腌制食品中降解亚硝酸盐的乳酸菌分离与鉴定蒋欣茵.docx
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腌制食品中降解亚硝酸盐的乳酸菌分离与鉴定蒋欣茵
中国酿造
2008年第1期总第178期腌制食品（包括泡菜、腐乳、腌肉等是经微生物发酵与各种环境因素共同作用而成,具有独特的醇香风味。
乳酸菌是腌制食品自然发酵中的常见菌种之一[1],乳酸发酵通常被认为是安全的,其代谢产物赋予食品芳香的风味和良好的口感,并且可以降低发酵液的pH值,从而抑制有害菌的生长,乳酸菌的发酵还可以显著降低腌肉制品亚硝酸盐的含量。
因此,利用人工接种发酵菌种,控制腌制食品质量并且抑制有害微生物的生长,提高腌制食品的安全,有广泛的应用前景[2]。
亚硝酸盐是N-亚硝基化合物的前体物。
现已确定N-亚硝基化合物对动物有较强的致癌作用。
亚硝酸盐可以经过化学或生物学的途径合成多种多样的N-亚硝基化合物,而亚硝胺的形成浓度和亚硝酸盐的平方成正比。
盐腌食品在腌制过程中,一部分是由于粗制食盐中有硝酸盐,可被细菌降解为亚硝酸盐,另外可能在腌制过程中,食品发生了化学作用产生了亚硝酸盐。
从特定食品中分离的乳酸菌是对该食品进行乳酸发
酵的最佳出发菌株,因为它们具有更强的竞争力。
OHCK等[3]从泡菜中分离出可高效降解亚硝酸盐的乳酸菌,梁恒宇等[4]从自然发酵黄豆酱中分离得到耐盐的乳酸菌株。
本研究从泡菜、榨菜、什锦菜、酱瓜、萝卜干等腌制食品分离出12株乳酸菌,通过16S核糖体基因序列测定方法的鉴定分别为植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum9株、沙克乳杆菌（Lactobacillussakei2株、戊糖片球菌（Pediococcuspen-tosaceus1株,并分析了它们之间的系统进化关系。
通过产酸、耐盐度等与发酵质量有关的生理生化特征的测定,全面评价不同菌株的发酵特点,并且研究了对亚硝酸盐的降解能力以及发挥此作用的适宜环境条件,筛选到生长快、耐盐度高、能快速降解亚硝酸盐的优良菌株,具有应用于食品工业、环境保护、饲料工业等多方面潜力。
1材料与方法1.1实验材料
乳酸菌分离来源:
泡菜、榨菜、什锦菜、酱瓜、萝卜干购自农贸市场。
腌制食品中降解亚硝酸盐的乳酸菌分离与鉴定
蒋欣茵1,李晓晖,1,2,张伯生1,任大明1*
（1.复旦大学遗传工程国家重点实验室,上海200433;2.上海水产大学食品学院,上海200090
摘
要:
从多种传统腌制蔬菜中分离到12株乳酸菌,对它们的16S核糖体基因进行扩增测序,根据序列的同源性鉴定为植物乳杆菌
（Lactobacillusplantarum
、沙克乳杆菌（Lactobacillussakei和戊糖片球菌（Pediococcuspentosaceus。
对其生化特征以及亚硝酸盐耐受性和降解能力进行了研究和比较,最终筛选出1株各项指标优良,且能快速降解亚硝酸盐的植物乳杆菌J-10,该菌降解亚硝酸钠的最适温度为37℃,最适pH值为6.2,在添加0.25mg/mL的亚硝酸钠的培养液中培养24h后,亚硝酸盐降解率为99.2%。
关键词:
乳酸菌;腌制蔬菜;16SrDNA;鉴定;亚硝酸钠
中图分类号:
Q93-3文献标识码:
A文章编号:
0254-5071
（200801-0013-04Isolationandidentificationofnitrite-degradinglacticacidbacteriafromtraditionalpickledvegetable
JIANGXinyin1,LIXiaohui1,2,ZHANGBosheng1,RENDaming1*
（1.StateKeyLaboratoryofGeneticEngineering,FudanUniversity,Shanghai200433,China;
2.CollegeofFoodScienceandTechnology,ShanghaiFisheriesUniversity,Shanghai200090,China
Abstract:
Lacticacidbacteriaarecommonlyusedinfoodindustry,mainlyinthefermentationprocessofmeatproducts,pricklesanddiaryproducts.Theycanaddspecialflavorandcolortotheproducts,depressthegrowthofpathogens,andreducenitriteconcentrationintheproducts,whichmakestheproductssafertothecustomers.12strainsoflacticacidbacteriawereisolatedfromthepickledvegetables.Afteramplificationandsequencingof16SrDNAgene,theisolatedstrainswereidentifiedbysequencehomologyasfollows:
