cona结合型和pna结合型肝癌血清糖蛋白表达谱的建立及其作为肿瘤标志物的研究应用好.docx

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cona结合型和pna结合型肝癌血清糖蛋白表达谱的建立及其作为肿瘤标志物的研究应用好

正常人血清和肝癌血清ConA结合型及PNA结合型糖蛋白表达谱建立及其作为肿瘤标志物研究

TheestablishmentofConAandPNAbindingglycoproteinsexpressionprofilefromhealthypeopleandprimaryhepaticcarcinomaserumandthestudyofit’spotentialapplicationintumormarkersscreening

摘要：

肝癌是严重影响人类生命健康一类疾病，其死亡率居恶性肿瘤之首。

惯用肝癌检测标志物AFP，对晚期肝癌诊断较为敏感，但有30%阴性率。

因而，提高肝癌初期诊断率是提高肝癌患者存活率核心。

糖蛋白异常表达与肿瘤发生和转移密切有关。

人血清中糖蛋白含量和种类诸多，其糖链构造变化，最常用是高甘露糖型糖链增多和岩藻糖基含量增长往往是预示肿瘤重要信息。

凝集素是分离糖蛋白特有手段，ConA、PNA分别可用于高甘露糖型和岩藻糖型糖蛋白富集。

本研究即采用ConA、PNA从正常人血清和肝癌血清中富集高甘露糖型及岩藻糖型糖蛋白，2-DE结合MS对富集糖蛋白进行鉴定，选用有代表性糖蛋白，构建起高重复性正常人血清和肝癌血清ConA结合型及PNA结合型糖蛋白表达谱，最后建立起一套高通量、高复性、高敏捷度血清糖蛋白多肿瘤标志物联合诊断办法，该研究在提高肝癌初期诊断率方面具备重大价值。

核心词：

肝癌，糖蛋白，血清，肿瘤标志物，MS，2-DE

一：

立项根据与研究内容

1.项目立项根据

研究意义：

肝癌是世界范畴内常用恶性肿瘤之一，其死亡率居恶性肿瘤之首。

当前，临床上肝癌诊断多以检测肿瘤标志物（TumorMarker，TM）结合影像学诊断为重要根据，只有在瘤体生长到一定体积才干诊断，而对于初期较小瘤体诊断则有一定困难。

惯用肝癌检测标志物甲胎蛋白（AFP），普通对晚期肝癌诊断较为敏感，但也有约30%阴性率，不适合伙为普查或初期诊断。

临床上被确诊患者多数己属于中晚期，患者存活率很低。

故TM在肝癌患者初期发现、初期诊断中显得尤为重要[1]。

糖蛋白中糖链在细胞辨认、信号传导、细胞分化等众多生命活动中有着重要生物学功能。

糖蛋白中糖链异常表达，与肿瘤发生和转移密切有关。

糖链构造与肿瘤研究已引起相称注重，特别是运用血清或尿液中某些糖蛋白糖链异常表达来诊断恶性肿瘤，为癌症诊断开辟了一种“糖链标志”新领域[2，4]。

研究表白，肿瘤患者血清中糖蛋白大都是N-糖链，且发生了高甘露糖型糖链增多和岩藻糖基含量增长变化[9，12]。

如能结合蛋白质组学中高通量分析检测技术，将有更多TM被人们发现，为肝癌初期诊治提供更多思路和信息[8，11]。

人血清中糖蛋白含量和种类比较多，其糖链构造微小变化往往是预示某种疾病特别是肿瘤重要信息[4]。

因而，如何从成分复杂血清中富集及纯化异常表达糖蛋白是进行肝癌糖蛋白表达谱分析基本和前提。

凝集素是分离糖蛋白特有手段，已广泛用于分离和制备糖蛋白，并且可直接用于目产物糖蛋白分型[5，7]。

因而，咱们分别选用对高甘露糖型糖蛋白有特异性吸附作用凝集素伴刀豆球蛋白（ConA）、对岩藻糖型糖蛋白有特异性吸附作用花生凝集素（PNA）从成分复杂血清中富集和纯化高甘露糖型糖蛋白及岩藻糖型糖蛋白。

