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精品药物制剂论文
【关键字】精品
药物制剂论文
专业：
药物制剂
中文摘要…………………………………………………………………3
英文摘要…………………………………………………………………3
正文…………………………………………………………………3
前言…………………………………………………………………3
1仪器与试剂…………………………………………………………………4
2方法与结果…………………………………………………………………4
2.1对照品溶液的制备……………………………………………………4
2.2三草汤药液的制备……………………………………………………4
2.3最大吸收波长的确定……………………………………………………4
2.4标准曲线的绘制………………………………………………………5
2.5总黄酮含量的测定方法…………………………………………………6
2.6提取溶剂的选择………………………………………………………6
2.7提取工艺正交试验………………………………………………………7
2.8提取工艺的验证实验……………………………………………………9
3讨论…………………………………………………………………9
参考文献…………………………………………………………………9
致谢…………………………………………………………………11
正交设计法优选三草汤回流提取工艺
摘要目的：
考察复方三草汤的优选提取工艺。
方法：
以总黄酮的提取量为指标，用紫外-可见分光光度法测定其含量，采用正交试验对提取条件进行优选。
结果：
优选提取工艺条件为：
用10倍量60%浓度乙醇提取2次，PH=8,提取时间为1.5小时。
结论：
采用优选提取工艺条件所得三草汤中总黄酮含量较高，工艺稳定可行。
关键词正交设计；提取工艺；三草汤；总黄酮；紫外分光光度法
StudyonoptimizingrefluxingextractionforSancaotangbyorthogonaldesignmethod
ABSTRACT.Objective:
ToestablishacompoundSancaotangthebestextractionprocess.Methods:
Extractionoftotalflavonoidsofstudyindicators,byultraviolet-visiblespectrophotometricdeterminationofitscontent,theuseoforthogonalexperimentontheoptimizationofextractionconditions.Results:
Optimizationofextractionconditionswereasfollows:
with10timestheamountof60%ethanolextractof2,PH=8,extractiontimeis1hour.Conclusion:
OptimizationofextractionconditionsfromSancaotangwithahighleveloftotalflavonoids,thestabilityofaviableprocess.
KEYWORDS:
Orthogonaldesign;Extractionprocess;sancaotang;totalflavonoids;UVspectrophotometry
前言：
三草汤由鬼针草、车前草和白茅根三味药组成，为省人民医院协定处方，方中君药为鬼针草,其主要成分为黄酮类化合物[1],具有明显的清热解毒、活血化瘀功效，用于疟疾、腹泻、急性肾炎、胃痛、肠炎、咽喉肿痛、蛇虫咬伤等[2]。
本院主要用于蛇伤引起的肾毒性。
目前三草汤为汤剂，味苦且使用不便，若能将其剂型改变制备成胶囊剂则给患者带来很大的方便。
其提取工艺必不可少，在工艺研究中将药材用回流提取。
为优选提取工艺，本实验以总黄酮成分的提取量为考察指标，用紫外分光光度法测定其含量，以乙醇浓度、料液比、PH值、提取时间为影响因素[3-9]，进行提取工艺正交试验。
1仪器与试药
1.1仪器
98-I-B型电子调温电热套（天津市泰斯特仪器有限公司）
CPA225D型电子天平（德国赛多利斯股份公司）
TG328B型分析天平（上海天平仪器厂）
