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诱导性多潜能干细胞

诱导性多潜能干细胞（iPS）研究:

现状与展望

通过特定的基因组合与转染可以将已分化的体细胞诱导重编程为多潜能干细胞（iPS）,是近年来干细胞研究领域最令人瞩目的一项新的干细胞制造技术。

与胚胎干细胞（ES）不同,iPS细胞的制造不需要毁损胚胎,因而不会涉及更多的伦理学问题。

iPS的出现不仅为体细胞重编程去分化机制的研究注入了新的活力,而且为疾病发生发展相关机制研究与特异的细胞治疗,特别是再生医学带来新的曙光。

目前,iPS的研究尚处于初级阶段,文章就iPS的研究现状与应用前景进行综述和展望。

2006年,日本Yamanaka研究小组通过将逆转录病毒介导的Oct-4,Sox2,Klf4及c-Myc四个基因转入鼠成纤维母细胞,将成体细胞重编程为具有多分化潜能的干细胞,并将该类干细胞命名为iPS细胞[1]。

2007年,美国Thomson实验室报道了Oct-4,Sox2,Nanog及Lin28四个基因的转染可将人成纤维母细胞重编程为iPS细胞[2]。

随后,国内外多家实验室利用转基因方法完成了多种类型成体细胞向iPS细胞的重编程与iPS细胞向特定组织类型细胞的再分化研究。

iPS细胞在形态学、表观遗传学、全基因表达谱以及细胞类型特异的分化潜能方面与ES细胞极其相似,并且个体特异来源的iPS细胞尚不涉及免疫排斥问题,所以iPS具备成为细胞治疗以及组织器官再生最有前景的种子细胞。

研究表明,一些遗传缺陷性疾病患者的体细胞也可通过转基因方法重编程为iPS细胞,这将对通过体外细胞培养研究某些遗传疾病的发病机制提供了希望。

与其他多潜能细胞产生技术不同（如来源于内细胞团的ES分离建系、体细胞与ES细胞融合以及核移植技术）,iPS细胞的生成技术不涉及胚胎毁损等伦理学问题,因而将成为干细胞研究与再生医学研究领域的热点话题。

但目前为止,iPS的研究可以说才刚刚起步,一些重要的科学问题与关键技术问题还没有完全解决,iPS走向临床应用为时尚早。

文章就iPS研究的现状与今后发展的方向进行综述与展望。

2iPS细胞的形成与特征分析

2.1iPS与ES细胞的比较及体细胞重编程为iPS的机制

成体细胞通过去分化途径重编程为iPS细胞是一个缓慢的过程,需要2~4周的时间。

重编程过程中,细胞依次发生以下等级性的分子事件,首先是碱性磷酸酶活性的激活,其次是成体细胞特异基因表达的静息,SSEA-1表达,最后是导入的逆转录或慢病毒基因的沉默与内源性Oct-4和Nanog等多潜能因子的激活。

依据功能及分子表型特征,iPS细胞可分为两种,部分全能的iPS细胞与全能iPS细胞,Oct-4等重编程因子转导只能使少数成体细胞成为全能iPS细胞（0.01%~0.1%）。

以Fbx15全能相关转录因子的激活作为筛选标记,通过逆转录病毒介导的重编程因子转染,Yamanaka研究组将鼠成纤维母细胞去分化重编程为iPS细胞,尽管该筛选方法获得的iPS细胞克隆在形态上具有ES细胞克隆的特点,表达ES细胞特征性分子标记,并可形成畸胎瘤,体外培养形成拟胚体,出现三胚层分化的分子标记,iPS注射入胚细胞团后也参与胚胎发育,但该方法获得的iPS细胞克隆在全基因表达谱与多潜能转录因子DNA甲基化谱方面与ES细胞还存在较大的差异,另外,也不能形成嵌合小鼠与生殖细胞[1]。

相反,当采用Oct-4或Nanog基因激活系统进行筛选时,便可以获得全能的iPS细胞,除形态特征、多能干细胞的分子标记表达与ES细胞几乎一样之外,其全基因表达谱以及DNA甲基化谱也与ES细胞几乎一致。

