实验室常规操作经验 关于过柱的实验方法和技巧 常说的过柱子应该.docx

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实验室常规操作经验关于过柱的实验方法和技巧常说的过柱子应该

实验室常规操作经验关于过柱的实验方法和技巧常说的过柱子应该

实验室常规操作经验关于过柱的实验方法和技巧常说的过柱子应该叫柱层析分离也叫柱色谱。

我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。

由于柱分的经验成分太多所以下面我就几年来过柱的体会写些心得希望能有所帮助。

注意有机溶剂对身体特有害别是心肺肝脏等所有过柱操作都要在通风橱里进行柱子可以分为加压常压减压。

压力可以增加淋洗剂的流动速度减少产品收集的时间但是会减低柱子的塔板数。

所以其他条件相同的时候常压柱是效率最高的但是时间也最长比如天然化合物的分离一个柱子几个月也是有的。

减压柱能够减少硅胶的使用量感觉能够节省一半甚至更多但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发有时在柱子外面有水汽凝结以及有些比较易分解的东西可能得不到而且还必须同时使用水泵抽气很大的噪音而且时间长。

以前曾经大量的过减压柱对它有比较深厚的感情但是自从尝试了加压后就几乎再也没动过减压的念头了。

加压柱是一种比较好的方法与常压柱类似只不过外加压力使淋洗剂走的快些。

压力的提供可以是压缩空气双连球或者小气泵给鱼缸供气的就行。

特别是在容易分解的样品的分离中适用。

压力不可过大不然

个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是溶剂走的太快就会减低分离效果。

比较适用的。

关于柱子的尺寸应该是粗长的最好。

柱子长了相应的塔板数就高。

柱子粗了上样后样品的原点就小反映在柱子上就是样品层比较薄这样相对的减小了分离的难度。

试想如果柱子十厘米而样品就有二厘米那么分离的难度可想而知恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。

而如果样品层只有0.5厘米那么各组分就比较容易得到完全分离了。

当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了有些不环保的说不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费。

现在见到的柱子径高比一般在1510书中写硅胶量是样品量的3040倍具体的选择要具体分析。

如果所需组分和杂质分的比较开是指在所需组分rf在0.20.4杂质相差0.1以上就可以少用硅胶用小柱子例如200毫克的样品用2cm×20cm的柱子如果相差不到0.1就要加大柱子我觉得可以增加柱子的直径比如用3cm的也可以减小淋洗剂的极性等等。

关于无水无氧柱适用于对氧水敏感易分解的产品。

可以湿柱也可以干柱。

不过在样品之前至少要用溶剂把柱子饱和一次因为溶剂和硅胶饱和时放出的热量有可能是产品分解毕竟要分离的是敏感的东东小心不为过。

也是因为分离的东西比较敏感所以接收瓶一定要用可密封的遵循schlenk操作。

至于是加压、常压、减压随需而定。

因为是schlenk操作所以点板是个问题如果样品是显色的恭喜了不用点板直接看柱子上的色带就行了。

如果样品无色只好准备几十个schlenk瓶一瓶一瓶的点不过几次之后就知道样品在哪也就可以省些了。

像我以前过一根无水无氧柱需要六个schlenk现在只一个就能把所要的全收集到。

无水无氧柱中用的比较多的是用氧化铝作固定相。

因为硅胶中有大量的羟基裸露在外很容易是样品分解特别是金属有机化合物和含磷化合物。

而氧化铝可以做成碱性、中性和酸性的选择余地比较大但是比硅胶要贵些。

听说有个方法就是用石英做柱子然后用HF254做固定相这样在柱子外面用紫外灯一照就知道产品在哪里了没有验证过。

哪位做过可以提出来大家参详参详关于湿法、干法上样。

湿法省事一般用淋洗剂溶解样品也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等但溶剂越少越好不然溶剂就成了淋洗剂了。

很多样品在上柱前是粘乎乎的一般没关系。

可是有的上样后在硅胶上又会析出这一般都是比较大量的样品才会出现是因为硅胶对样品的吸附饱和而样品本身又是比较好的固体才会发生这就应该先重结晶得到大部分的产品

后再柱分如果不能重结晶那就不管它了直接过就是了样品随着淋洗剂流动会溶解的。

有些样品溶解性差能溶解的溶剂又不能上柱比如DMFDMSO等会随着溶剂一起走显色是一个很长的脱尾这时就必须用干法上柱了。

样品和硅胶的量有一种说法是11我觉得是越少越好但是要保证在旋干后不能看到明显的固体颗粒那?