PB-10酸度计（德国赛多利斯股份公司）
TDL-40B型低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）
TU—1201型可见分光光度计（北京普析通用）
1.1试药
车前草（产地：
安徽批号：
毫州市毫广中药有限公司出厂）
鬼针草（产地：
福建批号：
毫州市毫广中药有限公司出厂）
白茅根（产地：
安徽批号：
毫州市毫广中药有限公司出厂）
芦丁对照品（中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用）
亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均、95%乙醇为分析纯
2方法与结果：
2.1对照品溶液的制备
精密称取芦丁20.2mg，用60％的乙醇溶解并稀释至100ml,制成每1ml含0.202mg的对照品溶液。
2.2三草汤药液的制备
精密称取鬼针草、车前草、白茅根共,混合均匀，共9份，按因素水平表（见表1）和正交实验L9（34）表（见表2）的实验条件提取，将制得的每份药液浓缩至360ml即得待测液。
2.3最大吸收波长的确定
根据文献三草汤总黄酮的含量测定方法采用亚硝酸钠-硝酸铝,在碱性条件下显色后测定的方法,测定其总黄酮含量[10],根据文献方法[9],以芦丁为对照品,在400-700区间内,对显色后的溶液在进行了扫描,结果显示,芦丁与三草汤总黄酮在510nm左右均有一稳定的吸收峰,结果见图1。
AB
图1：
图谱扫描A.芦丁；B.样品
2.4标准曲线的绘制
准确吸取芦丁标准溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00ml、6.00ml至25ml容量瓶中，加入30％乙醇溶液至6ml，各加5％亚硝酸钠溶液1.0ml，振摇后放置6min，加入10％硝酸铝溶液1.0ml摇匀后放置6min，加4％氢氧化钠溶液10ml，用30％乙醇定容至刻度。
摇匀，放置30min，于510nm波长处测定吸光度，以零管为空白，以芦丁含量（C）为横坐标，以吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线。
经计算标准曲线回归方程为A=-0.0405，相关系数R为0.9994。
表明对照品质量浓度在0.00808-0.0485mg/ml之间，吸收度与对照品浓度呈良好的线性关系。
结果见表1。
表1各浓度的吸光度值
序号
吸光度A
浓度C（mg/ml）
标准曲线
1
0.061
0.00808
2
0.154
0.0162
3
0.241
0.0242
y=12.051x-0.0405
4
0.358
0.0324
r=0.9994
5
0.443
0.0404
6
0.546
0.0485
图2标准曲线
2.5总黄酮含量的测定方法
分别精密吸取2.2中各样品溶液3ml分别置10ml容量瓶中用30％乙醇定容，摇匀。
再精密吸取1ml此溶液置25ml容量瓶中，加入30％乙醇溶液至6ml，各加5％亚硝酸钠溶液1.0ml，振摇后放置6min，加入10％硝酸铝溶液1.0ml摇匀后放置6min，加4％氢氧化钠溶液10ml，用30％乙醇定容至刻度。
摇匀，放置30min，于510nm波长处测定吸光度（样液如有沉淀，应过滤后测定）。
2.6提取溶剂的选择
2.6.1水提取法精密称取鬼针草、车前草、白茅根共120g,混合均匀，加水浸泡30min后，加热回流提取1h,趁热过滤，共提取2次，合并滤液，浓缩至360ml，待用。
2.6.2醇提取法精密称取鬼针草、车前草、白茅根共120g,混合均匀，加乙醇浸泡30min后，加热回流提取1h,趁热过滤，共提取2次，合并滤液，浓缩至360ml，待用。
2.6.3碱性醇提法精密称取鬼针草、车前草、白茅根共120g,混合均匀，加碱性醇溶液浸泡30min后，加热回流提取1h,趁热过滤，共提取2次，合并滤液，浓缩至360ml，待用。
2.6.4样品液总黄酮含量的测定分别精密量取上述样品液3ml至10ml容量瓶中，再从中吸取1ml至25ml容量瓶中，按标准曲线制备方法进行操作、显色，测定吸光度，由回归方程计算样品中总黄酮的百分含量。
结果见表2
表2提取溶剂与含量关系
提取方法
三草汤总黄酮含量%
水提取法
0.74
醇提取法
0.81
碱性醇提
0.92
由表2结果可见，碱性醇提法优于醇提取法和水提取法。
