液体发酵技术样本.docx

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液体发酵技术样本

液体发酵技术

1.液体发酵技术简介

1.1液体发酵概念

　　液体发酵技术是当代生物技术之一，它是指在生化反映器中，模仿自然界将食药用菌在生育过程中所必须糖类、有机和无机具有氮素化合物、无机盐等某些微量元素以及其他营养物质溶解在水中作为培养基，灭菌后接入菌种，通入无菌空气并加以搅拌，提供食用菌菌体呼吸代谢所需要氧气，并控制适当外界条件，进行菌丝大量培养繁殖过程。

工业化大规模发酵培养即为发酵生产，亦称深层培养或沉没培养。

工业化发酵生产必须采用发酵罐，而实验室中发酵培养多采用三角瓶。

得到发酵液中具有菌体、被菌体分解及未分解营养成分、菌体产生代谢产物。

发酵液直接供作药用或供分离提取，也可以作液体菌种。

1.2液体发酵技术发展简史

　液体深层发酵技术这一概念是20世纪40年代由美国弗吉尼亚大学生物工程专家ElmerL，Gaden.Jr设计出培养微生物系统生物反映器，成为该项技术创始人。

据资料报道，液体深层发酵技术应用于食药用菌方面研究始于美国。

1948年，H.Humfeld用深层发酵来培养蘑菇（Agaricuscampestris）菌丝体，并一方面提出了用液体发酵来培养蕈菌菌丝体。

从此食药用菌发酵生产在世界范畴内兴起；1953年，美国S.Block博士用废苷汁深层培养了野蘑菇（Agaricusarvensis）；1958年J.Szuess第一种用发酵罐培养了羊肚菌（Morchellaesculenta）。

从此，食药用菌生产徐徐跨入了大规模工业化生产领域。

日本杉森恒武等于1975、1977年用1%有机酸和0.5%酵母膏构成液体培养基，获得了大量香菇菌丝体。

国内是在1958年开始研究蘑菇、侧耳等深层发酵。

1963年羊肚菌液体发酵开始工业化生产实验。

自此后来，大规模采用液态发酵生产食药用菌逐渐展开。

当时重要研究灵芝（Ganodermalucidum）、蜜环菌（Armillariellamellea）、银耳（Tremellafuciformis）等液体发酵应用于医药工业。

70年代开始研究香菇（Lentinulaedodes）、冬虫夏草（Cordycepssinensis）、黑木耳（Auriculariaauricula）、金针菇（Flammulinavelutipes）、猴头（Hericiumerinaceus）、草菇（Volvariellavolvacea）等液体发酵。

2液体发酵培养特点

2.1原料来源广泛，价格低廉

食药用菌液体培养所需碳源可用工业葡萄糖、工业淀粉及山芋粉等；氮源可采用黄豆饼粉、蚕蛹粉、麸皮粉等。

为了减少成本，普通还取用某些工业废水为代用品，如糖蜜废母液、木材水解液、各种大豆深加工废水、玉米深加工废水及淀粉废水等，原料来源相称广泛。

2.2菌丝体生长迅速

在液体培养中，液体培养基营养成分分布均匀，有助于菌类营养体充分接触和吸取。

菌丝细胞能在反映器内处在最适温度、pH、氧气和碳氮比条件下生长，能及时排放呼吸作用产生代谢废气，因而新陈代谢旺盛，菌丝生长分裂迅速，能在短时间内积累大量菌丝体和多糖、多肽等具备生理活性代谢产物。