在功能上,全能iPS细胞与ES细胞几乎对等,不仅参与胚胎发育,而且可以形成嵌合体小鼠,并传递到生殖细胞[3,4]。

在没有选择标记与选择压力条件下,依据ES细胞克隆形态学特征标准选择iPS克隆,并将其继续在标准的ES培养体系中培养,可以将小鼠体细胞起源的部分全能iPS细胞进一步重编程为全能iPS细胞[5]。

人iPS细胞缺乏基因敲入的筛选标记,所以目前判断人体细胞起源的iPS细胞是否具有全能性主要是依据iPS克隆是否具有ES细胞克隆的形态学特点,是否具有ES细胞的多能干细胞分子标记及类似于ES细胞的全基因组表达谱,形成拟胚体能力及三胚层的分化特征,注射免疫缺陷鼠后生成畸胎瘤的能力,但更重要的证据是是否有内源性重编程转录因子的激活（如Oct-4与Nanog等）与导入的病毒基因的沉默[6]。

重编程因子只能诱导少数的体细胞通过中间状态的部分全能iPS细胞,再到全能iPS细胞,属于随机发生事件,而该事件依赖于体细胞中Oct-4等干性转录因子随机发生的/渗漏表达0与随机性的表观遗传学变化[7,8]。

MacArthur等通过计算机模拟分析后认为,重编程因子可能只诱导有Oct-4等干性因子/转录噪音0的体细胞重编程为iPS细胞[7]。

利用鼠成纤维母细胞与B细胞重编程获得的部分全能iPS细胞及全能iPS细胞,Mikkelsen等比较了它们与起源细胞及ES细胞之间在全基因表达谱、染色质状态谱（组蛋白H3K4me3和K27me3与DNA结合状态）和DNA甲基化谱之间的差异,发现全能iPS与ES细胞的基因表达及表观遗传学状态高度相似,而部分重编程iPS细胞则显示了不同类型的干细胞相关基因的再激活、系列特异性转录因子则处于不完全的抑制状态。

另外,全能相关转录因子位点的DNA处于高甲基化状态。

抑制部分全能iPS细胞中系列特异转录因子的表达水平不能有效提高其形成全能iPS细胞的能力,但DNA甲基化抑制性药物5-azaC处理部分全能iPS细胞可以将其继续重编程形成全能iPS细胞的能力提高近200倍[8]。

体细胞重编程为iPS需要足够的起始动力克服系列特异性分化因子表达环境形成的阻力,从而逐步地将细胞内环境塑造成为多潜能转录因子维持的干性环境。

Yamanaka研究组与Thomson实验室通过设计精巧的筛选[1,2],确定了6个重编程因子,近期大量的研究结果提示了6个因子中的Nanog,Sox2或Klf4与c-Myc并非体细胞重编程为iPS细胞绝对所必需,而Oct-4与Sox2或Klf4的组合式外源转染对启动体细胞重编程、塑造多能干性环境则是必需的。

能否通过特异或非特异的非转基因方法较持久的激活体细胞中内源性的Oct-4与Sox2表达对诱导安全有效的形成iPS具有重要的意义。

研究表明蛋白酶体在ES细胞中具有清除分化相关转录因子的转录起始复合体并减灭其/转录噪音0的重要作用[9],而Wnt信号途径也具有过滤分化相关蛋白转录噪音的作用[10],所以是否可以通过增加体细胞中蛋白酶体的表达量与激活Wnt信号活性的非转基因方法制造iPS细胞是非常值得探索的课题。

目前,体细胞重编程为多潜能干细胞的分子机制尚不完全清楚,iPS的形成过程为深入研究该机制提供了很好的细胞模型,该分子机制的阐明与涉及的信号通路的识别将为更安全和更有效地制造iPS以及为临床治疗提供坚实的理论基础。