碱性醇提取法提取率最高，因此本实验选择碱性醇溶液作为实验提取溶剂。
2.7提取工艺正交试验
2.7.1正交实验表设计根据药材性质和生产实际要求，采用正交实验设计，均提取2次，选用乙醇浓度、料液比、PH值及提取时间4个因素，每个因素3个水平，编制因素水平表（表3）。
表3正交实验因素水平
水平
ABCD
乙醇浓度（%）
料液比（倍）
PH值
提取时间（h）
1
40
8
8
0.5
2
60
10
10
1.0
3
80
12
12
1.5
2.7.2正交试验结果根据标准工作曲线回归方程，求出相当于样品吸光度的芦丁含量，按下式求出总黄酮百分含量：
X=C*250/1000*100%
式中X为样品中总黄酮的百分含量；C为样品浓度（mg/ml）。
通过正交实验，结果见表4和表5。
表4L9（34）正交试验结果
实验号
A
乙醇浓度（%）
B
料液比（倍）
C
PH值
D
提取时间（h）
总黄酮百分含量（%）
1
40
8
8
0.5
0.85
2
40
10
10
1
0.80
3
40
12
12
1.5
0.63
4
60
8
10
1.5
0.89
5
60
10
12
0.5
0.85
6
60
12
8
1
0.93
7
80
8
12
1
0.81
8
80
10
8
1.5
1.11
9
80
12
10
0.5
0.77
Ⅰ总
2.28
2.55
2.89
2.47
Ⅱ总
2.67
2.76
2.46
2.54
Ⅲ总
2.69
2.33
2.29
2.63
SS总
0.035622
0.030822
0.063756
0.004289
R
0.41
0.43
0.6
0.16
查F分布临界值表：
F0.10（2,2）=9.00F0.05（2,2）=19.00
表5总黄酮方差分析
方差来源
离均差平方和
自由度
F比
显著性P
A
0.035622
2
8.30551
B
0.030822
2
7.186368
C
0.063756
2
14.86493
*
D
0.004289
2
1.000
误差
注：
“*”为有显著意义
2.7.3结论从三草汤的回流提取正交实验数据分析的结果可以看出，三草汤回流提取时，各个因素对三草汤提取效果的影响程度不同，各因素的影响程度依次为C>B>A>D,且对提取效果影响有统计学意义的因素是溶液的PH值C。
综合直观分析和方差分析的结果，结合生产中的实际情况，再考虑节省时间，节约能源和降低成本等因素，因此三草汤总黄酮较理想的提取工艺方案是A2B2C1D3,即用10倍量60%浓度乙醇在PH为8的条件下回流提取2次，每次1.5小时。
2.8提取工艺的验证实验
为进一步考察上述优选工艺的稳定性和合理性，按该工艺进行重复实验3次，分别测定三草汤总黄酮的含量，结果见表6。
测定的结果均优于正交实验的任何一组，重现性好，说明该工艺稳定可行。
表6工艺验证实验结果
试验号样品名
总黄酮含量（%）平均值（%）
1A2B2C1D2
1.13
2A2B2C1D2
1.201.16
6A2B2C1D2
1.15
n=3
3讨论
3.1由于芦丁和黄酮类化合物均是以2-苯基色原酮为母核的结构，具有相同的吸光度测试性质，均于510nm处有最大吸收峰，所以采用芦丁为对照品测定三草汤中总黄酮的含量。
3.2在正交实验中，从总黄酮这一指标来看，因素C的影响最大，差异最为显著，所以选择PH为8，故通过正交实验结果得出三草汤的优选提取工艺为10倍量60%浓度乙醇在PH为8条件下提取2次，1.5h/次。
并在正交实验基础上进行了验证实验，结果表明该提取工艺稳定可行，操作简便，适合于工业化生产。
参考文献:
[1]赵燕,赵莹,王绪成.鬼针草的化学成分和药理作用研究进展[J].中国药房.2007,18（15）:
1189-1190
[2]曹东梅，崔文萍，张东杰.鬼针草中黄酮类化合物提取方法研究[J].黑龙江八一农垦大学学报,2004,16
（2）:
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[3]钟明媚,陈飞虎,袁丽萍等.正交设计法优选鬼针草中总黄酮的提取工艺研究（醇）[J]
时珍国医国药,2006,17（12）:
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[4]高中宋,彭密军等.车前草中总黄酮的提取研究[1][J].现代农业科技.2006:
31-32.
