腌制食品中降解亚硝酸盐的乳酸菌分离与鉴定蒋欣茵.docx

1、腌制食品中降解亚硝酸盐的乳酸菌分离与鉴定蒋欣茵中 国 酿 造2008年 第 1期 总第 178期 腌制食品 (包括泡菜、 腐乳、 腌肉等 是经微生物发酵 与各种环境因素共同作用而成, 具有独特的醇香风味。乳 酸菌是腌制食品自然发酵中的常见菌种之一 1, 乳酸发酵 通常被认为是安全的, 其代谢产物赋予食品芳香的风味和 良好的口感, 并且可以降低发酵液的 pH 值, 从而抑制有害 菌的生长, 乳酸菌的发酵还可以显著降低腌肉制品亚硝酸 盐的含量。 因此, 利用人工接种发酵菌种, 控制腌制食品质 量并且抑制有害微生物的生长, 提高腌制食品的安全, 有 广泛的应用前景 2。亚硝酸盐是 N-亚硝基化合物的

2、前体物。 现已确定 N-亚硝基化合物对动物有较强的致癌作用。亚硝酸盐可以 经过化学或生物学的途径合成多种多样的 N-亚硝基化 合物, 而亚硝胺的形成浓度和亚硝酸盐的平方成正比。盐 腌食品在腌制过程中, 一部分是由于粗制食盐中有硝酸 盐, 可被细菌降解为亚硝酸盐, 另外可能在腌制过程中, 食 品发生了化学作用产生了亚硝酸盐。从特定食品中分离的乳酸菌是对该食品进行乳酸发酵的最佳出发菌株, 因为它们具有更强的竞争力。 OHCK 等 3从泡菜中分离出可高效降解亚硝酸盐的乳酸菌, 梁恒宇 等 4从自然发酵黄豆酱中分离得到耐盐的乳酸菌株。 本研 究从泡菜、 榨菜、 什锦菜、 酱瓜、 萝卜干等腌制食品分离出

3、 12株乳酸菌, 通过 16S 核糖体基因序列测定方法的鉴定分 别为植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum 9株、 沙克乳杆菌 (Lactobacillus sakei 2株、 戊糖片球菌 (Pediococcus pen-tosaceus 1株, 并分析了它们之间的系统进化关系。通过 产酸、 耐盐度等与发酵质量有关的生理生化特征的测定, 全面评价不同菌株的发酵特点,并且研究了对亚硝酸盐 的降解能力以及发挥此作用的适宜环境条件,筛选到生 长快、 耐盐度高、 能快速降解亚硝酸盐的优良菌株, 具有 应用于食品工业、 环境保护、 饲料工业等多方面潜力。 1材料与方法 1.1实验

4、材料乳酸菌分离来源:泡菜、 榨菜、 什锦菜、 酱瓜、 萝卜干购 自农贸市场。腌制食品中降解亚硝酸盐的乳酸菌分离与鉴定蒋欣茵 1, 李晓晖 , 1, 2, 张伯生 1, 任大明 1*(1. 复旦大学 遗传工程国家重点实验室 , 上海 200433; 2. 上海水产大学 食品学院 , 上海 200090摘要 :从多种传统腌制蔬菜中分离到 12株乳酸菌, 对它们的 16S 核糖体基因进行扩增测序, 根据序列的同源性鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum 、 沙克乳杆菌 (Lactobacillus sakei 和戊糖片球菌 (Pediococcus pentosaceus

5、。 对其生化特征以及亚硝酸盐耐受 性和降解能力进行了研究和比较, 最终筛选出 1株各项指标优良, 且能快速降解亚硝酸盐的植物乳杆菌 J-10, 该菌降解亚硝酸钠的最 适温度为 37 , 最适 pH 值为 6.2, 在添加 0.25mg/mL 的亚硝酸钠的培养液中培养 24h 后, 亚硝酸盐降解率为 99.2%。 关 键 词 :乳酸菌; 腌制蔬菜; 16S rDNA ; 鉴定; 亚硝酸钠中图分类号 :Q93-3文献标识码 :A 文章编号 :0254-5071(2008 01-0013-04Isolation and identification of nitrite-degrading lact

6、ic acid bacteria from traditional pickled vegetableJIANG Xinyin 1, LI Xiaohui 1, 2, ZHANG Bosheng 1, REN Daming 1*(1. State Key Laboratory of Genetic Engineering, Fudan University, Shanghai 200433, China;2. College of Food Science and Technology, Shanghai Fisheries University, Shanghai 200090, China