2-DE结合MALDI-TOF-MS分析对富集到糖蛋白进行鉴定，通过比较正常人血清和肝癌血清ConA结合型糖蛋白和PNA结合型糖蛋白表达差别，最后建立正常人血清和肝癌血清ConA结合型糖蛋白和PNA结合型糖蛋白表达谱，提高肝癌初期诊断率，同步为肝癌发病机制和治疗靶点研究提供理论根据和信息。

由于当前尚未有一套完整可靠糖蛋白研究技术体系，因而本研究还旨在建立起一套重复性好、高通量、高敏捷度蛋白质糖基化研究新办法，搭建起一套可靠从分离纯化到构造解析糖基化蛋白研究技术体系。

国内外研究现状及分析：

（1）国内肝癌发病率高，但初期检测率低

在国内每年有11万人发生肝癌，占世界总发病率42.5%，患者存活率很低，近年来，发病率呈逐年上升趋势。

乙型肝炎病毒引起肝炎进而慢性迁延导致肝纤维化、肝硬化，最后演变成肝癌，也是肝癌形成重要因素之一。

据关于报道，当前国内约有1.3亿乙肝病毒携带者，这个事实提示了肝癌高发病率潜在危险性[1]。

当前，临床上肝癌诊断多以检测肿瘤标志物（TumorMarker，TM）结合影像学诊断为重要根据，只有在瘤体生长到一定体积才干诊断，而对于初期较小瘤体诊断则有一定困难。

惯用肝癌检测生物标志物重要为AFP，普通对晚期肝癌诊断较为敏感，且有30%阴性率，因而不适合伙为普查或初期诊断[15]。

临床上被确诊患者多数己属于中晚期，患者存活率很低。

故TM在肝癌患者初期发现、初期诊断中显得尤为重要。

由于肿瘤基因复杂性，没有一种肿瘤是单一类型，故发现“高特异性、高敏感性、器官特异性”抱负TM十分困难。

因而，肝癌筛查要选取恰当办法，提高其可操作性及人群依从性，各种TM联合检测可提高敏感性和精确性，如能结合蛋白质组学中高通量分析检测技术，将有更多TM被人们发现，为肝癌初期诊治提供更多思路和信息。

（2）糖蛋白异常表达与肿瘤发生和转移密切有关

糖基化是蛋白质翻译后修饰重要修饰形式之一，约有一半以上蛋白质发生了糖基化修饰。

糖蛋白中糖链在细胞辨认、信号传导、细胞分化等众多生命活动中有着重要生物学功能。

众多研究成果表白[2，4，8]，糖蛋白中糖链异常表达，与肿瘤发生和转移密切有关，因此，当前临床应用TM中绝大某些是糖蛋白，如AFP蛋白异质体（N-糖链）、FLP、CEA、糖蛋白抗原CA50、CA125等。