[5]鲁建江,刘志勇,王莉等.车前草中总黄酮的微波提取及含量测定[J].中医药学报,2002,30
（1）:
34-35.
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[7]叶文峰.杜仲叶总黄酮最佳提取工艺条件的研究[J].宜春学院学报,2002,24（4）:
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[8]江德安,肖前青.乙醇+NaOH提取银杏叶黄酮方法的研究[J].林业科技,2005,30（6）:
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[9]夏勤,姚仲青，高运军.正交设计法优选鬼针草总黄酮的提取工艺[J].中国医院药学杂志,2007,27（6）:
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[10]赵健，王春根，于立红，等.江苏不同产地鬼针草类中药总黄酮含量比较[J].江苏中医，1996，17（11）:
34-35.
致谢
本课题是在我的导师何丽君老师的悉心指导下完成的。
导师无论是在课题设计还是在科研思路上都给予了我极大的帮助。
忠心的感谢实习单位福建省人民医院药剂科在实习期间给我们提供了良好的实习环境；感谢实习单位领导在实习期间对我们生活和学习上的帮助；感谢何丽君老师以其丰富的经验和认真的工作态度指导我的学习和工作，不仅巩固了我的专业知识，并且使我的操作技术更加熟练；同时对于制剂室、西药房各个主任和老师以及药学系的各位领导对我实习工作的大力支持和帮助表示感谢。
学生：
林娟
2009年5月20日
附录
黄酮类化合物药理作用的研究
黄酮类化合物是一类低分子天然植物成分,广泛存在于蔬菜、水果、牧草和药用植物（包括中药与民族药中）。
是植物在长期自然选择过程中产生的一些次级代谢产物。
许多植物的叶、皮、根、和果实中都含有一定量的黄酮类化合物，它们是一类以2-苯基色原酮为母核的多酚化合物（ployphenoliccompounds）,结构中含有酮基，天然黄酮类化合物一般为金黄色或淡黄色，故称之。
最初，这类物质的粗制品仅作为染料使用，20世纪20年代，国外把槲皮素、芦丁用于临床后，才引起人们的关注。
60年代末，人们发现黄酮类化合物有抗炎、抗病毒、利胆、强心、镇静和镇痛等作用。
到70年代，又发现他们有抗氧化、抗衰老、免疫调节和抗肿瘤等作用[1]。
本文将对近年来对黄酮类化合物药理作用的研究状况作一综述。
1.黄酮类化合物的抗炎、解热作用
范丽报告[2]，黄蜀葵花总黄酮200、100、50mg．kg-1能有效减轻二甲苯所致小鼠耳片肿胀，50mg．kg-1可明显抑制大鼠皮下埋植棉球所致肉芽组织形成，并不同程度地降低皮下注射（sc）松节油或静脉注射（iv）大肠杆菌液诱发的家兔体温升高，具有良好的抗炎、解热作用。
姜科植物Boesenbergiapandurata中14个黄酮化合物以及银杏双黄酮如阿曼托黄素、银杏黄素、紫杉双黄酮也有不同程度的抗炎活性[3]。
淫羊藿总黄酮对巴豆油所致小鼠耳肿胀、醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增加、角叉菜所致大鼠足肿胀及巴豆油所致肉芽组织增生具有显著抑制作用，对佐剂性关节炎大鼠的原发性和继发性足肿胀均有显著的抑制作用[4]。