2.3生产周期短

　　通过食药用菌液体发酵培养获得大量菌丝体和生理活性物质普通仅需要2-7天时间，且菌龄整洁，而固体培养需要30-60天。

2.4能有效减少菌种污染率

　　液体菌种接入固体培养料时，具备流动快，易分散、发菌点多、萌发快等特点，能有效地减少袋栽食用菌在接种过程中污染。

2.5工厂化生产、无季节性

　　生产中食用菌液体发酵是在发酵罐内、控制最佳条件来培养菌体，因而不受季节性限制。

而固体培养往往需要有很大培养空间，条件难以控制，且受季节影响较大

3食药用菌液体发酵培养基

　　在食药用菌液体培养中，影响发酵成败核心因素有两个：

第一是菌种，第二是培养基。

　　优良培养基应当具备如下特点：

①目物产生率高；②产生目物菌丝体生长良好，发酵周期短；③培养基成本低、原料来源广；④培养基对目物提取干扰少，目物后解决工艺简朴、得率高。

液体培养基构成

　　依照培养基中构成不同，可分为天然培养基和合成培养基。

天然培养基构成均为天然有机物。

合成培养基则是采用—些已知化学成分营养物质作培养基。

　　在生产上，还依照工艺将培养基分为孢子培养基、种子培养基及发酵培养基。

但无论如何划分，每一种培养基构成中都离不开碳、氮、无机盐、微量元素、维生素和生长素等。

（一）碳源

　　碳源含义为营养物化学成分中必须具有大量“C”元素，即具有“碳水化合物”。

碳源重要用于供应菌株生命活动所需要能量，构成菌体细胞及代谢产物，是食药用菌液体培养重要营养成分。

　　碳源涉及糖类（单糖、双糖、多糖）、脂肪和某些有机酸。

双糖及多糖一方面由菌体产生酶分解为单糖后再被运用。

食药用菌运用单糖、普通通过有氧分解、最后产物是二氧化碳、水和能量。

　　为减少培养基成本，药用真菌发酵惯用—些粗粮、杂粮或粮食加工之后下脚料作为原料，如玉米粉、蔗糖糖蜜、甜菜糖蜜等。

还可运用野生植物淀粉水解产物代替粮食作发酵原料。

　　不同菌种对碳源种类规定及运用亦不—样，但绝大多数药用真菌都能运用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和淀粉。

实际生产时，一方面要通过实验理解菌株所能运用几种碳源是什么，然后选出运用最佳、来源较广、成本较低原料作碳源。

　　必要指出，同一菌种在固体培养与液体培养时，所能运用碳源是不同。

例如香菇、金针菇、凤尾菇等在固体培养时可运用木质素、半纤维素及纤维素作为碳源，而在液体培养时就不适当用这些碳源。

（二）氮源

　　氮源指营养物化学成分中必须大量含“N”物质。

氮源重要用于构成菌体细胞物质和含氮代谢物，是食药用菌液体培养重要营养成分。

　　惯用氮源可分为有机氮源和无机氮源两大类。

黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、麦麸、酒糟、菌丝体等属于有机氮源；氨水、硫酸铵、尿素、硝酸铵、硝酸钠、磷酸氢二铵、氯化铵等为无机氮源。

有机氮源除具有丰富蛋白质、多肽和游离氨基酸之外，往往还具有少量糖、脂肪、微量元素及维生素、生长素等。

对绝大多数食药用菌，有机氮源比无机氮源更适合菌体生长。

某些菌则只能运用铵盐和硝酸盐。

普通，铵盐能较快被菌体运用，NH4+进入细胞中可直接掺入有机化合物中；而NO3-被细胞吸取后，先还原成NH4+，才用于合成有机化合物。

NH4+或NO3-被吸取后．会引起培养基酸化或碱化，因而在配制此类培养基时，应在培养基中加入少量缓冲物质。

　　不同菌种对氮源种类规定及运用限度亦不一致，因而在拟定培养基前应在实验中设法找到菌种所能运用几种较好氮源及最佳氮源，然后依照成本、原料来源与否容易等因素拟定氮源构成。

　　同—菌种在固体培养及液体培养时，可运用最佳氮源不同

三）碳、氮比（C/N）

　　碳、氮比指碳源及氮源在培养基中含量比。

构成菌丝细胞碳、氮比普通是：

8~12:

1。

由于菌丝生长过程中，普通需50%碳源作为能量供应菌丝呼吸，另50%碳源构成菌体细胞。

因而培养基中抱负碳、氮比理论值为16~24:

1。

　　多数食药用菌固体培养，在营养菌丝生长阶段，含氮量以0.016%~0.064%为宜，即C:

N＝20:

1；在子实体生长阶段以0.016%~0.032%为宜，即C:

N=30~40:

1为好。

因而，减少培养基中氮源是产生子实体前体。

但在液体培养中就不存在这个问题，以菌丝增殖为目培养，普通碳、氮比以20:

1为宜。

　　虽然药用真菌液体培养普通规定较高碳与氮比，即C:

N＝20:

1左右生长较好，但许多菌种也能在较宽碳、氮比范畴内生长。

不同菌种所规定适当碳、氮比，可通过实验求得。

（四）无机盐与微量元素

　　许多无机盐及微量元素对菌种生理过程影响与其浓度关于。

不同菌种，对无机盐及微量元素规定最适浓度也不同。

　　1．磷磷是细胞中核酸、核蛋白等重要物质构成某些，又是许多辅酶（或辅基）高能磷酸键构成某些。

磷是食药用菌液体发酵不可缺少物质，常加入磷酸二氢钾以提供磷，加入量大概为0.1%~0.15%。

　　2．镁镁在细胞中起着稳定核蛋白、细胞膜和核酸作用，并且是—些重要酶活化剂，是药用真菌液体培养中不可缺少营养成分。

普通通过加入硫酸镁以提供镁，浓度普通是0.05%~0.075%。

　　3．钾、钙、钠钾不参加细胞构造物质构成，但控制原生质胶态和细脑膜透性。

钙离子与细胞透性关于。

钠离子能维持细胞渗入压，钠离子可以某些代替钾离子作用。

三种物质需求量甚微，若采用天然培养基，可不必另加。

　　4．硫、铁硫是菌体细胞蛋白质构成某些（胱氨酸、半胱氨酸及蛋氨酸中皆含硫），铁是细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶构成某些，亦是菌体有氧代谢中不可缺少元素。

　　5．锌、锰、钴、铜锌、锰、钴等离子是某些酶辅基或激活剂。

铜是多元酚氧化酶活性基。

　　在配制培养基时应注意，镁和磷添加不适当过多，否则会带来危害。

菌体对锌、锰、钴、铜等微量元素需求量甚少，普通天然有机原料中均有，不必另加。

　　碳酸钙自身不溶于水，但可以调节培养其中酸碱度。

　　磷酸盐与碳酸钙不适当混合灭菌，否则会形成不溶于水磷酸盐，使可溶性磷酸盐浓度大大减少。

（五）维生素与生长素

　　维生素在细胞中作为辅酶成分，具备催化功能。

大多数药用真菌培养都与B族维生素关于，而与维生素A、K关系不大。

水溶性维生素对菌体影响比脂溶性维生素大。

维生素B1是当前已知对绝大多数药用真菌生长有利维生素。

其适当浓度在50~1000μg/L之间。

　　由于药用真菌对维生素需求量甚微，因而在使用天然有机原料为培养基时—般不需另加。

有时也可加入少量维生素B1。

　　生长素涉及三十烷醇、吲哚乙酸、赤霉素、α-萘乙酸、激动素等，在植物细胞组织培养中用较多。

在食用菌固体栽培中，当前还用某些菌丝生长增进剂及子实体增产增进剂等．但在食药用真菌液体培养中应用较少。

六）化合物

　　运用食药用菌具备生物转化特点，在培养基中加入某种化合物，通过生物合成后成为咱们所需要化合物。

　　在合成甾体激素（如可松）时，运用某些食药用真菌进行氧化，往往能在专一位置上导入所需要含氧基团，大大缩减了合成环节，并加快合成速度。

运用药用真菌生物氧化作用合成药物，是一辽阔应用领域。

这一应用前提是必要弄清药用真菌生物合成特性及生物转化能力。

　　具备生物合成能力药用真菌，当前已知多是些黑曲霉、黄曲霉、华根霉及酵母菌等，而非某些能产生子座及子实体子囊菌或担子菌。

这方面工作尚有待进一步研究。

　　在液体培养基中加入—些药性基质，通过药用真菌发酵后观测药性基质变化，这是一种新开拓讲究领域，其发展前景十分远大。

4食药用菌摇瓶培养

　　药用真菌液体培养在实验室中进行，普通通过摇瓶培养实现。

即将药用真菌试管母种接入灭过菌三角瓶培养液中，然后置于往复式或旋转式摇床上培养。

　　通过摇床培养菌丝体呈球状、絮状等各种形态。

培养液可呈黏稠状，清液状等状态，并可有清香味或其她异味。

因菌液中有菌株发酵产生次生代谢产物，可呈不同颜色。

在实验室中进行摇瓶培养可摸索菌株液体发酵适当生长条件及生理生化变化等。

工厂化生产时，先进行摇瓶培养作为接入种子罐菌种。

摇瓶培养菌丝体也可作为液体菌种接入固体培养料中。

摇瓶培养关于参数：

　　影响摇瓶培养发酵质量诸因素有：

培养温度、摇床振荡频率、瓶子装料系数，pH值、菌龄、接种量、培养液粘度、光照等。

（一）温度

　　药用真菌菌丝增殖及次级谢产物产生都在各种酶催化下进行，而酶催化反映需要适当温度，不同菌种有不同适当温度。

绝大多数药用真菌菌丝生长适当温度在22~30℃范畴内。

以产生次级代谢产物为目培养，其最适温度出也许与菌丝生长最适温度不同。

（二）摇床振荡频率和瓶子装料系数

　　食药用菌液体培养使用摇床有两种：

旋转式和往复式。

旋转式摇床偏心距可不同，转速可调或不可调；往复式摇床振幅可不同，其每分钟来回次数（震荡频率）多是固定。

　　摇床振荡频率和瓶子装料系数关系到摇瓶