设想通过改变细胞的外环境,可以将随机**件改造为必然**件,不仅可以增加iPS的形成效率,而且可能实现通过非转基因途径诱导iPS形成以及将来方便的临床应用。

2.2体细胞重编程为iPS的效率与非转基因方法制造iPS细胞的可行性评估体细胞重编程效率与效能,将为利用少量病人特异的细胞制造iPS细胞提供依据。

目前已证实逆转录病毒（包括慢病毒）介导的Oct-4等4个因子共同转染,几乎可以将各种类型的体细胞重编程为iPS细胞,包括成纤维母细胞、肝细胞、胃上皮细胞、胰腺细胞、脑膜、神经前体细胞、肾上腺、肌肉细胞、小肠上皮、间充质干细胞、表皮干细胞、造血细胞以及终末分化的B细胞等,但不同组织类型的体细胞重编程为iPS对外源基因诱导水平的要求有差别,其形成iPS的效率及效能也不一样。

从鼠或人多种组织类型中分离的成纤维母细胞重编成为iPS的效率一般只有0.007%~0.039%,形成全能iPS细胞的时间在3~4周之间,外源的重编成因子需要10~16d的表达,而内源性全能干细胞转录因子一般在12d时被激活[1,2,11]。

通过6个重编程因子共转染成纤维母细胞可将其iPS重编程效率提高约10倍[12],而抑制p53表达或共转UTF1基因可使其重编程效率增加100倍[13]。

肝细胞的重编程中外源基因的转入量只需要成纤维母细胞的1/50[14]。

鼠神经干细胞表达足够的Sox-2,Klf4与c-Myc,因而在重编程形成iPS细胞时只需要导入Oct-4与Sox2或Klf4两个基因即可[15,16]。

从mRNA水平可以检测到人角质层起源的表皮干细胞中表达Klf4与c-Myc,Oct4,Sox2以及Klf4三个基因导入可以诱导iPS形成,其效率与效能与成纤维母细胞类似,但四个因子可以将表皮干细胞形成iPS的效率增加100倍,并使其形成周期缩短至10d,病毒基因的随机整合位点也明显少于成纤维母细胞[17]。

将一个30岁妇女的一根头发培养后,Aasen等将从发根鞘部位生发的角质层表皮干样细胞通过四个重编成因子导入的方法诱导成iPS细胞[17],这一结果令人叹服,因为他正将我国5西游记6小说中描述的孙悟空拔根毫毛变出一个小猴子的神话故事变成现实。

与上述细胞类型不同,因为存在基因组DNA的缺失与重排,单纯四个因子转导并不能有效地将终末分化的B细胞重编程为iPS细胞,另外还需要导入髓系转录因子C/EBP或抑制B细胞转录因子Pax5[18]。

综合以上已有报道的结果,笔者认为以表皮干细胞为原始材料高效高能的制造iPS细胞应具有很好的临床应用前景。

逆转录或慢病毒介导的重编程因子转染体细胞,存在随机的多位点的基因组DNA整合,另外,Klf4与c-Myc具有癌基因活性。

事实证明,病毒介导的c-Myc的再次激活增加了iPS起源嵌合鼠发生肿瘤的机会[4,19]。

因此,寻找新的通过转基因,限制性转基因,甚至是非转基因的方法诱导iPS形成对将iPS推向临床应用非常重要。

近期有报道显示,除逆转录病毒外,通过非基因组整合的腺病毒介导的重编程因子或质粒DNA瞬时转染也可使体细胞转变为iPS细胞[14,20],这一结果不仅消除了由于外源基因在靶细胞基因组中插入突变形成iPS细胞的疑虑,而且为建立新的安全性更高的基因导入系统的研究奠定了基础。

在限制性转基因制造iPS细胞的研究中,科学家们发现组蛋白去乙酰化转移酶抑制剂VPA不仅可将只有Oct-4与Sox2两个转录因子转染的成纤维母细胞诱导成iPS细胞,而且可以将其重编程率提高到1%[11]。

采用G9a组蛋白甲基转移酶抑制剂BIX-01294处理鼠神经干细胞,在只有Oct4与Klf4两个基因转染的条件下就能将其重编程为iPS细胞的效率达到相当于四个基因转染的重编程水平[20]。

