生化试剂的基础知识.docx

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生化试剂的基础知识

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生化试剂的基本知识

一、生化试剂的分类

（一）按照化学性质分类

1.酶类：

包括ALT,AST,ALP,ACP,r-GT,α-HBDH,LDH,CK,CK-MB,α-AMY,MSO,ADA,ChE等。

2.底物/代谢产物类：

包括TG,TC,HDL-C,LDL-C,UA,UREA,Cr,Glu,TP,Alb,T-Bil,TBA,NH4+,CO2等。

3.无机离子类：

包括Ca,P,Mg,Cl等。

4.特种蛋白类：

包括apoAl,apoB,Lp（a）,C3,C4,PFB（B因子），IgG,IgA,IgM等。

（二）按照临床应用分类

1.无机离子：

包括Ca，P，Mg，Cl等。

2.肝功能：

包括ALT，AST，r-GT，ALP，MSO，T-Bil，D-Bil，TBA，TP，Alb等。

3.肾功能：

UA，UREA，Cr等。

4.心肌酶谱：

CK，CK-MB，LDH，α-HBDH，AST，MSO。

5.糖尿病：

GLU等。

6.前列腺疾病：

ACP，p-ACP等。

7.胰腺炎：

α-AMY。

8.血脂：

TC，TG，HDL-C，LDL-C，apoA1，apoB，Lp（a）。

9.痛风：

UA。

10.有机磷中毒：

ChE。

11.免疫性疾病：

C3，C4，PFB（B因子），IgG，IgA，IgM，Kappa链，Lambda链。

二、反应速度特性

按照反应速度，可以分为终点法试剂和动力学试剂。

而动力学试剂又可再分为零级动力学法和一级动力学法。

（一）终点法试剂

终点法，指经过一段时间（一般为几分钟）的反应，反应进行到完全，使全部底物（被测物）转变成产物，称终点法，更确切地说应称平衡法，这是最理想的分析类型。

如图

（1）。

整个反应达到平衡，由于正向反应的平衡常数很大，可认为所有的被测定物已转变为产物，反应液的吸光度不再增加（或降低），吸光度的增加（或降低）程度与被测定物的浓度成正比。

终点法对反应条件（如酶量、pH、温度）小的改变不敏感，只要这种改变不影响在一定时间内反应达到平衡即可，是最理想的反应模型。

图

（1）

属于终点法的试剂主要有：

TG，TC，HDL-C，LDL-C，UA，Glu，TP，Alb，T-Bil，D-Bil，Cr（氧化酶法），NH4+，CO2，Ca，P，Mg，Cl，apoA1，apoB，Lp（a），C3，C4，PFB（B因子），IgG，IgA，IgM等。

（二）动力学法试剂

1.零级动力学法

零级动力学法，指反应过程中反应速度维持不变，达到最大，与底物浓度无关，因此，在整个反应过程中，反应物可以匀速地生成某个产物，导致被测定溶液在某一波长下吸光度均匀地减小或增加，减小或增加的速度（△A/min）与被测物的活性或浓度成正比，主要用于酶活性的测定。

如图

（2）。

实际上，由于底物浓度不可能足够大，随着反应的进行，底物消耗到一定程度后，反应速度不再维持不变，同样从启动反应到达到最大速度需要一定时间。

因此，零级动力学法是针对特定时间而言的，各试剂商对这段时间有严格规定。

图

（2）

属于零级动力学法的试剂主要有：

ALT，AST，ALP，ACP，r-GT，α-HBDH，LDH，CK，CK-MB,α-AMY，MSO，ADA，ChE，TBA等。

2.一级动力学法

在一定的反应时间内，反应速度与底物浓度的一次方成正比，由于底物在不断的消耗，因此整个反应的速度在不断的减少，表现为吸光度的增加（或降低）速度越来越小，这类反应达到平衡的时间很长，理论上可以在任意时间段进行监测，但由于血清成份复杂，反应刚启动时反应较复杂，杂反应较多，经过一段延迟时间才能进入稳定反应期，必需在特定时间段内进行监测，各试剂商对这段时间有严格规定。

