暨南大学动物细胞工程复习资料.docx

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暨南大学动物细胞工程复习资料

动物细胞工程

第一章

概念：

动物细胞工程：

是指以动物细胞、细胞器或早期胚胎为研究对象，应用细胞生物学和分子生物学原理和方法，对其进行培养、繁殖、人工操作等，使其产生人们所需的生物学特征，获得人类所需的生物产品、创造新的细胞类型或动物品种的一门综合科学。

生物工程：

人们运用现代生物科学、工程学和其他基础学科的知识，按照预先的设计，对生物进行控制和改造或模拟生物及其功能，用来发展商业性加工、产品生产和社会服务的新兴技术领域

动物细胞工程包含哪些内容

动物细胞培养技术

干细胞工程

动物细胞融合

单克隆抗体制备

染色体工程

基因打靶与转基因动物

生殖细胞工程

胚胎工程

第二章

概念：

细胞培养：

是指细胞在体外条件下的生长，在细胞培养的过程中，细胞不再形成组织

组织培养：

是指组织在体外条件下的保存或生长，此时可能有组织分化并保持组织的结构或功能

原代培养：

以直接取自生物体细胞．组织或器官开始的培养

传代培养：

无论是否稀释，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养

细胞系：

原代培养物经首次传代成功后即成为细胞系

细胞株：

通过选择法或克隆法形成从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养称为细胞株，从培养代数来讲,可培养到40-50代以上

细胞培养实验室必须的设备有哪些？

1．无菌实验室

①实验准备室②培养体系配制室③培养室④观察室

2．净化台

适用于無菌操作、組织培养之用

3．培养箱和CO2培养箱

①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。

②保持培养箱内空气干净。

定期消毒（90℃，14h）。

③箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。

4．倒置显微镜

5．液氮罐

盛装－196℃的液氮，用来冻存细胞

6．器材的清洗与消毒

7．灭菌、消毒器具

①紫外线直接照射法②干热③湿热消毒④滤过消毒⑤消毒剂⑥煮沸消毒

动物细胞体外培养必要的条件有哪些？

为无菌、生长环境（PH值、温度）和营养

1）温度细胞对低温的耐受性要比对高温的耐受性强些，低温下会使细胞生长代谢速率降低；一经恢复正常温度时，细胞会再行生长。

若在40℃左右，则在几小时内细胞便会死亡。

因此高温对细的威胁甚大。

2）气体细胞的生长代谢自然离不开气体，容器空间中的O2及CO2足以保证细胞体内的代谢活动的进行，但作为代谢产物的CO2在培养环境中还有另外一个重要作用，即调节PH的作用。

3）PH值细胞培养的PH最适为7.2一7.4间，当PH低于6.0或高于7.6时，细胞的生长会受到影响，甚至导致死亡。

但是，多数类型的细胞对偏酸性的耐受性较强，而在偏碱性的情况下则会很快死亡。

4）营养在保证细胞渗透压的情况下，培养液里的成分要满足细胞进行糖代谢、脂代谢、蛋白质代谢及核酸代谢所需要的各种组成，如包括十几种必需氨基酸及其它多种非必需氨基酸、维生素、碳水化合物及无机盐类等。

传代培养和原代培养的实验过程（原代培养没找到呀呀）

细胞的冻存与复苏的过程，细胞冻存液细胞的冻存和复苏的原则“缓冻速融”