得饔?

的样品没有吸附在硅胶上。

溶剂的选择。

当然是最便宜最安全最环保的了。

所以大多选用石油醚乙酸乙酯。

文献中有写用正己烷的太贵了除非特别需要不要用不然银子哗哗的流的比淋洗剂还快不过因为极性很小有时还是非它不可。

乙醚也可以用但是就是容易睡觉注意保持清醒别让溶剂流干了那样柱子也就不爽了。

二氯甲烷也有用的但是要知道它和硅胶的吸附是一个放热过程所以夏天的时候经常会在柱子里产生气泡天气冷的时候会好一些。

甲醇据说能溶解部分的硅胶所以产品如果想过元素分析的话要留神应该经过后继处理比如说重结晶等。

其他的溶剂用的相对较少要依个人的不同需要选择了。

由于某些原因用到的淋洗剂多是大包装的便宜嘛我们这里是用10升或25升的塑料桶装的就要注意这些工业品的纯度是较低的。

经常能够从送来的大桶底部看见有色的杂质其他的杂质就可想而知了所以在比较严格的柱分时就要对溶剂重蒸。

当然过原料时就可以免去这一步了反正下面还有提纯的方法。

另外溶剂在过柱子后最好也回收使用一方面环保另一方面也能节省部分经费缺点是要消耗一定的人工。

这里要注意的是一般在过柱同时进行的是减压旋蒸石油醚和乙酸乙酯的比例由于挥发度的不同会导致极性的变化一般会使得极性变大在梯度淋洗时比较合适正好极性越来越大了。

在过完柱子后溶剂最后回收要采用常压因为在减压旋蒸时会有部分低沸点的杂质一起出来常压时就会减少这种现象如果杂质和你下面要过的样品有反应那就惨了。

关于操作问题。

1装柱。

柱子下面的活塞一定不要涂润滑剂会被淋洗剂带到产品中的可以采用四氟节门的。

干法和湿法装柱觉得没什么区别只要能把柱子装实就行。

装完的柱子应该要适度的紧密太密了淋洗剂走的太慢一定要均匀不然样品就会从一侧斜着下来。

书中写的都是不能见到气泡我觉得在大多数情况下有些小气泡没太大的影响一加压气泡就全下来了。

当然如果你装的柱子总是有气泡就说明需要多练习了。

但是柱子更忌讳的是开裂甭管竖的还是横的都会影响分离效果甚至作废2加样。

用少量的溶剂溶样品加样加完后将下面的活塞打开待溶剂层下降至石英砂面时再加少量的低极性溶剂然后再打开活塞如此两三次一般石英砂就基本是白色的了。

加入淋洗剂一开始不要加压等溶样品的溶剂和样品层有一段距离24cm就够了再加压这样避免了溶剂如二氯甲烷等夹带样品快速下行。

3淋洗剂的选择。

感觉上要使所需点在rf0.20.3左右的比较好。

不要认为在板上爬高了分的比较开过柱子就用那种极性如果rf在0.6即使相差0.2也不容易在柱子上分开因为柱子是一个多次爬板的状态可以通过公式的比较0.6/0.8一次的分离度肯定不如0.2/0.3的三次方或四次方大。

4样品的收集。

用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。

所以如果样品与硅胶的吸附比较强的话就不容易流出。

这样就会发生后面的点先出而前面的点后出。

这时可以采用氧化铝作固定相。

另外收集的试管大小要以样品量而定特别是小量样品如果用大试管可能一根就收到了三个样品如果都用小试管那工作量又太大。

5最后的处理。

柱分后的产品由于使用了大量的溶剂其中的杂质也会累积到产品中所以如果想送分析最好用少量的溶剂洗涤一下因为大部分的杂质是溶在溶剂里的一洗基本就没了必要时进行重结晶。

求助关于柱层析的几个问题各位GGJJ们你们好我是

新成员。

我现在在韩国学习。

本科的时候我学得是生物没想到过来之后转学了化学很多东西不会很郁闷。

我学的是天然产物的分离提取。

来了半年只上了三根柱子。

无意中进了咱们论坛学到了关于柱层析的很多知识。

先对GGJJ们表示感谢。

最近我又开始了新一轮样品的分离可是柱子重上了三遍效果都不好。

我做的是HexaneFraction的分离用的是hex-EA分离系统我用湿法装柱湿法上样。

第一天晚上装好了柱子上了样结果第二天一看柱子上半部分花了很郁闷只能用甲醇洗下样品重装。

我的样品是油状的猜测可能是油隔绝了柱子和外界接触晚上溶剂挥发因为不通气导致柱子变花第二次装柱前我先看了咱们论坛里所以关于柱层析的贴子觉得也可能是装得柱子不紧。

所以这次我用了个小的气泵加压装的感觉挺不错的。

结果上样后油状的样品导致洗脱剂与柱子隔绝打开下边的阀门后洗脱剂根本不流。

只好用小气泵将样品推进柱子?