糖链构造与肿瘤研究已引起相称注重，特别是运用血清或尿液中某些糖蛋白糖链异常表达来诊断恶性肿瘤，为癌症诊断开辟了一种“糖链标志”新领域。

因而，建立正常人血清和肝癌血清糖蛋白表达谱对国内这样一种肝炎、肝硬化、肝癌高发病率国家具备重大意义。

（3）凝集素用于血清糖蛋白富集和纯化

凝集素是一类能与糖专一地、非共价地可逆结合免疫球蛋白，类似于抗原抗体反映，不同凝集素与不同糖蛋白有不同糖链结合域，并且可用于糖蛋白分型。

将选取凝集素制成亲和层析柱，将血清、糖蛋白或糖肽样品通过此柱，能被该凝集素辨认糖蛋白或糖肽就结合于柱上，不被结合糖蛋白或糖肽组分就随洗脱缓冲液流出。

然后用该凝集素特异结合单糖或寡糖洗脱被结合组分。

人血清中糖蛋白含量和种类比较多，其糖链构造微小变化往往是预示某种疾病特别是肿瘤重要信息。

研究表白，肿瘤患者血清中糖蛋白大都是N-糖链，且都发生了高甘露糖型糖链增多和岩藻糖基含量增长变化[12，15]。

凝集素是分离糖蛋白特有手段，已广泛用于分离和制备糖蛋白，并且可直接用于目产物糖蛋白分型[5，7]。

伴刀豆球蛋白（ConA）可用于高甘露糖型糖蛋白分离和富集，花生凝集素（PNA）可用于岩藻糖型糖蛋白分离和富集，增长了样品纯化特异性。

制备凝集素亲和层析柱也可多次使用，该办法经济实惠。

与后续凝胶电泳有较好兼容性，不需除去高丰度蛋白预解决过程，减少了样品损失。

（4）肝脏糖蛋白质组学在肿瘤标志物筛查中作用

随着人类肝脏蛋白质组筹划启动，肝脏糖蛋白质组学逐渐成为国内外研究焦点。

然而，由于既有技术还很难进行糖链构造测定和化学合成，故蛋白质糖链构造和功能研究受到极大限制。

迄今为止，国内外尚未浮现系统可靠研究组织或细胞内蛋白质糖基化修饰办法。

2-DE与MS作为肝脏糖蛋白质组学主流技术，两者结合已经成为糖蛋白构造解析强大工具[3，6]。

2-DE第从来为等电聚焦电泳等电点信息，第二向为SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳。

2-DE电泳后，用专门图像扫描分析软件进行图像分析，对需研究糖蛋白质点酶解后经MS鉴定，应用比较生物信息学进行糖蛋白构造和功能进一步鉴定和分析[6]。

MALDI-TOF-MS办法在糖链构造分析中得到了广泛应用，其长处是敏捷度高，其独特软电离方式可以获得糖链完整构造信息，结合源后裂解（PSD）可以分析得到糖链构成信息和肽指纹图谱（PMF），因而，该技术在拟定糖链及其糖肽分子量、糖链及肽链顺序及连接位点等构造信息方面具备独特之处[10，11，14]。

2-DE分离中以荧光显色为基本糖蛋白染色技术检测敏捷度可达到ng级甚至pg级，并且与下游鉴定技术如MALDI-TOF-MS技术有较好兼容性，因而在糖蛋白分离与分析方面有很大优势[13，14]。

运用蛋白质组学主流技术2-DE与MS技术结合用于正常人血清和肝癌血清糖蛋白构成分差别分析，该研究有助于理解肝癌血清中糖蛋白表达变化状况，寻找肝癌新特性糖蛋白，旨在为肝癌初期血清学诊断及治疗药物靶点筛选提供实验室参照根据，同步也尝试建立相对稳定、原则化高通量糖蛋白质组学共性技术，推动后续肝脏疾病比较糖蛋白质组学研究。

综上所述，本课题组拟采用能与高甘露糖型N-糖基化蛋白紧密结合ConA和对岩藻糖型N-糖基化蛋白有特异性吸附作用PNA富集正常人血清和肝癌血清中高甘露糖型和高岩藻糖型糖蛋白，运用2-DE凝胶电泳对亲和产物进行分离，荧光染色，选用有特性性糖蛋白，酶解后进行MALDI-TOF-MS和生物信息学分析。

通过比较正常人血清和肝癌血清糖蛋白表达谱差别，从中选用品有代表性糖蛋白，构建起高重复性正常人血清和肝癌血清ConA结合型糖蛋白和PNA结合型糖蛋白表达谱，搭建起研究糖基化蛋白共性技术平台，最后建立起一套高通量、高重复性、高敏捷度血清糖蛋白多肿瘤标志物联合诊断新办法，旨在为肝癌初期诊断和发病机制研究提供根据和信息，该研究在提高肝癌初期诊断率方面具备重大价值。

