质粒DNA测定实验报告.docx

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质粒DNA测定实验报告

生物化学实验报告

姓名：

学号：

专业年级：

组别：

生物化学与分子生物学实验教学中心

实验名称

实验日期

实验地点

合作者

指导老师

评分

教师签名

批改日期

格式要求：

正文请统一用：

小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用TimesNewRoman；标题用：

四号，黑体，加粗。

需强调的地方请用蓝颜色标出。

不得出现多行、多页空白现象。

一、实验目的

1.掌握PCR基因扩增的原理和操作方法

2.掌握碱裂解法提取质粒的方法

3.了解紫外吸收法检测DNA浓度与纯度的原理、方法

4.学习水平式琼脂糖凝胶电泳操作

二、实验原理

1.PCR（多聚酶链式反应）

在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。

PCR一次循环的具体反应步骤为：

A.变性：

加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。

B.退火：

逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。

C.延伸：

溶液反应温度升至中温72℃，在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。

2.质粒DNA的提取与制备

（1）碱裂解法：

染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异：

A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性；

B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。

（2）离心层析柱：

A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；

B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；

C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。

3.质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）：

A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；

B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱:

DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰

蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰

碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰

C.A260/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度；

A260/A280=1.8DNA纯净

A260/A280<1.8表示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质

A260/A280>1.8含RNA杂质，用RNA酶去除。

4.质粒DNA的酶切鉴定：

限制性内切酶是DNA重组操作过程中所使用的基本工具。

限制性内切酶能特异性地与一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列结合，或是与其附近的特异位点结合，并在结合位点切割双链DNA。

5.琼脂糖凝胶电泳：

琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。

DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应：

不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带（迁移速度与分子量的对数值成反比关系）.

三、材料与方法：

以流程图示意

（一）实验材料：

1.PCR

仪器：

PCR仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管

材料：

菌液：

大肠杆菌DH5a菌株（含靶基因CHD5片段的pMD18-T）、无菌去离子水、2×PremixTaq、引物

2.质粒DNA的提取与制备

仪器：

恒温培养箱、台式离心机、离心层析柱、Eppendorf管、微量加样枪、离心管

材料：

溶液P1（S1）、溶液P2（S2）、溶液P3（S3）、去蛋白液PE（W1）、漂洗液WB（W2）、洗脱液EB（Eluent）、含pMD19-T质粒的大肠杆菌DH5α

3.质粒DNA的定量（紫外分光光度法）

仪器：

比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪

材料：

蒸馏水、质粒ＤＮＡ

4.质粒DNA的酶切鉴定

仪器：

1.5ml的EP管、微量加样枪

材料：

无菌水、10×M酶切缓冲液BufR、质粒DNA、HindIII（15U/ul）、EcoRI（12U/ul）

5.琼脂糖凝胶电泳

仪器：

凝胶电泳系统、凝胶成像系统

材料：

电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNAMarker5000、电泳缓冲液

（2）实验方法：

1.实验流程：

简述实验内容流程，PCR操作步骤

↓

煮菌，PCR（PCR程序最后设4℃保温）

↓PCR仪运行约2小时

↓学习PCR原理、质粒DNA提取和酶切原理

质粒DNA提取（约1小时）

↓

酶切操作

↓保温约1~2小时

↓学习紫外检测定量原理、琼脂糖电泳原理

紫外检测定量

↓

电泳上样（样品：

质粒DNA，PCR产物，酶切产物，Marker）

↓电泳仪运行约30分钟

观察电泳结果、记录、拍照、保存

2.实验步骤

1）PCR反应

①菌体煮沸10分钟，冷冻，室温下解冻后离心，取上清液。

②取PCR反应管，用加样枪加入下列各试剂。

试剂体积

灭菌去离子水4.5ul

2*PremixTap12.5ul

引物1-SO100（10mol/L）1.5ul

引物2-SO101（10mol/L）1.5ul

菌液5ul

总体积25ul

注意：

如配好的反应液较多沾到管壁上，可将PCR反应管置台式离心机中瞬时离心，使反应液集中于管底，然后将反应管放到基因扩增仪（PCR仪）上。

③按照以下顺序操作PCR仪进行基因扩增

ⅰ、94℃预变性5分钟后开始以下循环；

ⅱ、94℃、30秒；

ⅲ、55℃、30秒；

ⅳ、72℃1分钟；

ⅴ、25个循环

ⅵ、72℃5分钟；

ⅶ、4℃保温。

实验过程约1小时30分钟.