石新兰等[5]发现甘草类黄酮和维生E一样，能不同程度上抑制小鼠肺泡Arthus血管炎的发生，认为甘草类黄酮的抗氧化作用通过抑制补体-PMN-ROS正反馈活化环控制炎症应答。
2.黄酮类化合物的抗菌、抗病毒作用
2.1黄芩中黄酮类化合物具有广谱的抗菌作用[5]。
刘云波等[6]用K-B纸扩散法对黄芩体外抗菌作用进行了研究，结果表明，黄芩浸出液的纸片对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、绿脓杆菌、乙型链球菌均有明显的抑制作用。
周玉珍等[7]研究了黄芩醇溶性部分和水溶性部分的抗真菌作用，发现黄芩的醇溶性部分对Tr的抑制作用较强，对其他供试菌种抑制作用则较弱；其水溶性部分对Tr,Tg,Ef,Cn和Ca等5种供试菌种均有较强抑制作用；同时证明黄芩的有效成分主要存在于其水溶性部分。
未经乙醇处理，直接用稀醋酸提取的黄芩药液，对多种致病性真菌均有抑制作用,并与黄精有一定的协同作用。
甘草黄酮类化合物中抗菌成分较多，其黄酮单体化合物查儿酮A、查儿酮B、光果烯、光果定等对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、白色念珠等均有抑制作用,还对毛霉、黑曲霉均有抑制作用[8]。
2.2黄酮类化合物还有抗病毒作用。
黄芩甙与黄芩素对人免疫缺陷病毒（HIV）逆转录酶的活性有抑制作用，并观察到黄芩甙在H9细胞培养中能抑制HIV-1的复制。
赵晶的进一步研究发现，黄芩素抑制HIV-RT活性较黄芩甙强。
黄芩素是一种强的鼠白血病病毒（MLV）和人免疫缺失病毒（HIV）逆转录酶活性的抑制剂。
黄芩中的异黄芩素-8-甲醚能显著抑制流感病毒[9]。
芦丁黄酮类化合物具有抗流感病毒、脊髓灰质炎病毒的感染和复制能力[10]。
3.黄酮类化合物的抗衰老作用
黄酮类化合物还有抗衰老的作用，作用机制主要与抗氧化作用有关。
随年龄增长，体内自由基增多，自由基在体内可直接或间接地发挥强氧化剂作用而与机体内核酸,核蛋白和脂肪酸相结合,转变成氧化物或过氧化物使之丧失活性或变性，细胞功能发生障碍，引起机体逐渐衰老或病变，而黄酮类化合物有很强的抗氧化作用,可以通过抑制和清除自由基和活性氧来避免氧化损伤。
已有实验证明多种黄酮类化合物具有抗衰老的作用。
淫羊藿总黄酮对老年大鼠神经内分泌有调节作用,能明显增加老年大鼠下丘脑和皮质中内啡肽的含量，增加雄性老年大鼠血清中促性腺激素和睾酮的含量，并增加细胞的活性证实淫羊藿总黄酮提高神经内分泌系统的整体功能而抗衰老[11]。
潘国庆等[12]对黄酮类化合物结构与抗氧活性关系做了研究得出黄酮类化合物抗氧化作用是通过酚羟基与自由基反应形成稳定的半醌式自由基结构；酚羟基是黄酮类化合物抗氧化作用的主要活性基因；B环是黄酮类化合物抗氧化清除自由基的主要活性部位，当该环存在邻酚羟基结构时，抗氧化活性极大增强。
由此，对黄酮类抗氧剂的结构修饰应侧重于B环邻位酚羟基或其前体化合物的构建，同时应增加邻位酚羟基的数目，使其抗氧化活性更高。
4．黄酮类化合物抗癌、抗肿瘤作用
癌的化学预防就是用化学药物抑制肿瘤的发生，或使肿瘤分化逆转，从而达到预防恶性肿瘤的目的。
已证实大量的化合物能抑制癌的发生，他们分别属于20多种化学结构，黄酮类化合物是近期研究较多的一种。
已经证实多种黄酮类化合物具有抗致癌作用。
芦丁，三黄素能抑制苯并芘对小鼠皮肤的致癌作用。