因而本研究还旨在建立起一套重复性好、高通量、高敏捷度蛋白质糖基化研究新办法，搭建起一套可靠从分离纯化到构造解析糖基化蛋白研究技术体系。

参照文献：

1.HashemB.El-Serag*，JorgeA.Marrero，LenhardRudolph，KRajenderReddy.DiagnosisandTreatmentofHepatocellularCarcinoma.GASTROENTEROLOGY，，134：

1752-1763.

2.WilliamS.Dalton1*andStephenH.Friend*.CancerBiomarkers-AnInvitationtotheTableScience，，312（26）：

1165-1167.

3.AnneDell*，HowardR.Morris.GlycoproteinStructureDeterminationbyMassSpectrometry，Science，，291（23）：

2351-2355.

4.MortenThaysen-Andersen，IdaB.Thøgersen，UlrikLademann，HanneOffenberg，AndersM.B.Giessing，JanJ.Enghild，HansJørgenNielsen，NilsBrünner，PeterHøjrup.Investigatingthebiomarkerpotentialofglycoproteinsusingcomparativeglycoprofiling-applicationtotissueinhibitorofmetalloproteinases-1.BiochimicaetBiophysicaActa，，1784：

455-463.

5.Hiroyukikaji，harunasaito，yoshioyamauchi，etal.Lectinaffinitycapture，isotope-codedtaggingandmassspectrometrytoidentifyN-linkedglycoproteins.Naturebiotechnology，，21（6）：

667-669.

6.LucíaQuintana，AlbertoMonasterio，KepaEscuredo，JokindelAmo，PilarAlfonso，FelixElortza，SimonSantaCruz，LaureanoSimón，AntonioMartínez，PilarGiraldo，MiguelPocoví，JoséLuisCastrillo.IdentificationofchitotriosidaseisoformsinplasmaofGaucherdiseasepatientsbytwodimensionalgelelectrophoresis.BiochimicaetBiophysicaActa，，1764：

1292-1298.

7.AlexMonzo，Gu¨ntherK.Bonn，Andra´sGuttman.Lectin-immobilizationstrategiesforaffinitypurificationandseparationofglycoconjugates.TrendsinAnalyticalChemistry，，26（5）：

423-430.

8.Vale´rieParadis.Glycomics：

Anewtasteofcirrhosismarker.JournalofHepatology，，43：

913-916.

9.TímeaImrea，TiborKremmerb，KárolyHébergerb，ÉvaMolnár-Szöllősic，KrisztinaLudányia，GabriellaPócsfalvid，AntonioMalornid，LászlóDrahosa，KárolyVékeya.MassspectrometricandlineardiscriminantanalysisofN-glycansofhumanserumalpha-1-acidglycoproteinincancerpatientsandhealthyindividuals.JOURNALOFPROTEOMICS，，71：

186-197.

10.MarjoleinL.MRobijn，JoostPlanken，DieuwkeKornelis，CornelisH.Hokke，AndréM.Deelder.MassspectrometricdetectionofurinaryoligosaccharidesasmarkersofSchistosomamansoniinfection.TransactionsoftheRoyalSocietyofTropicalMedicineandHygiene，，102：

79-83.

11.JoseL.Luque-Garcia，ThomasA.Neubert.Samplepreparationforserum/plasmaprofilingandbiomarkeridentificationbymassspectrometry.JournalofChromatographyA，，1153：

259-276.

12.KazuhiroTanabe*，AkihiroDeguchi，MikitoHigashi，HisashiUsuki，YasuyukiSuzuki，YouichiUchimura，ShigekiKuriyama，KazuhiroIkenaka.OuterarmfucosylationofN-glycansincreasesinseraofhepatocellularcarcinomapatients.BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications，，374：

219-225.