9strainsofLactobacillusplantarum,2strainsofLactobacillussakeiand1strainofPediococcuspentosaceus.Someoftheirbiochemicalcharacteristicswerestudiedandcompared,aswellastheirabilitiesonthetoleranceanddegradationofnitrite.AL.plantarumstrain,namedJ-10,wasapprovedtodegradenitritequicklywithgoodbiochemicalcharacteristics.Whengrownin0.25mg/mlnitritesodiumaddedmedium,strainJ-10coulddegrade99.2%nitritesodiumat37℃andpH6.2for24h.Keywords:
lacticacidbacteria;pickledvegetables;16SrDNA;identification;nitritesodium
收稿日期:
2007-07-27
基金项目:
复旦大学共青团团委科技创新中心资助;学生学术科技创新基金项目（B1-15-06作者简介:
蒋欣茵（1985-,女,广东广州人;任大明*,教授,通讯作者。
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研究报告
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13・・
2008No.1
SerialNo.178
ChinaBrewing
培养基:
MRS培养基,加碳酸钙MRS培养基（CaMRS,产酸培养基[5]。
1.2实验方法
将各种腌制食品20g放入100mL生理盐水中浸泡1h,用生理盐水稀释至合适浓度。
取出100μL用MRS固体培养基混匀,30℃培养48h。
将单菌落分别点种到产酸培养基和CaMRS平板上,厌氧培养48h。
取培养基由紫变黄及有溶钙圈的菌种进一步进行镜检和革兰氏染色。
KOH试验,过氧化氢酶反应,需氧试验,不同碳源发酵产酸[5]。
生长速度与产酸能力:
30℃恒温静置培养48h后测OD600值和培养基pH值。
生长温度范围测定:
接种菌株分别在15℃、20℃、25℃、30℃、37℃MRS液体培养基培养48h后测定其OD600值。
菌株耐盐性测定:
在MRS培养液中加入NaCl至终浓度5%、10%,48h后测定其OD600值。
乳酸菌菌株间拮抗检验:
参见文献[6]。
MRS固体培养基融化后加入NaNO2至终浓度为5mg/mL、12.5mg/mL、25mg/mL,倒平板。
活化后的菌液分别四区划线培养。
在液体MRS培养基中加入NaNO2至终浓度为0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、10mg/mL、20mg/mL,把已活化的菌液以1%接种量接入5mL液体培养基中厌氧培养。
将降解能力最强的菌株J-10接种到MRS液体培养基中（亚硝酸钠浓度为0.25mg/mL分别在15℃、20℃、25℃、30℃、37℃培养;初始pH值为3.5、4.5、5.5、6.2、6.8;NaNO2添加浓度为0.25mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL,培养24h后测定细胞的生长和亚硝酸盐的降解率,用不接菌的培养液作空白对照。
2结果
2.1从腌制食品中筛选乳酸菌
从泡菜、萝卜干、什锦菜中均分离到了能够使产酸培养基变黄,且具有明显溶钙圈的产酸细菌,编号为J-1、J-2、J-3、J-4、J-5、J-6、J-7、J-8、J-9、J-10、J-11、J-12共12株,从榨菜、酱瓜中未分离得合适菌株。
经过革兰氏染色观察,J-9菌株为阳性球菌,其余均为阳性杆菌,结果见附图。
J-9（P.pentosaceus
J-5（L.sakeiJ-11（L.plantarum
附图光学显微镜下几种菌株的形态特征
Attachedfigure.Themorphologicalcharacteristicsofseveralstrains
2.2菌株16SrDNA基因鉴定