与之相似,在只有Oct-4与Klf4两个外源因子转导条件下,加入MEK通路抑制剂PD0325901,GSK3抑制剂CHIR99021及LIF培养,可以将神经细胞重编编程为真正的全能iPS细胞[21]。

Wnt3a处理的成纤维母细胞重编程为iPS细胞时只需要Oct-4/Sox2/Klf4,而不需要c-Myc基因的导入[22]。

BIX-01294及钙离子拮抗剂BayK8644处理时,可有效的将只有Oct-4及Sox2转染的成纤维母细胞重编程为iPS细胞[23]。

上述小分子化合物参与的体细胞重编程研究为采用非转基因方法诱导iPS的形成提供了一定可行性。

尽管目前还没有通过非转基因方法成功诱导体细胞重编程为iPS细胞的报道,但Durcova-Hills等发现利用组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA,FGF2,LIF及SCF刺激鼠胚胎生殖细胞可以使其去分化重编程为多能干细胞[24]。

另外,利用ES细胞提取物处理透化的NIH3T3细胞系可以使其去分化演变为具有多系列分化的多能干细胞[25],处理293T细胞可以使其表达部分全能干细胞特异的分子标记[26]。

这些事实不仅提示了体细胞重编程需要的动力因素,而且提示只要给成体细胞提供合理的体外培养环境,就完全有可能通过非转基因方法将成体细胞去分化重编程为全能干细胞）））iPS细胞,尤其是利用合适的成体干细胞作为重编程起始细胞,极有可能通过改变如图1所示的细胞信号途径在不远的将来完成非转基因方法的iPS细胞诱导。

笔者早在2001年就发现,已分化的表皮细胞在不同的人ES细胞系在特定系列方向的分化潜能方面存在显著的差异[29],长期保存与体外培养的人ES细胞存在染色体不稳定等问题[30]。

另外,ES细胞分化的特定组织中由于可能残存少量的未分化ES细胞,从而不能排除在组织移植后诱发畸胎瘤的风险。

对于疾病个体起源的人iPS细胞是否与人ES细胞一样也存在这样那样的问题与疑虑,在今后针对人iPS的研究中是需要明确回答的。

尽管如此,近期科学家利用iPS细胞进行的一些诱导分化与疾病治疗性研究工作的突破性进展依然值得关注,并为今后利用iPS的治疗性研究工作以及大规模建立个体特异性iPS细胞库的论证提供了强有力的科学依据。

镰刀型细胞贫血是血红蛋白链中单个氨基酸突变所引起的溶血性疾病,Hanna等通过转基因方法将具有该疾病小鼠的成纤维母细胞重编程为iPS细胞,再通过同源重组技术将iPS细胞中异常DNA序列进行置换,并将病毒源性c_Myc去除,获得正常基因型的iPS细胞,在特定的预设条件下,该方法产生的iPS细胞可定向分化成为造血前体细胞,移植给致死量照射处理后的小鼠,结果发现不仅重建了小鼠的造血系统,而且将红细胞形态由原先的镰刀状修正为圆盘状[31]。

另外,Dimos等利用一例营养不良性侧索硬化症老年妇女的皮肤成纤维母细胞诱导产生了iPS细胞,并继续将其成功诱导成为运动神经元[32],这一结果不仅为研究该疾病的进展提供体外模型,而且提示了iPS细胞在诸如该类退行性疾病中的治疗潜能。

在将iPS细胞诱导成为具有胰岛素分泌能力的细胞时,研究者们发现,不同iPS克隆存在差异,4个克隆中只有2个可以被诱导成功[33]。

这一结果提示进一步比较iPS细胞克隆间诱导分化潜能的差异,并鉴定其差异特征对未来利用iPS细胞进行有效的细胞治疗具有重要意义。

总之,将实验室培养的iPS细胞应用到临床治疗中还有相当长的路要走,其中最为重要的应是对不同组织来源、不同疾病个体来源的iPS细胞的诱导分化潜能及安全性进行重点评估。