13.ZhangYing，HuangLinjuan，WangZhongfu.TechniquesforStainingGlycoproteinonGelElectrophoresisorElectroblotting.PROGRESSINCHEMISTRY，，20：

1158-1163

14.ZHANG，Ying，HUANG，Lin-Juan，WANG，Zhong-Fu*.ASensitiveDerivatizationMethodfortheDeterminationoftheSugarCompositionafterPre-columnReductiveAminationwith3-Amino-9-ethylcarbazole（AEC）byHigh-performanceLiquidChromatography.ChineseJournalofChemistry，，25：

1-10.

15.TamuraA，OitaT，SakizonoK，etal.Clinicalusefulnessoflectinreactivefractionofalpha-fetoproteininhepatocellularcarcinoma.RinshoByori，1998，46：

158

2.项目研究目的、研究内容、以及拟解决核心科学问题

2.1研究目的

本课题组拟采用ConA和PNA富集正常人血清和肝癌患者血清糖蛋白，运用蛋白质组学主流技术2-DE结合MS技术筛选和鉴定肝癌患者中异常表达糖蛋白，以期发现新特异性好、敏捷度高血清肿瘤标志物。

通过比较正常人血清和肝癌血清糖蛋白表达差别，选用有代表性糖蛋白点，建立正常人血清和肝癌血清ConA结合型糖蛋白和PNA结合型糖蛋白表达谱，建立起一套高通量、高复性、高敏捷性血清糖蛋白多肿瘤标志物诊断新办法，为肝癌初期诊断提供根据和信息，最后提高肝癌初期诊断率，同步为肝癌发生、发展及信号转导新机制研究提供理论根据，丰富该方面理论并为进一步发掘更为有效肝癌治疗新靶点奠定理论及实验基本。

2.2研究内容

2.2.1原则糖蛋白分离办法建立

运用ConA特异吸附高甘露糖型糖蛋白原理，选用富含N-糖链高甘露糖型糖蛋白鸡蛋清白蛋白（Albumin）为原则糖蛋白对其进行分离纯化，并对分离条件进行优化。

PNA采用相似办法进行研究。

2.2.2原则糖蛋白MALDI-TOF-MS鉴定办法建立与完善

MALDI-TOF-MS具备极高敏捷度及精确度，由于其独有软电离方式，可用于数十万Da分子量生物大分子检测和分析，当前已被成功地用于糖蛋白构造分析，与普通化学办法相比，MS法迅速、简朴，结合网上数据库检索、凝集素亲和提取、2-DE以及靶上直接酶切等新办法，可以提供糖蛋白一级构造乃至高档构造信息。

本课题组以原则糖蛋白为分析目的已建立了原则糖蛋白MS鉴定办法，为后续样品分析奠定了技术基本和基本保证。

2.2.3原则糖蛋白2-DE结合MALDI-TOF-MS分析办法建立与完善

近年来发展起来二维凝胶电泳（two-dimentionalgelelectrophoresis，2-DE）是一种大规模蛋白质分离技术，能将数千种蛋白质同步分离与展示。

在分析蛋白质翻译后修饰方面，可与MALDI-TOF-MS技术相配合，有辽阔应用前景。

由于生物体内糖蛋白含量很低，发展高敏捷度特异性糖蛋白胶上染色技术至关重要。

本课题组拟选用以荧光显色为基本染色试剂Pro-QEmerald300对糖蛋白进行染色，整个过程涉及3个环节：

固定，氧化和染色，该反映基于PAS反映，条件温和，室温即可。

同步还采用SYPRORuby染料对总蛋白染色，SYPRORuby染料最大激发波长在610nm（红色荧光），所有蛋白质被染成红色，而糖蛋白与Pro-QEmerald300共轭化合物最大激发波长在530nm（呈绿色），检测敏捷度可达到300pg/条带糖蛋白，运用计算机采集技术即可得到各种关于蛋白质糖基化位点和表达限度图谱，可在荧光灯下将非糖蛋白和糖蛋白区别切下，进行后续MS鉴定。

