质粒DNA测定实验报告.docx

1、质粒DNA测定实验报告生物化学实验报告姓 名： 学 号： 专业年级： 组 别： 生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称实验日期实验地点合作者指导老师评分教师签名批改日期格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用Times New Roman；标题用：四号，黑体，加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出现多行、多页空白现象。一、实验目的1.掌握PCR基因扩增的原理和操作方法2.掌握碱裂解法提取质粒的方法 3.了解紫外吸收法检测DNA浓度与纯度的原理、方法 4.学习水平式琼脂糖凝胶电泳操作二、实验原理1.PCR(多聚酶链式反应) 在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特

2、定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤， 在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。 PCR一次循环的具体反应步骤为：A.变性：加热反应系统至95，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链 。 B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（3570,一般低于模板Tm值的5左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。 C.延伸：溶液反应温度升至中温72，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。 2.质粒DNA的提取与制备(1)碱裂解法：染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异：A.

3、高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性；B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。(2)离心层析柱：A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。3.质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）：A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱:DNA分对波长26

4、0nm的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰C.A260/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度；A260/A280=1.8 DNA纯净A260/A2801.8 含RNA杂质，用RNA酶去除。4.质粒DNA的酶切鉴定：限制性内切酶是DNA重组操作过程中所使用的基本工具。限制性内切酶能特异性地与一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列结合，或是与其附近的特异位点结合，并在结合位点切割双链DNA。 5.琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DN

5、A分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应：不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系).三、材料与方法：以流程图示意（一）实验材料：1.PCR仪器：PCR仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管材料：菌液：大肠杆菌DH5a菌株(含靶基因CHD5片段的pMD18-T)、无菌去离子水、2Premix Taq、引物2. 质粒DNA的提取与制备仪器：恒温培养箱、台式离心机、离心层析柱、Eppendorf管、微量加样枪、离心管材料：溶液 P1（S1）、溶液P2

6、(S2）、溶液P3（S3）、去蛋白液PE（W1）、漂洗液WB（W2）、洗脱液EB（Eluent)、含pMD19-T质粒的大肠杆菌DH53. 质粒DNA的定量（紫外分光光度法）仪器：比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪材料：蒸馏水、质粒4.质粒DNA的酶切鉴定仪器：1.5ml的EP管、微量加样枪材料：无菌水、10M酶切缓冲液Buf R、质粒DNA、Hind III (15U/ul)、EcoR I(12U/ul)5.琼脂糖凝胶电泳仪器：凝胶电泳系统、凝胶成像系统材料：电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNA Marker 5000、电泳缓冲液（2）实验方法：1.实验流程：简述实验内容流程，

7、PCR操作步骤煮菌，PCR（PCR程序最后设4保温）PCR仪运行约2小时学习PCR原理、质粒DNA提取和酶切原理质粒DNA提取（约1小时）酶切操作保温约12小时学习紫外检测定量原理、琼脂糖电泳原理紫外检测定量电泳上样（样品：质粒DNA，PCR产物，酶切产物，Marker）电泳仪运行约30分钟观察电泳结果、记录、拍照、保存2.实验步骤1）PCR反应菌体煮沸10分钟，冷冻，室温下解冻后离心，取上清液。取PCR反应管，用加样枪加入下列各试剂。 试剂 体积灭菌去离子水 4.5ul2*Premix Tap 12.5ul引物1-SO100 (10 mol/L) 1.5ul引物2-SO101 (10 mol

8、/L) 1.5ul菌液 5ul总体积 25ul注意：如配好的反应液较多沾到管壁上，可将PCR反应管置台式离心机中瞬时离心，使反应液集中于管底，然后将反应管放到基因扩增仪(PCR仪)上 。按照以下顺序操作PCR仪进行基因扩增、94预变性5分钟后开始以下循环；、94、30 秒；、 55 、30 秒 ； 、72 1 分钟；、25个循环、72 5 分钟；、4 保温。实验过程约1小时30分钟.2）质粒DNA提取与定量：步骤操作流程取1.5ml培养物加入Eppendorf管中13000rpm离心1min，弃上清液加入250l溶液S1，吹打，使细菌沉淀分散，彻底悬浮加入250l溶液S2，颠倒46次混匀（不要