?

?

?

样品进入柱子后随着洗脱剂流动柱子整个变花了。

这几天一直很沮丧。

今天鼓起勇气重新又做了一遍到目前为止没有出现任何问题。

不好意思说了一下我的情况耽误了大家很时间。

我总结了一下有几个问题想问大家。

问得有点白痴让大家笑话了。

我的问题是1、在选好洗脱的溶剂体系后是如何确定洗脱比例的是不是TLC先大体31低极性高极?

哉遄哐房纯创筇逵卸嗌侔叩闳缓笤俳徊接?

TLC测试选用斑点RF约0.3的比例也就是说每次走溶剂之前是要做过很多TLC测试的吗2、常压装柱子的时候可以加压吗会不会有什么不好的影响比如使柱子不均匀等3、跑柱子的时候我用紫外灯照发现色带不是

我还在跑着柱子呢先想起来这几很整齐是柱子装的不好还是大家做的时候也这样

个。

希望大家指导谢谢了1.根据柱层析洗脱的要求最好是先从低极性溶剂如石油醚或正己烷开始逐步加大洗脱剂极性进行梯度洗脱这样的效果比单一洗脱剂要好。

2.柱子在装填和过柱时加压很有必要有利于柱子装实。

3.跑柱时用紫外灯效果一般很差你需要将洗脱液分别点TLC确定。

另外根据你的柱子变花的情况我怀疑你的样品在洗脱剂中的溶解性比较差。

加压过柱时补加洗脱液前应该缓慢排除柱内气体如果排气过急很可能导致柱子变花增大极性时如果前后极性相差较大也可能导致柱子变花柱子温度升高导致建议柱子装好后先常压流一段时间这样色带会相对整齐一些柱子装好以后洗脱剂难以流下的话可以用毛细管将吸附了样品的硅胶层轻轻搅拌但不要破坏与柱子的层面然后再加一层石英砂或粗硅胶洗脱剂难以流下可能是上样时溶液的浓度太高或者油状物没有溶解完全直接吸附在硅胶上导致建议柱子装好以后不要放置过夜夏天温度高溶剂容易蒸发使柱子内出现大量气泡如果要过夜应保存在18摄氏度左右的温室里。

欢迎新成员加入楼主的问题在论坛很多帖子里都有讨论。

建议你以“柱层析”为关键词搜索本论坛。

1、洗脱剂的选择一般是以第一个点在TLC上Rf值0.20.3为基础稀释一倍进行第一个样品点的洗脱并在洗脱下第一个点后更换下一个点的洗脱极性0.20.3稀释一倍。

2、变花是由于柱子中气泡的存在放置过夜和过快更换洗脱极性都会产生气泡。

装柱子时一定要搅拌使得硅胶中的气体尽量拍干净。

二氯甲烷、乙醚等低沸点溶剂很容易“走花”所以最好用高沸点的同类溶剂代替。

更换极性时我一般从50:

1到20:

1是逐渐更换的就是先到40:

130:

1在到20:

1。

这样更换放热就不明显。

3、柱子在柱头堵了造成流速极慢应该用洗脱剂溶解样品后上样而不能单独将油上样。

如果洗脱剂不溶可以用低极性的二氯甲烷或者甲苯溶解。

如果还不行就得考虑用拌样方式上样。

关于为什么最好溶解上样而不是直接将油上样也有讨论。

4、色带走不齐很大程度是

由于装柱子不紧造成的也可能是上样是破坏了硅胶表层的平面性造成的。

5、柱层析是典型的实验科学走得多了自然明白。

【求助】过常压柱子时为什么过柱过程中柱子内会有气泡怎样避免遇到这种情况应该怎样处理朋友您怎么也不说是什么柱子若是硅胶柱还没有上样的话可以搅一搅让其自然沉降就可以若是已经上了样品就只好加压赶赶气泡试试。