冻存：

1显微镜下观察培养细胞

2制备细胞悬液（同贴壁细胞传代）

3细胞悬液转入15mL离心管中，离心1200rpm5min

4去上清

5加入细胞冻存液（培养基中含10%DMSO（二甲亚砜），20-50%小牛血清）

6放置室温冻存盒中，封闭严实

7置-80℃冰箱过夜

8转入液氮中（－196℃）

复苏：

1从液氮中取出冷冻管（如为安瓶或无螺帽冷冻管，应防突然爆裂而伤皮肤和眼睛）

2立即放入37℃水浴中，振荡，使之尽快融化（1～2分钟），如不是螺旋盖冷冻管，则要用镊子夹住冷冻管，防止水进入而造成污染。

3将细胞悬液转入10mL预热的培养液中，混悬，离心洗涤，1200rpm，5min。

4去上清，加入培养液，调细胞浓度为1～2×105/mL

5转入细胞培养瓶中培养

细胞培养过程中的主要污染类型有哪些？

如何预防和防治污染？

污染类型：

细菌、真菌、病毒或细胞均可导致培养物污染。

生物的组织材料、操作者自身、培养基、各种器皿、甚至环境均可引起污染。

预防和防治：

显著污染的标志是培养基pH值的迅速改变、细胞外形模糊、甚至出现漂浮的集落。

1）组织出现污染，可加青霉素200U/mL、链霉素200U/mL、和制霉素100U/mL。

2）卡那霉素（100U/mL）是支原体药物，可抑制其感染，但不能根除。

对实验室工作者说来更严重的一种污染乃是其他细胞的交叉污染。

3）在任何时间，在一个工作区中决不能有一种以上的细胞系的细胞同时存在。

4）一种细胞系的细胞所用的培养基、器皿、移液管等决不能为另一种细胞系的细胞所移用。

5）一旦在同质的细胞群中出现不同形态的集落，则应怀疑是否发生了细胞污染，应用染色体组型及同功酶组型鉴定。

细胞传代培养实验过程有那些？

应该注意些什么问题？

细胞生长曲线分哪些时期

游离期细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。

此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。

贴壁期细胞附着于底物上，游离期结束。

细胞株平均在10分钟—4小时贴壁。

潜伏期此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。

细胞株潜伏期一般为6～24小时。

对数生长期细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。

停止期（平台期）细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。

细胞大规模培养的类型有哪些？

各有什么特点？

1）悬浮培养法（微载体培养法）

优点：

能大大提高细胞的生长效率和产量，节省人力物力、时间空间等优点，为细胞工程的发展与应用研究提供有利的条件

2）灌注系统培养法

优点：

①搅拌使所有细胞与营养液和气体充分接触，有利于细胞生长；

②培养条件更接近稳定状态；

③连续加液使细胞系长期持续对数生长。

3）中空纤维细胞培养法

优点：

由于血清含量少，其抗体纯度比腹水mAc的高两倍。

生产成本低。

4）微包夹法

优点：

5）子宫内种植法

6）牛淋巴液循环法

优点：

①淋巴液是高质量的营养液，可提高单位体积内细胞密度

②成本低

③能稳定地获得营养和处理废物，利于细胞生长

④是—种连续的密闭系统，可减少污染

⑤易在微机处理，控制下实现自动化

培养细胞的主要鉴定方法有哪些？

1、荧光抗体染色鉴别细胞的种属

间接荧光抗体染色技术—采用兔产生的特异性抗血清标记待测细胞和阳性细胞、阴性细胞。

加标记有荧光染料（FITC）的山羊抗兔疫球蛋白抗体。

后加上的荧光抗体将结合到已标记有兔抗体的靶细胞上，借助荧光即可看到抗原－抗体复合物。

2、同工酶谱系鉴别细胞种属

通过确定三种同工酶系统6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PD）乳酸脱氢酶（LDH）核苷磷酸化酶（NP）垂直淀粉胶电泳的迁移率，可以鉴定细胞系的种属来源。