4利用iPS细胞研究疾病发生的病理过程细胞培养是生物医学研究最基本的手段,是对通过动物模型进行人类疾病研究的必要补充。

iPS技术问世之前,很难想象在培养皿中对一些遗传性疾病或退行性疾病发展的病理学过程进行准确观察,而iPS技术的出现使这些不再是难事。

近期,Park等利用iPS技术成功建立了10种人类遗传性或退行性疾病起源的干细胞系,其中包括腺苷脱氨酶缺乏相关的重症联合免疫缺陷病（ADA-SCID）、亨廷顿病（HD）、帕金森病（PD）与青少年发生的I型糖尿病（JDM）等。

这些疾病特异的iPS细胞携带有疾病本身的遗传学缺陷,但可有效地正常化地向多种细胞类型进行分化[34]。

这些细胞系为在体外条件下比较正常与病理组织的形成提供了物质基础。

另外,也为疾病治疗药物的测试与筛选提供了细胞模型。

鉴于iPS在疾病研究中的重要作用与潜能,哈佛大学干细胞研究所在2008年启动了建立疾病特异iPS细胞库的计划,同样日本也在四所大学（京都大学、庆应大学、东京大学和理化研究所）成立了iPS细胞研究中心。

面对这些快速的发展,由于我国人口众多,具有极其丰富的疾病资源,针对我国特有的疾病人群建立疾病特异的iPS细胞库应尽快提到议事日程上来。

尤其对一些稀有的或特有的遗传性疾病,保存可以进行分化研究的细胞种子远远比保存DNA有价值的多。

同样,iPS技术对肿瘤发生机理的研究也将产生推动作用,可能体现在以下几个方面:

a.遗传学突变积累与表观遗传学异常是肿瘤发生与进展内在的因素。

将携带肿瘤易感基因或具有形成肿瘤倾向遗传背景的正常细胞重编程为iPS细胞,诱导再分化为特定组织类型的细胞,通过在培养皿中观察肿瘤的发生,鉴定关键的肿瘤内环境形成的抑制因素与促进因素。

b.既往通过核移植技术的研究结果显示,将肿瘤细胞本身重编程为干细胞具有相当的难度,即肿瘤细胞对重编程具有抵抗性[35],而iPS技术的出现为这一操作带来希望。

c.肿瘤细胞具有特定的遗传学背景,如果能通过iPS技术将其重编程为干细胞,将清除掉肿瘤特有的表观遗传学状态,通过诱导分化成对等的正常表现型细胞,比较性的研究在该遗传学背景条件下表观遗传学变化与肿瘤发生的关系。

d.近年肿瘤研究领域一个重要的突破是对肿瘤干细胞的识别与鉴定,然而目前仍不能高效地高纯度地对肿瘤干细胞进行体外扩增与长期培养,这样就障碍了对肿瘤干细胞生物学特有特征的分析,并使针对肿瘤干细胞的治疗性研究发展缓慢,如果能通过iPS技术将分化的处于短暂维持状态的肿瘤细胞重编程为肿瘤干细胞,将会给肿瘤研究领域带来巨大的发展机会[36]。

5结语

iPS技术策略问世之前人类不敢想象由一种体细胞到另外一种体细胞的演变,iPS的出现使这一设想变成现实,并使细胞治疗与再生医学领域的发展具有更为广阔的前景。

iPS技术使人类的视野与想象力得到拓展,为什么不考虑在不经过iPS阶段的情况下,利用转基因或非转基因的方法将一种来源方便的体细胞直接重编程为另一种体细胞,以直接用于人类疾病的治疗呢。

其实,这一话题并非遥不可及,已有体内研究证据表明通过特定转录因子的导入可以将胰腺外分泌细胞直接重编程为内分泌细胞[37]。

另外,许多低等动物组织或器官损伤后出现的再生也有类似的生物学过程。

因此,继续关注和深入研究iPS产生的理论与关键技术,将给正常发育模式的构建、肿瘤研究、组织修复与再生以及生物制药等诸多生物医学领域带来新的发展机会[38]。