9、剧烈振荡），直到溶液变得清亮加入350l 溶液S3，立即温和混匀68次。13000rpm离心10min，小心取上清液（700l ）。将吸附柱放于收集管中，将上一步所得上清液加入吸附柱中，13000rpm离心3min，弃滤液。加入500l去蛋白液W1，13000rpm离心1min，弃滤液向吸附柱中加入700l 漂洗液W2， 13000rpm离心1min ，弃滤液重复步骤8一次空柱13000rpm离心1min，然后开盖室温放置3min，使残留乙醇挥发11取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加30l洗脱缓冲液(Eluent)，室温放置1min，13000rpm离心1min洗脱质粒DNA

10、， 保留备用。紫外光吸收法定量检测3）酶切鉴定在一个洁净的1.5mlEP管中按顺序依次加入下述试剂试剂名称体积(l)无菌水9.010M酶切缓冲液2.0质粒DNA7.0(约500ng)HindIII(15U/ul)1.0EcoRI(12U/ul)1.0总体积20.0移液枪轻轻混匀(避免产生气泡),37 水浴1.5h4）琼脂糖凝胶电泳电压：80120V 时间：1530分钟注意事项：1倒胶时把握好胶的温度，不要高于60 ，否则温度太高会使制板变形2胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔3电泳前，确认样品孔位于电场负极；4点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，缓冲液不要太多5Gel

11、dview有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔6紫外线照射不要太久上样每组加3个样品孔，记住位置第一孔：9l质粒DNA与1l 6loading buffer混匀后上样第二孔：9l酶切产物与1l 6loading buffer混匀后上样第三孔：10l PCR产物直接上样四、结果与讨论：结果：实验数据、现象、图谱；讨论：以结果为基础的逻辑推论，并得出结论。(一)实验结果：1.PCR反应：溶液体系完成经过PCR扩增后，得到的PCR反应管内溶液呈绿色。2.质粒DNA提取与定量：培养物在EP管中呈白色，加入溶液S1后细菌沉淀分散，加入溶液S2混匀后溶液变得清亮，再加入溶液S3，管内出现白色絮状沉

12、淀，加漂洗液W2后，经离心分离出无色透明的上清液与底层的白色沉淀。紫外光吸收法定量检测测量次数质粒DNA浓度 (g/ml)Ratio值 (A260/A280)87.01.7381.11.8178.21.78平均值82.11.773.酶切鉴定：经酶切37 水浴1.5h后得到无色透明溶液。4.琼脂糖凝胶电泳：我们小组是10、11、12（2）讨论1.A260/A280的比值可以反应DNA的纯度A260/A280=1.6-1.9 DNA样品较纯,符合实验要求A260/A2801.9 RNA污染本实验中A260/A280=1.77 说明DNA样品基本较纯,符合实验要求。2.琼脂糖凝胶电泳成像结果经凝胶电

13、泳后，从成像结果可观察到DNA Marker 5000、质粒DNA、酶切产物与PCR产物与发生迁移并各自形成相应条带：PCR产物形成的条带大致位于500bp左右的位置。酶切产物条带可观察到位于3000bp左右位置的酶切长片段，并隐约可见处于500bp位置附近的酶切小片段。酶切小片段成像不明显，原因可能是：上样的时间过长，样本发生溶解扩散，使质粒量减少；点样时，等待时间过久，样品可能在凝胶中扩散；吹打液体时，部分液体可能因为过于激烈而扩散。质粒DNA中出现三条带，分别对应超螺旋质粒DNA、线性DNA和开环状质粒DNA。这三种不同构型的分子有不同的迁移率，在一般情况下，迁移速度最快的为超螺旋型，其

14、次为线性分子，最慢的为开环状分子，所以条带从下到上分别为：超螺旋型DNA、线性分子、开环状分子。其中线性质粒DNA的条带亮度最大，表明其含量最高；而超螺旋质粒DNA亮度较小，含量较低。（三）思考题：1.碱法提质粒中溶液I、II、III的作用？答：溶液I：螯合金属离子，抑制脱氧核酸酶对DNA的降解作用；有利于溶酶体的作用。溶液II：细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。溶液III：酸性条件下质粒DNA复性，变性蛋白-SDS+线性DNA沉淀，Na+可中和DNA。2.结合实验情况，如何提高限制性酶切的反应效率？答：尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶。酶量的选择任何时候2种酶的总量不能超过反应体系的1/10体积，而且最大反应体系最好不要小于20 ul，且酶切反应中甘油浓度应低于5%。保证底物DNA的纯度：主要污染DNA 的某些物质，如酚、氯仿、乙醇等均能抑制酶反应应尽量纯化底物。反应系统：主要是反应缓冲液中的离子强度,如NaCl和Mg2+, 合适离子强度可以激发酶切反应。