对12株菌株经过全长16SrDNA基因的PCR扩增和测序,与NCBI上的标准序列作比对,确定分离的12株菌均为乳酸菌,分属于3个不同的种,分离得到的菌株与所属种的代表株之间的序列同源性均超过99%,其中9株是植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum（J-2、J-3、J-4、J-6、J-7、J-8、J-10、J-11、J-12号,2株是沙克乳杆菌（Lactobacillussakei（J-1、J-5,1株是戊糖片球菌（Pediococcuspentosaceus（J-9。
植物乳杆菌是发酵食品中常见的乳酸菌,也是重要的工业用菌和益生菌,安全性好,生长迅速,产酸值大。
从植物中分离得到植物乳杆菌与戊糖片球菌均有较多报道,然而泡菜中分离出沙克乳杆菌则是较少有的情况。
2.3菌株的基本生化特征测定（见表1
由表1可见,分离的12株菌株在深层MRS液体培养ResearchReport
14・・
中国酿造
2008年第1期总第178期项目++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++d+++++++++++d+++d+++++++-ddd-ddd-dd-菌株间拮抗------------KOH实验------------过氧化氢酶活性-
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++++++++++++dd---d---d--
-ddd-dd+-+ddd+++d++++d+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++生长
温
度
15
20253037耐盐性5%NaCl10%NaCl
生长和产酸能
力OD600培养液终pH值菌株
J-1J-2J-3J-4J-5J-6J-7J-8J-9J-10J-11J-12d+++d+++++++不同碳
源乳糖
蔗糖D-半乳糖葡萄糖棉子糖丁二酸钠柠檬酸钠乳酸钠需氧实验
厌氧兼性厌氧兼性厌氧兼性厌氧厌氧兼性厌氧兼性厌氧兼性厌氧兼性厌氧兼性厌氧兼性厌氧兼性厌氧
基中多数均匀分布,为兼性厌氧,但J-1与J-5菌株趋向于试管底部生长,厌氧要求较严格。
各菌株培养12h后生长均比较旺盛,
J-10菌株最为迅速,同时它的培养液pH值下降也最快,产酸的累积与生长的快慢有一定的正相关性。
菌株间无明显拮抗现象,可用于混合发酵。
菌株对5%NaCl的耐受性较好,但在NaCl浓度为10%时生长均被严重抑制。
将各菌株置于含不同碳源的培养基上培养,发现其在蔗糖、D-半乳糖、葡萄糖、棉子糖、乳糖等培养基中均可以发酵产酸,使培养液颜色由紫变黄,但在一些非碳水化合物碳源的培养基中生长较缓慢。
在乳酸钠和丁二酸钠培养基中能发酵产酸;在柠檬酸钠培养基中几乎不能生长,非糖类碳源对沙克乳杆菌和戊糖片球菌生长的制约更为明显。
各个菌株置于不同的温度下培养48h后均有一定程度的生长,以30℃生长最为旺盛,与文献描述的乳酸菌生长特征相符。
而过低与过高的温度都是其生长的制约因素,在15℃各乳酸菌生长十分缓慢,而产酸累积也较低,J-5菌株甚至不能在此温度下生长。
随着温度的上升乳酸菌生长速度加快,但在37℃时速度反而下降,可能是由于此温度下乳酸菌迅速达到生长的稳定期,不利于生物量的累积。
总体
来说植乳酸杆菌的生长温度范围较广,尤其是J-10在低温下仍然表现出旺盛的生长能力和产酸能力。
2.4亚硝酸盐耐受性测定
亚硝酸盐耐受性测定结果（表2表明,所有菌株均能在NaNO2浓度为2mg/mL的MRS液体培养基中生长。
但随着亚硝酸盐浓度的提高,对菌株的生长也逐渐减慢,甚至不能生长,说明高浓度亚硝酸盐对乳酸菌生长具有毒害作用。
J-8、J-9和J-10具有较高的亚硝酸盐耐受能力,可以在NaNO2浓度为4mg/mL的液体培养基中生长,但超过此浓度所有乳酸菌株均不能生长。
乳酸菌株在含NaNO2固体培养基上的耐受能力相对较高,所有菌株都可以在5mg/mL的亚硝酸盐MRS固体培养基上生长,J-4和J-7耐受浓度可达到25mg/mL,但仍然显现出受亚硝酸盐制约的倾向,表现为菌落细小,生长缓慢。
2.5菌株降解亚硝酸盐能力测定
对分离的12株乳酸菌在含0.25mg/mL亚硝酸盐MRS液体培养基,经过72h培养后测量残余的亚硝酸盐含量,结果见表3。
由表3可知,
不同乳酸菌菌株均具有一定的亚硝酸盐降解能力,但是降解能力不同。
总体来说,植物乳杆菌的降解能力较强,72h以后亚硝酸盐含量降低为原来的0.3%￣1.6%,戊糖片球菌的降解能力次之,亚硝酸盐含量降为原来的15%,沙克乳杆菌虽然降解能力较弱,但是72h
表1不同菌株的生化特征