7、Abstract :Lactic acid bacteria are commonly used in food industry, mainly in the fermentation process of meat products, prickles and diary products. They can add special flavor and color to the products, depress the growth of pathogens, and reduce nitrite concentration in the products, which makes t

8、he products safer to the customers. 12strains of lactic acid bacteria were isolated from the pickled vegetables. After amplification and sequencing of 16S rDNA gene, the isolated strains were identified by sequence homology as follows:9strains of Lactobacillus plantarum, 2strains of Lactobacillus sa

9、kei and 1strain of Pediococcus pentosaceus. Some of their biochemical characteristics were studied and compared, as well as their abilities on the tolerance and degradation of nitrite. A L. plantarum strain, named J-10, was approved to degrade nitrite quickly with good biochemical characteristics. W

10、hen grown in 0.25mg/ml nitrite sodium added medium, strain J-10could degrade 99.2%nitrite sodium at 37 and pH 6.2for 24h. Key words :lactic acid bacteria ; pickled vegetables ; 16S rDNA ; identification ; nitrite sodium收稿日期 :2007-07-27基金项目 :复旦大学共青团团委科技创新中心资助; 学生学术科技创新基金项目 (B1-15-06 作者简介 :蒋欣茵 (1985-

11、, 女, 广东广州人; 任大明 *, 教授, 通讯作者。6施安辉, 赵正溪, 张治国 . 利用新型复合酶提高固态食醋风味和出品 率的研究 J. 江苏调味副食品, 2003(3 :1-3.7施安辉, 韩作华, 张文璞 . 在简化固态食醋酿造过程中添加新型复合酶制剂的应用实验 J. 中国调味品,2001(10 :11-14. 8施安辉, 邢冠伍, 高遐龄 . 酱油酿造新技术 M. 北京, 学术期刊出版 社, 1989.研究报告!13 2008No.1Serial No.178China Brewing培养基:MRS 培养基, 加碳酸钙 MRS 培养基 (CaMRS , 产酸培养基 5。1.2实验方

12、法将各种腌制食品 20g 放入 100mL 生理盐水中浸泡 1h , 用生理盐水稀释至合适浓度。 取出 100L 用 MRS 固体培 养基混匀, 30培养 48h 。将单菌落分别点种到产酸培养 基和 CaMRS 平板上, 厌氧培养 48h 。 取培养基由紫变黄及 有溶钙圈的菌种进一步进行镜检和革兰氏染色。KOH 试验, 过氧化氢酶反应, 需氧试验, 不同碳源发 酵产酸 5。生长速度与产酸能力:30恒温静置培养 48h 后测 OD 600值和培养基 pH 值。生长温度范围测定:接种菌株分别在 15 、 20 、 25 、 30 、 37 MRS 液体培养基培养 48h 后测定其 OD 600值。

13、 菌株耐盐性测定:在 MRS 培养液中加入 NaCl 至终 浓度 5%、 10%, 48h 后测定其 OD 600值。乳酸菌菌株间拮抗检验:参见文献 6。MRS 固体培养基融化后加入 NaNO 2至终浓度为 5mg/mL 、 12.5mg/mL 、 25mg/mL , 倒平板。活化后的菌液分 别四区划线培养。 在液体 MRS 培养基中加入 NaNO 2至终 浓度为 0.5mg/mL 、 1mg/mL 、 2mg/mL 、 4mg/mL 、 10mg/mL 、 20mg/mL , 把已活化的菌液以 1%接种量接入 5mL 液体培 养基中厌氧培养。将降解能力最强的菌株 J-10接种到 MRS 液体

14、培养 基中 (亚硝酸钠浓度为 0.25mg/mL 分别在 15、 20、 25、 30、 37培养; 初始 pH 值为 3.5、 4.5、 5.5、 6.2、 6.8; NaNO 2添 加浓度为 0.25mg/mL 、 0.5mg/mL 、 1mg/mL 、 2mg/mL 、 3mg/mL , 培养 24h 后测定细胞的生长和亚硝酸盐的降解 率, 用不接菌的培养液作空白对照。2结果2.1从腌制食品中筛选乳酸菌从泡菜、 萝卜干、 什锦菜中均分离到了能够使产酸培 养基变黄, 且具有明显溶钙圈的产酸细菌, 编号为 J-1、 J-2、 J-3、 J-4、 J-5、 J-6、 J-7、 J-8、 J-9