槲皮素和杨梅树皮素对苯并芘在Sencar小鼠表皮的代谢和苯并芘DNA加和物的形成有相同的抑制作用，对苯并芘和3-甲基胆蒽的致癌也有抑制作用。
黄酮类化合物发挥抗肿瘤活性时，均有A环与受体的负电荷中心结合、C环与受体的正电荷中心结合、其它部分通过氢键与受体发生作用的共性，因其苯环上取代基的不同而具有不同的抗肿瘤活性。
黄酮类化合物的抗肿瘤作用主要是通过诱导肿瘤细胞凋亡、促进抗肿瘤细胞增殖、干预肿瘤细胞信号转导、促进抑癌基因表达等途径来实现。
甘草查尔酮-A能抑制人乳腺癌细胞MCF-7和人白血病细胞HL-60生长，有诱导上述2种细胞株凋亡的作用[13]。
从松树皮提取得到的黄酮类化合物能诱导MCF-7细胞凋亡查尔酮可抑制蛋白激酶C（PKC）的活性，的活改变细胞蛋白质的磷酸化过程来抑制肿瘤细胞的生长。
黄芩苷能强烈抑制3种肝癌细胞株拓扑异构酶Ⅱ活性，且能抑制肝癌细胞增殖[14]。
5．黄酮类化合物对心血管系统的作用
5.1对抗心肌损伤的保护作用研究显示黄蜀葵花总黄酮对注射垂体后叶素的大鼠心电图T波升高有抑制作用[15]。
对冠状动脉结扎造成的心肌梗死大鼠,黄蜀葵花总黄酮能够显著抑制血清中PKC,LDH的升高,降低血清游离脂肪酸水平。
同时可降低急性心肌梗死大鼠的梗死面积,对小鼠心肌线粒体中的MDA的生成有抑制作用,也能提高SOD和GSHPx的活力。
提示黄蜀葵花总黄酮对心肌损伤有一定的保护作用,其作用机制可能部分在于对Mit的功能稳定及抗脂质过氧化,减少自由基生成相关。
5.2抗高血压、血管壁扩张作用有实验表明,淫羊藿总黄酮（TFC）对大鼠血清中内皮素有抑制作用,一氧化碳含量明显降低,提示TFC扩张血管,降低血压作用与阻断β受体及降低血浆内皮素含量有关[16]。
叶希韵等通过研究发现75%乙醇提取银杏叶总黄酮对肾性高血压大鼠及自发性高血压大鼠均有明显降压作用;妊娠高血压患者尿蛋白减少,NO含量及ET活性降低[17]。
5.3抗心率失常作用苦参总黄酮能明显对抗乌头碱、哇巴因及氯仿诱发的心率失常,其作用机制可能是阻断受体、阻滞心肌细胞钠-钾通道。
张莎莎等[18]将广枣总黄酮TFC作用于豚鼠右心室乳头肌,发现TFC使乳头肌的收缩力和收缩速率均减弱；给予TFC时,CaCl量效曲线右移,并呈较好的量效关系；TFC浓度为30.4mol.L时可明显延长右心室乳头肌的功能性不应期。
提示TFC可以浓度依赖性地阻滞细胞外Ca进入细胞内,具有拮抗作用。
5.4抗心绞痛作用有实验研究显示黄蜀葵花总黄酮（TFA）20,40,80mg.kg-1显著延长夹闭显著延长夹闭气管后小鼠心电图的时间和断头后喘息时间,并呈量效关系,在20-80mg.kg-1范围内,TFA显著降低心脑组织中MDA和NO含量。
6.黄酮类化合物对血小板的作用
近年来以冠脉血栓和脑血栓为主的血栓栓塞性疾病的发病率呈上升趋势,严重危害人类的健康。
血小板的粘附、聚集、释放反应可导致血栓形成、动脉粥样硬化等心脑血管疾病。
朱卫江等[19]通过对草棉花总黄酮对血小板聚集功能及对大鼠脑血栓形成的影响的研究，采用比浊法测定血小板聚集功能,放免法测定血浆中TXB2、6-keto-PGF1a的含量,经颈内动脉注射复合血栓诱导剂诱发大鼠右侧大脑半球内血栓形成,观察总黄酮对大鼠脑电图、脑重量、脑内伊文思蓝含量的影响和脑病理
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