本课题组当前正在使用荧光标记物进行同类办法及产品研制开发，以期发展一套高敏捷度和简便具备自主知识产权办法。

2.2.4正常人血清和肝癌患者血清糖蛋白表达谱建立和完善

收集正常人血清和肝癌血清两组，一组运用凝集素ConA分离纯化，一组运用凝集素PNA分离纯化，进行2-DE分离，运用基于PAS反映荧光染料Pro-QEmerald300对糖蛋白染色结合SYPRORuby染料对总蛋白染色，染色完毕后，图像分析正常人血清和肝癌血清2-DE图谱寻找糖蛋白表达明显差别点，MALDI-TOF-MS技术对糖蛋白进行鉴定。

通过2-DE结合MALDI-TOF-MS分析可以发现肝癌血清和正常人血清中糖蛋白表达谱质和量变化，选用高重复性、有代表性差别点，建立高重复性正常人及肝癌血清ConA结合型糖蛋白和PNA结合型糖蛋白表达谱。

2.3拟解决核心学科问题

1.本研究完毕后，有望建立高重复性人正常人和肝癌血清ConA结合型糖蛋白和PNA结合型糖蛋白表达谱，提高肝癌初期诊断率。

2.当前尚未有高通量糖蛋白构造分析和合成技术体系，通过对血清糖蛋白分离纯化和鉴定，有望建立一套高通量、高复性、高敏捷性血清糖蛋白分离和鉴定技术，搭建起研究糖基化蛋白共性技术平台。

3.通过比较肝癌血清和正常人血清中糖蛋白表达质和量变化，有望揭示肝癌发生、发展及信号转导新机制，丰富该方面理论并为进一步发掘更为有效肝癌治疗新靶点奠定理论及实验基本。

3.拟采用研究方案及可行性分析

技术路线图：

3.1研究方案：

3.1.1原则糖蛋白分离办法建立

运用ConA特异吸附高甘露糖型糖蛋白原理，选用富含N-糖链高甘露糖型原则糖蛋白Albumin为待分析样本对其进行分离纯化，并对分离条件进行优化。

ConA色谱柱纯化办法操作如下：

a.用Washingbuffer冲洗ConA色谱柱至没有杂质和可溶性糖类物质；

b.1mg样品缓慢注入色谱柱后，使样品与色谱柱充分吸附；

c.Washingbuffer冲洗ConA色谱柱，洗出不保存组分；

d.加入具有甘露糖或甲基-甘露糖苷Elutionbuffer，洗出高甘露糖型糖蛋白，收集；

f.脱盐，干燥，样品溶于100μl水中。

PNA分离纯化糖蛋白路线与ConA基本相似。

3.1.2原则糖蛋白MALDI-TOF-MS鉴定办法建立

MALDI-TOF-MS具备极高敏捷度及精确度，可用于数十万Da分子量生物大分子检测和分析，当前已被成功地用于糖蛋白构造分析。

MALDI-TOF-MS实验在岛津公司AXIMA-PLUS上进行，正离子检测方式。

激光波长为337nm，能量设立为80Kev，用原则混合肽作质量校正。

以2,5-二羟基苯甲酸水溶液（DHB，10mg/ml）为基质，基质与样品比例为1：

1。

本课题组以原则糖蛋白已建立了原则糖蛋白Albumin糖链MS鉴定办法，为后续样品分析坚定了坚实技术基本和基本保证。

3.1.3原则糖蛋白2-DE结合MALDI-TOF-MS分析办法建立

以原则糖蛋白Albumin为分析样品进行办法学摸索，建立糖蛋白2-DE结合MALDI-TOF-MS分析原则办法。

血清糖蛋白采用相似办法进行研究，详细操作如下：

（1）样品制备：

原则糖蛋白A