15、、 J-10、 J-11、 J-12共 12株, 从榨 菜、 酱瓜中未分离得合适菌株。经过革兰氏染色观察, J -9菌株为阳性球菌, 其余均为阳性杆菌, 结果见附图。J-9(P. pentosaceus J-5(L.sakei J-11(L.plantarum 附图 光学显微镜下几种菌株的形态特征Attached figure. The morphological characteristics of several strains2.2菌株 16SrDNA 基因鉴定对 12株菌株经过全长 16SrDNA 基因的 PCR 扩增和 测序, 与 NCBI 上的标准序列作比对, 确定分离的 12株菌

16、 均为乳酸菌, 分属于 3个不同的种, 分离得到的菌株与所 属种的代表株之间的序列同源性均超过 99%, 其中 9株是 植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum (J-2、 J-3、 J-4、 J-6、 J-7、 J-8、 J-10、 J-11、 J-12号 , 2株是沙克乳杆菌 (Lactobacillussakei (J-1、 J-5 , 1株是戊糖片球菌 (Pediococcuspentosaceus (J-9 。 植物乳杆菌是发酵食品中常见的乳酸菌, 也是重要的工业 用菌和益生菌, 安全性好, 生长迅速, 产酸值大。从植物中分 离得到植物乳杆菌与戊糖片球菌均有较多报

17、道,然而泡 菜中分离出沙克乳杆菌则是较少有的情况。2.3菌株的基本生化特征测定 (见表 1由表 1可见, 分离的 12株菌株在深层 MRS 液体培养 Research Report14 中 国 酿 造2008年 第 1期 总第 178期 项目 +d +d +d +-d d d -d d d -d d -菌株间拮抗 -KOH 实验 -过氧化氢 酶活性 -+d d -d -d -d d d -d d +-+d d d +d +d +生 长温度1520253037耐 盐 性 5%NaCl 10%NaCl生 长 和 产 酸 能力 OD 600培养 液终 pH 值 菌株J-1J-2J-3J-4J-5J-

18、6J-7J-8J-9J-10J-11J-12d +d +不 同 碳源 乳糖蔗糖 D-半乳糖 葡萄糖 棉子糖 丁二酸钠 柠檬酸钠 乳酸钠 需氧实验厌 氧 兼性 厌氧 兼性 厌氧 兼性 厌氧 厌 氧 兼性 厌氧 兼性 厌氧 兼性 厌氧 兼性 厌氧 兼性 厌氧 兼性 厌氧 兼性 厌氧基中多数均匀分布, 为兼性厌氧, 但 J-1与 J-5菌株趋向于 试管底部生长, 厌氧要求较严格。各菌株培养 12h 后生长 均比较旺盛,J-10菌株最为迅速, 同时它的培养液 pH 值下 降也最快, 产酸的累积与生长的快慢有一定的正相关性。菌 株间无明显拮抗现象, 可用于混合发酵。菌株对 5%NaCl 的 耐受性较好,

19、 但在 NaCl 浓度为 10%时生长均被严重抑制。将各菌株置于含不同碳源的培养基上培养, 发现其在 蔗糖、 D-半乳糖、 葡萄糖、 棉子糖、 乳糖等培养基中均可以 发酵产酸, 使培养液颜色由紫变黄, 但在一些非碳水化合 物碳源的培养基中生长较缓慢。在乳酸钠和丁二酸钠培养 基中能发酵产酸; 在柠檬酸钠培养基中几乎不能生长, 非糖 类碳源对沙克乳杆菌和戊糖片球菌生长的制约更为明显。各个菌株置于不同的温度下培养 48h 后均有一定程 度的生长, 以 30生长最为旺盛, 与文献描述的乳酸菌生 长特征相符。而过低与过高的温度都是其生长的制约因素, 在 15 各乳酸菌生长十分缓慢, 而产酸累积也较低,