Table1.Biochemicalcharacteristicsofdifferentstrains注:
“+”为阳性反应,“-”为阴性反应,“d”为不确定。
表2菌株对亚硝酸盐的耐受浓度实验
Table2.Thresholdconcentrationonnitriteofdifferentstrains项目
含亚硝酸盐
MRS液体培养液/（
mg・mL-1
222
2
2
2
2
4
4
4
2
2
含亚硝酸盐
MRS平板固体/（mg・mL-1
菌株
J-1J-2J-3J-4J-5J-6J-7J-8J-9J-10J-11J-12
研究报告
/℃菌株编号最终亚硝酸盐
含量/（mg・mL-1降解率/%培养液最终pH值
12.0
6.5
J-1
J-5L.plantarum
J-2J-3J-4J-6J-7J-8J-10J-11J-12P.pentosaceu
J-9对照
L.sakei表3不同菌株降解亚硝酸盐能力
Table3.Nitritereductionactivityofdifferentstrains培养48
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2008No.1SerialNo.178
ChinaBrewing
以后亚硝酸盐含量也降为原来的28%。
不同的菌种降解能力相差明显,但是同一属的不同菌株之间降解能力比较类似。
同时pH值的下降与亚硝酸盐的最终降解量有一定的正相关关系,即最终酸度越大亚硝酸盐降解越明显。
乳酸菌生长产酸降低培养液的pH值,从而使亚硝酸盐在酸性条件下分解是乳酸菌降解亚硝酸盐的原因之一。
2.6温度、pH值、
亚硝酸盐浓度对J-10菌降解亚硝酸盐的影响选取了降解亚硝酸盐能力最强的L.plantarumJ-10菌株作进一步研究,结果见表4。
低温不利于菌体生长,因此亚硝酸盐的降解能力也显著地下降。
但随着培养时间的延长,其生物量逐渐积累则亚硝酸盐仍可以降解,因此温度只是影响亚硝酸盐降解的速度。
菌体最适生长温度为30℃,在25℃￣37℃生长良好且差异不大,但亚硝酸盐的最高降解温度为37℃。
J-10菌株在pH2以下不能生长,但降解率没有受到明显影响,而pH4.5以上则对它的生长无明显限制。
证明在pH4.5以下亚硝酸盐会自发降解,pH值越低则降解速度越大[8]。
J-10菌株的最适生长pH值为6.2,在该pH值条件下达到最大的生长量,对亚硝酸钠的降解率也最高。
随着亚硝酸盐浓度的增高,J-10菌株生长逐渐减缓,生物量积累缓慢,说明亚硝酸盐对于微生物细胞具有毒害作用。
培养24h后,0.5mg/mL亚硝酸盐降解率可达90%,而高浓度的亚硝酸盐降解率却不足30%。
值得注意的是在亚硝酸盐浓度较高时培养液上层出现小的气泡,而在较低浓度的培养液中却没有,有可能是较高浓度的亚硝酸盐诱发了乳酸菌的酶降解途径,气泡为降解的含氮产物,与文献的推测相符[8]。
3讨论
从泡菜、萝卜干、什锦菜等多种腌制食品中分离得到12株乳酸菌,经过16SrDNA鉴定分别属于植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum
、沙克乳杆菌（Lactobacillussakei、戊糖片球菌（Pediococcuspentosaceus.,说明在植物来源的腌制食品中乳酸菌有一定的多样性。
实验分离得到的12株菌对于厌氧要求均不严格,可以适用于一般的工业生产。
同时各菌株生长迅速,可以在较短时间内有较大的生物量积累。
在乳酸钠和丁二酸钠培养基中生长较好,对碳源要求不严格,耐盐性也达到了腌制食品的要求。
分离的乳酸菌均可在一定程度上耐受亚硝酸盐,同时具有降低亚硝酸盐浓度的能力。
这种能力具有种间特异性,其中植物乳杆菌对于亚硝酸盐的降解能力最强,沙克乳杆菌最低。
降解能力同时受到温度、pH值、亚硝酸钠浓度等条件的限制。
关于乳酸菌降低亚硝酸盐含量的驱动作用一直有酸驱动或是亚硝酸盐降解酶作用的看法。
张庆芳等[8]认为酶作用与酸作用有一条界线,在这一界限以下的pH值可使亚硝酸盐自动降解。
而在界线以上的降解则要靠酶的作用。
而GUDEUNW等[9]很早就测定了乳酸菌的亚硝酸盐降解酶降解能力。
实验发现高底物浓度培养液培养虽然pH值不利于亚硝酸盐的自发降解,但仍有一定的降解能力,并且有气泡的产生,可能提示了高浓度刺激下降解亚硝酸盐的酶反应途径。
另外亚硝酸盐耐受与降解亚硝酸盐的能力并不成正比,耐受性强的未必降解能力大,可能两者有不同的机制。
总之,从腌制食品中分离得到的乳酸菌菌株可以快速生长,耐受较高盐浓度环境,对碳水化合物要求不高,并且可以降解亚硝酸盐,具有较大的应用于食品、环境工程的潜力。
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