2）质粒DNA提取与定量：

步骤

操作流程

①

取1.5ml培养物加入Eppendorf管中

②

13000rpm离心1min，弃上清液

③

加入250μl溶液S1，吹打，使细菌沉淀分散，彻底悬浮

④

加入250μl溶液S2，颠倒4～6次混匀（不要剧烈振荡），直到溶液变得清亮

⑤

加入350μl溶液S3，立即温和混匀6~8次。

13000rpm离心10min，小心取上清液（700μl）。

⑥

将吸附柱放于收集管中，将上一步所得上清液加入吸附柱中，13000rpm离心3min，弃滤液。

⑦

加入500μl去蛋白液W1，13000rpm离心1min，弃滤液

⑧

向吸附柱中加入700μl漂洗液W2，13000rpm离心1min，弃滤液

⑨

重复步骤8一次

⑩

空柱13000rpm离心1min，然后开盖室温放置3min，使残留乙醇挥发

11

取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加30μl洗脱缓冲液（Eluent），室温放置1min，13000rpm离心1min洗脱质粒DNA，保留备用。

紫外光吸收法定量检测

3）酶切鉴定

在一个洁净的1.5mlEP管中按顺序依次加入下述试剂

试剂名称

体积（µl）

无菌水

9.0

10×M酶切缓冲液 

2.0

质粒DNA 

7.0（约500ng）

Hind III （15U/ul）

1.0

EcoR I  （12U/ul）

1.0

总体积

20.0

移液枪轻轻混匀（避免产生气泡）,37℃水浴1.5h

4）琼脂糖凝胶电泳

电压：

80~120V时间：

15~30分钟

注意事项：

1　倒胶时把握好胶的温度，不要高于60℃，否则温度太高会使制板变形

2　胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔

3　电泳前，确认样品孔位于电场负极；

4　点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，缓冲液不要太多

5　Geldview有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔

6　紫外线照射不要太久

上样

每组加3个样品孔，记住位置

第一孔：

9µl质粒DNA与1µl6×loadingbuffer混匀后上样

第二孔：

9µl酶切产物与1µl6×loadingbuffer混匀后上样

第三孔：

10µlPCR产物直接上样

四、结果与讨论：

结果：

实验数据、现象、图谱；

讨论：

以结果为基础的逻辑推论，并得出结论。

（一）实验结果：

1.PCR反应：

溶液体系完成经过PCR扩增后，得到的PCR反应管内溶液呈绿色。

2.质粒DNA提取与定量：

培养物在EP管中呈白色，加入溶液S1后细菌沉淀分散，加入溶液S2混匀后溶液变得清亮，再加入溶液S3，管内出现白色絮状沉淀，加漂洗液W2后，经离心分离出无色透明的上清液与底层的白色沉淀。

紫外光吸收法定量检测

测量次数

质粒DNA浓度（μg/ml）

Ratio值（A260/A280）

①

87.0

1.73

②

81.1

1.81

③

78.2

1.78

平均值

82.1

1.77

3.酶切鉴定：

经酶切37℃水浴1.5h后得到无色透明溶液。

4.琼脂糖凝胶电泳：

我们小组是10、11、12

（2）讨论

1.A260/A280的比值可以反应DNA的纯度

A260/A280=1.6-1.9DNA样品较纯,符合实验要求

A260/A280<1.6有蛋白质或者其他杂质的污染

A260/A280>1.9RNA污染

本实验中A260/A280=1.77说明DNA样品基本较纯,符合实验要求。

2.琼脂糖凝胶电泳成像结果

经凝胶电泳后，从成像结果可观察到DNAMarker5000、质粒DNA、酶切产物与PCR产物与发生迁移并各自形成相应条带：

①PCR产物形成的条带大致位于500bp左右的位置。

②酶切产物条带可观察到位于3000bp左右位置的酶切长片段，并隐约可见处于500bp位置附近的酶切小片段。

酶切小片段成像不明显，原因可能是：

上样的时间过长，样本发生溶解扩散，使质粒量减少；点样时，等待时间过久，样品可能在凝胶中扩散；吹打液体时，部分液体可能因为过于激烈而扩散。

③质粒DNA中出现三条带，分别对应超螺旋质粒DNA、线性DNA和开环状质粒DNA。

这三种不同构型的分子有不同的迁移率，在一般情况下，迁移速度最快的为超螺旋型，其次为线性分子，最慢的为开环状分子，所以条带从下到上分别为：

超螺旋型DNA、线性分子、开环状分子。

其中线性质粒DNA的条带亮度最大，表明其含量最高；而超螺旋质粒DNA亮度较小，含量较低。

（三）思考题：

1.碱法提质粒中溶液I、II、III的作用？

答：

溶液I：

螯合金属离子，抑制脱氧核酸酶对DNA的降解作用；有利于溶酶体的作用。

溶液II：

细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。

溶液III：

酸性条件下质粒DNA复性，变性蛋白-SDS+线性DNA沉淀，Na+可中和DNA。

2.结合实验情况，如何提高限制性酶切的反应效率？

答：

①尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶。

②酶量的选择任何时候2种酶的总量不能超过反应体系的1/10体积，而且最大反应体系最好不要小于20ul，且酶切反应中甘油浓度应低于5%。

③保证底物DNA的纯度：

主要污染DNA的某些物质，如酚、氯仿、乙醇等均能抑制酶反应应尽量纯化底物。

④反应系统：

主要是反应缓冲液中的离子强度,如NaCl和Mg2+,合适离子强度可以激发酶切反应。