20、J-5菌株 甚至不能在此温度下生长。随着温度的上升乳酸菌生长速 度加快, 但在 37时速度反而下降, 可能是由于此温度下 乳酸菌迅速达到生长的稳定期, 不利于生物量的累积。总体来说植乳酸杆菌的生长温度范围较广, 尤其是 J-10在低温 下仍然表现出旺盛的生长能力和产酸能力。 2.4亚硝酸盐耐受性测定亚硝酸盐耐受性测定结果 (表 2 表明, 所有菌株均能 在 NaNO 2浓度为 2mg/mL 的 MRS 液体培养基中生长。 但 随着亚硝酸盐浓度的提高, 对菌株的生长也逐渐减慢, 甚 至不能生长, 说明高浓度亚硝酸盐对乳酸菌生长具有毒害 作用。 J-8、 J-9和 J-10具有较高的亚硝酸盐耐受能

21、力, 可以在 NaNO 2浓度为 4mg/mL 的液体培养基中生长, 但超过此浓 度所有乳酸菌株均不能生长。乳酸菌株在含 NaNO 2固体培养基上的耐受能力相对 较高, 所有菌株都可以在 5mg/mL 的亚硝酸盐 MRS 固体培养 基上生长, J-4和 J-7耐受浓度可达到 25mg/mL , 但仍然显 现出受亚硝酸盐制约的倾向, 表现为菌落细小, 生长缓慢。2.5菌株降解亚硝酸盐能力测定对分离的 12株乳酸菌在含 0.25mg/mL 亚 硝 酸 盐 MRS 液体培养基, 经过 72h 培养后测量残余的亚硝酸盐 含量, 结果见表 3。由表 3可知,不同乳酸菌菌株均具有一定的亚硝酸盐 降解能力,

22、 但是降解能力不同。总体来说, 植物乳杆菌的 降解能力较强, 72h 以后亚硝酸盐含量降 低为原来的 0.3%1.6%, 戊糖片球菌的降解能力次之, 亚硝酸盐含量 降为原来的 15%, 沙克乳杆菌虽然降解能力较弱, 但是 72h表 1不同菌株的生化特征Table 1. Biochemical characteristics of different strains 注:“ +” 为阳性反应, “ -” 为阴性反应, “ d ” 为不确定。表 2菌株对亚硝酸盐的耐受浓度实验Table 2. Threshold concentration on nitrite of different strai

23、ns 项目含亚硝酸盐MRS 液体培养 液 /(mg mL -1222222244422含亚硝酸盐MRS 平板固 体 /(mg mL -1菌株J-1J-2J-3J-4J-5J-6J-7J-8J-9J-10J-11J-12研究报告/ 菌株编号 最终亚硝酸盐含量 /(mg mL -1 降解率 /%培养液最终 pH 值12.06.5J-1J-5L.plantarumJ-2J-3J-4J-6J-7J-8J-10J-11J-12P. pentosaceuJ-9对照L.sakei 表 3不同菌株降解亚硝酸盐能力Table 3. Nitrite reduction activity of different

24、strains 培 养 48h 15 2008No.1Serial No.178China Brewing以后亚硝酸盐含量也降为原来的 28%。 不同的菌种降解能 力相差明显, 但是同一属的不同菌株之间降解能力比较类 似。 同时 pH 值的下降与亚硝酸盐的最终降解量有一定的 正相关关系, 即最终酸度越大亚硝酸盐降解越明显。乳酸 菌生长产酸降低培养液的 pH 值, 从而使亚硝酸盐在酸性 条件下分解是乳酸菌降解亚硝酸盐的原因之一。 2.6温度、 pH 值、亚硝酸盐浓度对 J-10菌降解亚硝酸盐的影响 选取了降解亚硝酸盐能力最强的 L.plantarum J-10菌株 作进一步研究, 结果见表 4。

25、 低温不利于菌体生长, 因此亚 硝酸盐的降解能力也显著地下降。但随着培养时间的延 长, 其生物量逐渐积累则亚硝酸盐仍可以降解, 因此温度 只是影响亚硝酸盐降解的速度。 菌体最适生长温度为 30 , 在 25 37生长良好且差异不大, 但亚硝酸盐的最高降 解温度为 37 。J-10菌株在 pH 2以下不能生长, 但降解率没有受到明 显影响, 而 pH 4.5以上则对它的生长无明显限制。 证明在 pH 4.5以下亚硝酸盐会自发降解, pH 值越低则降解速度 越大 8。 J-10菌株的最适生长 pH 值为 6.2, 在该 pH 值条件 下达到最大的生长量, 对亚硝酸钠的降解率也最高。随着亚硝酸盐浓度

