml。 大量酶切质粒 【操作方法】 1在新的灭菌EP管中依次加入 三蒸水 70l 10 缓冲液 10l 限制酶 5l 质粒DNA2g /l 15l 稍离心以混匀 237 水浴1.52h 3取5

17、l 电泳鉴定酶解效果如不完全可延长时间或加限制酶 4双酶解反应如两种酶可用同一缓冲液则可同时加入一个体系稍增加反应体积否则以乙醇沉淀晾干重建第二个反应体系。 电泳分离、回收及纯化DNA片段 电泳的方法如前述不同点在于 使用低熔点琼脂糖在4 冰箱中电泳 将23个梳齿用透明胶布粘在一起以增加上样量。 从低熔点琼脂糖中回收及纯化DNA 【操作方法】 1在紫外灯下将含有所需DNA片段的凝胶条切下放入EP管中加入2倍体积的TE缓冲液在70 保温10min使凝胶条融化2冷却至室温加等体积平衡酚充分混匀后以6000g离心10min回收水相注意不要将界面处的白色物质即粉状的琼脂糖吸出再用等体积的氯仿/乙戊醇抽

18、提一次 3将上清液转移到一个新的离心管中加入0.2体积的10mol的乙酸胺和2倍体积的无水乙醇置-20 冰箱20min离心沉淀核酸晾干后以TE 溶解。取2l 稀释至200l 测DNA浓度。 标记探针 使用Boehringer Mannheim 地高辛标记探针试剂盒。 【操作方法】 11l 模板DNA加灭菌三蒸水至最终体积为16l 210min沸水浴立即冰乙醇冷轧 3加入4l 探针标记液试剂盒中vial 1稍微离心混匀 437 水浴20h 5加入2l 0.2mol EDTA pH8.0 或加热65 10min以终止反应。 石蜡切片的处理 【试剂及配制】 1二甲苯 2乙醇100%95%90%75%

19、 3甲醇 40.2mol HCl 50.1% Triton X-100 60.2%甘氨酸PBS 75mmol MgCl2-PBS 8PBS 配制配成10 的贮存液用时稀释10倍 NaCl 80g 137mmol KCl 2g 2.7mmol Na2HPO47H2O 11.5g 4.3mmol KH2PO4 2g 1.4mmol 配成1000mlpH7.3高压灭菌。 9蛋白酶K 0.1mol Tris-Cl pH8.0 加 50mmol EDTA pH8.0 配制浓度为1g/ml。104%多聚甲醛 在通风橱中配制称40g多聚甲醛溶于装有500ml DEPC 水的烧瓶中加热65 并磁力搅拌使成乳白

20、色悬液用1mol NaOH 调节 pH7.0呈清亮状再加入约450ml 的2 PBS充分混匀再检查pH过滤后定容至1000ml4 保存。 【操作方法】 1将烤好的切片入二甲苯 30min二甲苯 、 各10min 2逐级酒精入水100%、95%、90%、75%各5min甲醇冲洗5min 2 3用三蒸水或PBS快速洗2次 40.2mol HCl 室温作用10min 0.1% Triton X-100 作用15min 50.2%甘氨酸-PBS室温孵育15min 6蛋白酶K37 消化1530min 70.2%甘氨酸-PBS室温孵育15min 8PBS-5mmol MgCl2洗2次各10min 94%多

21、聚甲醛室温下固定15min 10PBS-5mmol MgCl2洗2次各10min 11逐级酒精脱水37烤干保存。 预杂交、杂交 【试剂及配制】 12 SSC 先配制20 SSC贮存液用时稀释。 NaCl 175g 3mol 枸椽酸三钠2H2O 88g 0.3mol 三蒸水加至1000ml用1mol HCl 调pH7.0 24 SSC/50%去离子甲酰胺V/V 去离子甲酰胺的配制500ml 甲酰胺与25g Bio-Rad AG 501-X8(2050目) 混合室温避光搅拌4h过滤分装为50ml -20 存放 3100 Denhardt液 聚蔗糖 10g 聚乙烯吡咯烷酮 10g 牛血清白蛋白 10

22、g 消毒三蒸水定容至100ml 4预杂交液 去离子甲酰胺 5ml 20 SSC 2.5ml 加温至50 加入硫酸葡聚糖 1g聚合物溶解后加入100 Denhardt 500l 10%SDS 500l 10mg/ml变性鲱鱼精子DNA 100l 消毒三蒸水 400l 充分混合 5杂交液 将标记好的探针用沸水浴10min立即冰酒精冷轧用预杂交液将探针稀释至0.55ng/l 。 【操作方法】 1用2 SSC 简洗15min 24 SSC/50%去离子甲酰胺37 孵育15min 3每片加预杂交液50l 放入湿盒42 孵育2h 4去除预杂交液每片加杂交液50l 放湿盒中42 杂交1218h不能超过24h

23、。 杂交后处理 【试剂及配制】 12 SSC 22 SSC/50%去离子甲酰胺 31 SSC/50%去离子甲酰胺 4PBS 54 SSC/10mmol DTT 先配制1mol DTT通风橱中称3.1g DTT溶于20ml消毒三蒸水中用时取2ml 加入198ml 4 SSC 【操作方法】 1杂交完毕后用2 SSC洗涤12min 22 SSC/50%去离子甲酰胺42 10min 31 SSC/50%去离子甲酰胺 37 30min 44 SSC/10mmol DTT 1h 50.1 SSC 40 2 30min 6PBS洗10min然后置于PBS中直到进行下一步。 抗体连接、显色【试剂及配制】 1缓

24、冲液 配1000ml,需加入 顺丁烯二酸 11.6g NaCl 8.8g 用10mol NaOH 将pH调至7.5高压消毒 2缓冲液 先制备阻断剂储存液取试剂盒中阻断剂按10%V/V加入溶液 混匀用微波炉加热使其完全溶解高压消毒后4 或-20 保存。用时取上述10%阻断剂储存液用缓冲液 按110稀释即制成缓冲液 3缓冲液 pH9.5 配制1000ml Tris-Cl 12.1g 100mmol NaOH 5.84g 100mmol MgCl2 10.2g 50mmol 4缓冲液 pH8.0 Tris-Cl (pH8.0) 10mmol EDTA (pH8.0) 1mmol 【操作方法】 12 SSC洗涤2 5min40 20.1 SSC2 30min40 3缓冲液 洗室温2min振摇 4缓冲液 洗室温30min振摇 5擦去组织周围缓冲液加抗地高辛抗体vial 415005000用缓冲液 稀释室温下于湿盒内2h 6缓冲液 室温洗2 15min 7缓冲液 室温洗3 min 8擦去组织周围缓冲液加显色液vial 5200l 用缓冲液 稀释至10ml 放湿盒中室温避光显色2h至过夜 9显微镜下检查阳性颗粒显深蓝色获满意结果后终止反应 10缓冲液 洗涤室温5min 11缓冲液 洗涤室温2min12用中性红或核固红复染细胞核数秒水冲洗晾干后甘油封片。