该法有高度的可靠性，简单、重复性好。

3、染色体分析

多数情况下，即使普通显微镜观察技术，足以鉴定不同种的染色体结构的差异。

􀂄染色体核型分析足以鉴定不同种间细胞系之间的污染。

第三章

概念：

细胞融合：

是指两个或两个以上的相同或不同的细胞合并形成一个细胞的过程。

克隆：

又称“无性[繁殖]系”。

遗传组成完全相同的分子、细胞或个体及其组成的一个群体

克隆化：

经过人为选择，获得在遗传上纯一的后代的技术或过程。

饲养细胞：

铺在培养器皿上的经过处理不分裂的细胞。

可为体外培养细胞提供生长因子或细胞因子

HAT培养基：

当细胞融合之后要加HAT培养液，这种培养液是在普通培养基里面加上HAT

H为次黄嘌呤HypoxantbhineA为氨基喋呤AminopterinT为胸腺嘧啶Thymidine）。

使脾细胞及骨髓瘤细胞不能繁殖而死亡，但融合的杂交瘤细胞可以大量地繁殖，属选择性培养基。

细胞融合的方法有哪些？

1．病毒融合剂：

最早被采用病毒融合剂有疱疹病毒、天花病毒和副粘液病毒等在内的病毒类融合剂。

灭活仙台病毒介导细胞融合过程可以大大提高融合频率。

它在病毒类融合剂中最为有效，使用最广。

这种病毒可进入细胞内，在邻近的细胞之间形成细胞质桥

2.化学融合剂（PEG）

1、PEG可能使细胞膜（尤其是有丝分裂的骨髓瘤细胞）的脂类分子的物理结构发生重排，容易被PEG作用打开细胞膜，使细胞融合。

2、PEG可能把细胞膜上的蛋白质分子排开，使脂质体扦入与膜结合。

3、PEG可能作用于膜磷脂极性基团和细胞膜表面蛋白。

使膜磷脂的表面电位下降，同时使膜糖蛋白的排阻体积减少，最终使膜出现缺口，进而融合。

3、电融合技术

悬于大小不同的两平行电极间的低导电率溶液中的细胞，在1-100MHz和100-1000V/cm的交流电场中，会向小电极移动，并极化成偶极子，而沿电场方向排列成串，此时再加上适当强度和持续时间的高压电脉冲、即可使相邻细胞膜的接触区产生可逆电击穿，从而触发细胞融合。

4、激光融合

5、空间微重力融合

利用空间微重力条件进行细胞融合实验的目的，是利用在微重力条件下细胞在融合液中重力沉降现象消失，可以提高电融合杂种细胞得率和细胞活力，为人类利用微重力资源进行空间制药探索的新方法。

如“神舟四号”上的实验成功。

融合细胞的克隆化的方法有那些？

细胞克隆化培养的过程如何，有哪些注意事项，细胞克隆化

融合细胞的克隆化的方法及过程

按其分离单细胞的方法不同，大致可分为

1）有限稀释法

有限稀释法原理是从理论上将细胞稀释到10个/ml，然后装成每小孔（96孔板）0.1ml，使每孔理论上含有单个细胞，经过培养后即可获得单个细胞形

成集落。

2）软琼脂培养法

本法对于某些抗原，可以把克隆化培养与特异性筛选测定结合起来进行，所以它的特点是效率较高，速度较快。

但缺点是克隆率不高。

基本原理：

利用单个细胞在软琼脂培养基上的局限化生长，待细胞集落长到肉眼可见后，用巴氏吸管从琼脂上挑出来（一般8—10天后），再移到液体培养基中，进行生长繁殖，并检测培养上清液的活性。

也可以用溶血空斑技术或围

绕集落形成免疫沉淀的方法来直接测它的活性。

3）显微操作法

在倒置（或解剖）显微镜下，借助于毛细吸管将单个细胞个别吸出，分别放入已加饲养细胞的96孔培养孔内，根据原理不同，又分为普通法和玫瑰花结两种方法。

玫瑰花结：

原理：

分泌抗体细胞在其表面含有抗原受体，在一定的条件下常可与特异性抗原致敏的羊红细胞形成玫瑰花结。

如果从免疫动物的脾细胞中除去能形成特异性玫瑰花结的细胞则失去对特异性抗原的反应性。

4）盖片分离法

5）荧光激活细胞分离器法

用本仪器分离单细胞的原理是将悬液中的细胞引入一种液流的中央，使其一个接一个地通过聚焦的高能激光束，根据荧光和光放射的性质快速分析和分离细胞。

该仪器的主要功能：

1）利用荧光对代测细胞的光散射程度测定细胞大小

2）应用已知的McAb与代测细胞或已知细胞与未知McAb结合后。

加荧光素标记的荧光抗体，按细胞结合的荧光素量的差别区分。

3）利用制备型FACS还可分离单细胞。

纯度可达90-99％

注意事项：

①待克隆细胞生长处于对数增长期；

②小牛血清的质量和浓度；

③细胞计数要准确；

④及时观察细胞生长情况。

培养的应用在那些方面。

1.疫苗：

口蹄疫疫苗乙型肝炎疫苗等

2.干扰素：

α和β干扰素

3.单克隆抗体

4.基因重组产品：

免疫球蛋白G、A和M、尿激素等

第四章

概念：

淋巴细胞杂交瘤，单克隆抗体

淋巴细胞杂交瘤（Hybridoma）：

即利用细胞杂交技术将致敏的淋巴细胞（T或B细胞）与相应的细胞（胸腺瘤或骨髓瘤）进行融合而产生的杂种细胞。

（包括可产生抗体的B淋巴细胞杂交瘤和可产生淋巴因子或发挥某类T细胞功能的T淋巴细胞杂交瘤。

）它的目的主要是为