26、的增高, J-10菌株生长逐渐减缓, 生 物量积累缓慢, 说明亚硝酸盐对于微生物细胞具有毒害作 用。培养 24h 后, 0.5mg/mL 亚硝酸盐降解率可达 90%, 而 高浓度的亚硝酸盐降解率却不足 30%。值得注意的是在 亚硝酸盐浓度较高时培养液上层出现小的气泡, 而在较低 浓度的培养液中却没有, 有可能是较高浓度的亚硝酸盐诱 发了乳酸菌的酶降解途径, 气泡为降解的含氮产物, 与文 献的推测相符 8。 3讨论从泡菜、 萝卜干、 什锦菜等多种腌制食品中分离得到 12株乳酸菌, 经过 16SrDNA 鉴定分别属于植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum 、 沙克乳杆菌 (L

27、actobacillus sakei 、 戊糖片球菌 (Pediococcus pentosaceus. , 说明在植物来源 的腌制食品中乳酸菌有一定的多样性。实验分离得到的 12株菌对于厌氧要求均不严格, 可 以适用于一般的工业生产。同时各菌株生长迅速, 可以在 较短时间内有较大的生物量积累。在乳酸钠和丁二酸钠 培养基中生长较好, 对碳源要求不严格, 耐盐性也达到了 腌制食品的要求。 分离的乳酸菌均可在一定程度上耐受亚 硝酸盐, 同时具有降低亚硝酸盐浓度的能力。这种能力具 有种间特异性, 其中植物乳杆菌对于亚硝酸盐的降解能力 最强, 沙克乳杆菌最低。 降解能力同时受到温度、 pH 值、 亚

28、硝酸钠浓度等条件的限制。关于乳酸菌降低亚硝酸盐含 量的驱动作用一直有酸驱动或是亚硝酸盐降解酶作用的 看法。张庆芳等 8认为酶作用与酸作用有一条界线, 在这 一界限以下的 pH 值可使亚硝酸盐自动降解。 而在界线以 上的降解则要靠酶的作用。而 GUDEUN W 等 9很早就测 定了乳酸菌的亚硝酸盐降解酶降解能力。实验发现高底 物浓度培养液培养虽然 pH 值不利于亚硝酸盐的自发降 解, 但仍有一定的降解能力, 并且有气泡的产生, 可能提示 了高浓度刺激下降解亚硝酸盐的酶反应途径。另外亚硝酸 盐耐受与降解亚硝酸盐的能力并不成正比, 耐受性强的未 必降解能力大, 可能两者有不同的机制。总之, 从腌制食

29、品中分离得到的乳酸菌菌株可以快速生 长, 耐受较高盐浓度环境, 对碳水化合物要求不高, 并且可以 降解亚硝酸盐, 具有较大的应用于食品、 环境工程的潜力。 参考文献 :1KIM M, CHUN J. Bacterial community structure in kimchi, a Korean fer-mented vegetable food, as revealed by 16S rRNA gene analysis J. Int J Food Microbiol , 2005(103 :91-96. 2周光燕, 张小平, 钟凯, 等 . 乳酸菌对泡菜发酵过程中亚硝酸盐含量变化及泡菜品

30、质的影响研究 J. 西南农业学报, 2006, 19(2 :290-293. 3OH C K, OH M C, and KIM S H. The depletion of sodium nitrite by lac-tic acid bacteria isolated from kimchi J. J Med Food , 2004(7 :38-44. 4梁恒宇, 马 莺, 程建军, 等 . 自然发酵黄豆酱中嗜盐乳酸菌的分离鉴定与筛选 J. 中国酿造, 2006(8 :24-27.5肖静, 孙剑秋, 王秀静, 等 . 发酵白菜种乳酸菌的分离及鉴定 J. 中 国酿造,2006(5 :17-19.

31、 6刘素纯, 胡茂丰, 李宗军 . 自然发酵肉制品中乳酸菌的分离及特性研 究 J. 食品与机械, 2006, 22(2 :62-65.7周文斌 . 泡菜中亚硝酸盐测定方法研究 J. 食品科学, 2006, 27(2 :241-243. 8张庆芳, 迟乃玉, 郑燕, 等 . 乳酸菌降解亚硝酸盐机理的研究 J. 食品与发酵工业, 2002, 28(8 :27-31.9GUDRUN W, ELKE K A, UTE P, et al. Heme-dependent and heme-in-dependent nitrite reduction by lactic acid bacteria results in different N-containing products J. Int