若是大孔树脂柱或者是葡聚糖凝胶柱在换溶剂的时候由于树脂颗粒在水中和醇中的溶胀系数不同造成有气泡产生所以换比例的时候可以跨度小一点或者在柱子中气泡太多造成断层等影响进一步分离的时候搅一搅对分离效果不会有太大的影响。

一般过硅胶柱如何避免产生气泡1.装柱之前应搅拌均匀然后装柱2.装柱尽可能一次性的装完3.过柱的时候你是否干过柱这也会产生气泡4.还有你在装完柱后最好在硅胶上方加一片圆形滤纸加上后再加一块棉花这样加溶剂冲洗时可以避免冲起硅胶产生气泡如果气泡已经产生可以1.加压驱赶气泡2.我自己也发现了一个方法你试试就是先不要冲洗放置过夜第二天早上气泡就会到了上面不过有的时候不行。

3.如果还不行就用高极性的溶剂冲下样品收集重新

估算柱子硅胶用量2.估算溶剂与硅胶混合量3.将溶剂与硅装柱。

湿法装柱要点1.

胶于烧杯中搅拌均匀应搅至无气泡4.用漏斗装柱尽可能一次性加完.5.反复加溶剂平衡柱子至柱床不再下降为止。

6.加样有两种方法可溶于以上溶剂的样品可用适量溶剂溶解后将溶剂放平柱床后直接加样还可用适宜溶剂溶解样品用适量硅胶拌样硅胶量以能分散样品即可尽量少以减小初始色带加样时柱床上留少量溶剂加样后应轻敲柱子样品带的四周使气泡上移样品带上加棉花或盖少量硅胶防止加溶剂时冲动样品层加好样后连续冲柱时间尽量长些至少10小时以上可基本消除气泡的产生。

另外加液时应先用滴管沿柱壁慢加等有一定高度后改容器加液。

我认为可能是由于因为1可能是天气太热溶剂挥发产生气泡。

2极性变化很大造成硅胶和溶剂摩擦放热产生气泡。

3就是你的样品曾态粘稠使内外气压不等所以进去气泡了【求助】如何改变TLC展开剂以达到硅胶柱最佳分离最近在研究TLC条件以达到活性组分在硅胶柱上的较好分离。

直接将TLC条件用于硅胶柱分离不是很理想。

网上朋友建议我讲TLC展开剂的溶剂强度降低3050然后?

现?

我的问题是如何才能达到将溶剂强度降低是采用加入强度更低的溶剂来调整吗还是有其他办法请大家帮忙首先TLC的一个重要的作用就是为层析时选择合适的洗脱体系和合适的洗脱比例。

一般来讲如果要将TLC中合适的洗脱比例用于柱层析时一般应该适当减小洗脱强度所以所谓降低3050是有道理的。

如何降低了当然一般是调节洗脱液的比例在使用TLC时一般来讲是很少用一元体系来展开特别是对于成分较为复杂的化合物几乎是不可能。

通常来讲一个展开体系包括由两部分组成一部分基本展开体系包括极性大的试剂极性较小的试剂。

其中极性较小的部分一般起到分离的作用极性较大的试剂一般起到帮助化合物在薄层上移动对分离物质的洗脱能力较强可以提高比移植但不能提高分辨率。

二部分展开剂中加入酸或碱主要是抑止某些酸或碱性物质而产生斑点的拖尾。

至于如何产生的拖尾如有兴趣下次可以在将。

讲到这里我想你应该明白就是调节基本展开体系的溶剂的比例即可换言之增大小的比例或减小大的比例这都是相对的。

真的不说了有些困了混合溶剂的溶剂强度与组成溶剂所占的体积比相关可通过介电常数或其它常数来计算。

柱层析时还是以配制后用TLC验证Rf值为好分离斑点之间Rf值相差较大时将Rf值调节在0.2左右梯度洗脱斑点相距较近或呈念珠状相连时将主要斑点Rf值调至0.15至

0.2之间为好。

Rf值太小柱上洗脱时间较长谱带扩散较严重Rf值太大洗脱平衡不充分也难于分开。

感觉斑点的洗脱体积与其Rf值有近似倒数的关系Rf为0.1时需10个保留体积来洗脱Rf为0.3时需3个保留体积洗脱一般斑点在7或8个保留体积洗脱时效果最好。

萃取相关问题求助:

萃取时严重乳化求解决方法我正在做一个产品产物需用稀盐酸溶液提取有机溶剂中的产物产物与HCL成盐后溶解在水相中但在此过程中有时会产生严重的乳化现象极难分液共提取三次不定在哪次产生乳化求助如何避免乳化乳化后如何处理谢谢。

常用方法1长时间静置2加入少量电解质如氯化钠破乳或增大水相比重使两相分离3若因溶液呈碱性可加入少量酸反之加碱4过滤5加入乙醇或磺化蓖麻油等破乳剂【求助】用乙醚萃取发生较严重的乳化现象怎么处理把乳化的萃取液超声但只能消除一小部分请问还有什么更好的办法能大量消除乳化吗可以将乳化层先单独分出而后继续加入乙醚继续萃取乳化现象即可明显改善分出的乳化层可以通过静置过夜或离心或抽滤必要时可通过硅藻土滤过以破坏乳化层有时加入Nacl或少量乙醇也可破坏乳化层。

我用过

很少发生乳化只是有一两个出现过这种状况但是离心后就乙醚萃取用的比例为15

完全破乳了大过2000r就可以破乳了但是不知道萃取效果是否会有影响。

我觉得可能是你乙醚的比例太小建议提高比例最好大于13你可以尝试一下下面的办法应该有用的。

1.长时间静置一般可一分离但浪费时间。

2.水平旋转摇动分液漏斗可将分渡漏斗在水平方向上缓慢地旋转摇动这样可以消除界面处的乳化层。

3.用滤纸过滤用质地密致的滤纸减压过滤。

过滤后会比较容易分层和分离。

4.加热将乳化部分取出小心地温热至50?

有利于分层。

5.补加水或溶剂再水平摇动向乳化混合物中缓慢地补加水或溶剂再进行水平旋转摇动则容易分成两相。

至于补加水还是补加溶剂更有效可将乳化混合物取出少量在试管中预先进行预试。

6.加乙醇在乳化液中可加入510滴乙醇再缓缓摇动则可促使乳化液分层。

但是萃取剂中混入乙醇由于分配系数减小有时会带来不利的影响。

7.离心分离将乳化混合物移入离心分离机中进行高速离心分离。

8.加无机盐及减压加入食盐、氯化钙等无机盐使之溶于水中可促进分层。

【求助】我的粗提物不溶于水但是要进行液液萃取该怎么办现在我用甲醇从海绵中提取活性物质甲醇萃取蒸干后共30g左右下面要用环己烷乙酸乙酯正丁醇依次进行萃取粗分一下但是现在粗提物不溶于水我只能把它均匀分散在水里350mL放置会沉淀然后直接用环己烷萃取了结果混匀后基本不分层油水混在一起拉请问我该怎么办啊如果事先过滤那要的物质就没有啦各位高手帮忙啊先谢谢了你那是乳化了多加一些环已烷如何先用楼上的方法静置长一些时间并适当采用热敷方式加热促进分层。

另外注意以后萃取时振摇不要太剧烈特别是第一次。

如果提取物每次萃取时乳化都比较严重恐怕最后萃取的效果不会理想以后分离时同一成分在各个萃取部分都出现比较麻烦。

不如采取另外的方式比如将样品用甲醇溶解后拌入2倍量的硅胶中干后装入层析柱中分别用石油醚或己烷、环己烷等、氯仿、乙酸乙酯、甲醇或一定比例的氯仿甲醇依次洗脱成分按极性大小被分成几个部分感觉效果比液液萃取要好没有交叉。

特别是提取物量不是很多时比较适合。

也有文献用硅藻土拌样但感觉不如硅胶好因为硅藻土只起到分散剂的作用。

这种方法应该叫液固萃取效果可能比液液萃取要好。

xuaner80朋友我给你提个建议以后要是萃取的话就不要蒸干这样成分的溶解性就发生变化了你要得到收率的话可以这样做假如你的提取液浓缩后得到30ml的浓缩液取1ml蒸干蒸干物重按比例计算

出总提取物的重量就可以了。

你可以往甲醇浓缩液中加入少量的水调成80甲醇水浓度加入环己烷萃取后母液水浴蒸干加入10gNaCl加水加热溶解放置待其冷却至室温加乙酸乙酯和正丁醇萃取若是有不溶物不用管只要分层即可。

或者按照楼上其他几位说的那样粗提物加硅藻土分散后直接用三种溶剂索氏提取最后一种选择就是甲醇拌样后直接硅胶柱层析或者选择其他柱层析方法。

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