如图（3）。

在一固定时间间隔中，底物浓度的变化量正比于底物的初浓度，这是一级反应的同性。

该段时间内吸光度的增加或降低与被测物的浓度成正比。

图（3）

属于一级动力学法的试剂主要有：

Cr（苦味酸法），UREA（紫外监测法）

三、显色原理

显色系统主要有以下几种：

ØNAD-NADH和NADP-NADPH系统

Øp-NP和p-NA系统

ØH2O2偶联的指示系统

Ø抗原抗体反应指示系统

Ø其它显色反应

（一）NAD-NADH和NADP-NADPH系统

NADH和NADPH在340nm有特征性吸收峰，而NAD和NADP在340nm无特征性吸收峰，利用其偶联的脱氢酶（工具酶）反应，根据340nm吸光度的变化，可以测定物质的浓度或活性。

作为该指示系统常用的工具酶有LDH、MDH、GLDH和G6PDH

目前利用此指示系统进行测定的临床项目有：

ALT、AST、CK、LDH、CK-MB、α-HBDH、Glu、UREA、NH4+、CO2等。

（二）p-NP和p-NA系统

p-NP和p-NA在405nm有特征性吸收峰，根据405nm吸光度的变化，可以测定物质的浓度或活性。

目前利用此指示系统进行测定的临床项目有ALP、ACP、r-GT、AMY等。

（三）H2O2偶联的指示系统

H2O2在过氧化物酶的作用下，可使单一个或成对的无色的色素原氧化成有色的色素，导致某一波长吸光度的增加，因此可用来测定物质的浓度或活性

用于此指示系统的单一色素原有TMB、ABTS等；成对色素原有酚和4AA、MBTH和DMA等。

目前利用此指示系统进行测定的临床项目有TC、TG、HDL-C、LDL-C、Glu、Cr、UA等。

（四）抗原抗体反应指示系统

特异性抗体与抗原（待测物质）在相应的缓冲环境下反应生成抗原抗体复合物，形成一定的浊度，导致特定波长透光率的改变。

在抗体过剩的前提下，改变程度与抗原浓度成正比。

目前利用此指示系统进行测定的临床项目有apoAI、apoB、Lp（a）、IgG、IgA、IgM、C3、C4、CRP等。

（五）其它显色反应

蛋白质中的肽键在碱性溶液中能与铜离子作用产生紫红色络合物，在一定浓度范围内颜色反应强度与蛋白质的浓度成正比。

用于TP的测定。

溴甲酚绿（BCG）在非离子去污剂Brij－35的存在下，可与白蛋白形成紧密结合的绿色复合物。

用于Alb的测定。

重氮苯磺酸盐与胆红素生成红紫色偶氮胆红素。

用于总胆红素和直接胆红素的测定。

甲基麝香草酚兰（MTB）在碱性条件下可与Ca、Mg形成有色络合物。

用于Ca、Mg的测定。

四、性能评价方法

（一）主要性能指标：

1.稳定性：

指在规定条件下经过一段时间的保存，仍能达到相应的性能指标，如试剂空白吸光度、线性范围、灵敏度等。

2.反应灵敏度：

指单位浓度（或活性）的测定物反应所产生的反应度，反应度越高，灵敏度越大。

3.精密度：

结果间相互符合的一致程度

4.准确度：

与参考测定程序结果的一致性

5.线性范围：

在规定的重复性和线性偏差下，测得的浓度或活性值与设定的浓度或活性值之间的比例关系的范围。

6.基质效应：

基质指的是样品中被分析物以外的组分。

基质常常对分析物的分析过程有显著的干扰，并影响分析结果的准确性。

例如，溶液的离子强度会对分析物活度系数有影响，这些影响和干扰被称为基质效应（matrixeffect）。

7.抗干扰性：

8.其它：

试剂/样本比例、反应时间、价格等。

（二）性能评价方法

1.稳定性：

连续观测，每日试验；热加速试验。

2.反应灵敏度：

直接计算单位浓度反应物的吸光度变化或变化率。

3.精密度：

按照NCCLSEP5-A进行。

4.准确度：

按照NCCLSEP9-A2进行。

5.线性范围：

按照NCCLSEP6-A进行。

6.基质效应：

通过回收试验确定

7.抗干扰性：

按照NCCLSEP7-A进行。