三疣梭子蟹养殖塘弧菌群落结构研究毕业作品.docx
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三疣梭子蟹养殖塘弧菌群落结构研究毕业作品
毕-设
业-计
（20__届）
三疣梭子蟹养殖塘弧菌群落结构研究
所在学院
专业班级海洋生物资源与环境
学生姓名学号
指导教师职称
完成日期年月
致谢8
参考文献9
摘要：
采用平板计数、菌落形态观察和16SrDNA序列比对的方法，对健康和发病的三疣梭子蟹（Portunustrituberculatus）养殖水体的弧菌（Vibrio）数量和群落结构进行了比较研究。
共分离得到42株弧菌，可分为5个菌落类型（C1-C5），6个种。
健康塘养殖水体的弧菌数量为1.85-2.35×102cfu/mL，菌落主要分布在C1、C2和C4这3个类型，分布比较均匀，
V.alginolyticus有6株，为第一优势种，种属分布也比较均匀；病害塘养殖水体的弧菌数量为0.65-1.9×102cfu/ml，菌落类型主要集中在C1类型，优势种为V.alginolyticus，与健康塘相比，病害塘养殖水体中的弧菌菌落类型和种属分布均比较集中。
这些结果似乎表明三疣梭子蟹发病与群落结构（比如弧菌的多样性、致病性弧菌的绝度优势地位）有直接关系，但与弧菌数量的关系无法从该实验得到。
关键词：
三疣梭子蟹；养殖水体；弧菌；群落结构；16SrDNA
Abstract:
Wecomparethenumberandthecommunitystructureofthevibriointhehealthyanddiseasedrearingwaterbyplatecount,colonycategoryand16SrDNAsequencealignmentmethods.Thereare42vibriostrainsisolatedfromtherearingwater.Theycanbedividedintofivegroups（C1-C5）bycolonycategory,and6speciesbysequencing.Intheheathypond,thenumberoftheisolatedvibriois1.85-2.35×102cfu/mL,mainlycontributedintheC1,C2andC4groups,V.alginolyticusisthefirstdominantspecieswith6strains,speciesisevenlydistributed.Whileinthediseasedpond,thenumberoftheisolatedvibriois0.65-1.9×102cfu/ml,mainlycontributedintheC1group,thedominantspeciesisV.alginolyticusonly.Thespeciesdistributionismoreconcentratedinthediseasedpondthaninthehealthypond.Theseresultsseemtoindicatethattherearesomerelationswiththecommunitystructure（suchasthevibriodiversityandthedominantbacteria）andthedisease,butwecannotknowtherelationwiththevibrioquantityandthediseasefromthisstudy.
Keywords:
Portunustrituberculatus;rearingwater;vibrio;communitystructure;16SrDNAsequence
前言
三疣梭子蟹是我国重要的海产经济蟹类，具有较高的经济价值。
近年来，由于养殖规模的不断扩大、养殖密度的不断提高、养殖环境的污染，导致三疣梭子蟹的抗病力下降，容易感染病原体，使得疾病频繁发生，例如近几年由弧菌引起的“乳化病”给三疣梭子蟹养殖业带来了重大经济损失[1]。
国外早在20世纪初就有学者[2]对海水鱼类弧菌病进行研究，自20世纪60年代后相继对多种弧菌属的致病菌有较丰富的研究和报道[3-6]。
在三疣梭子蟹大规模养殖的过程中，由弧菌引起的死亡时有报道[7-8],是该行业发展的重要限制性因素。
因此研究环境中弧菌群落结构及数目规律，对水产养殖、食品生产等与人类生活及健康密切相关的领域具有重要指导意义。
弧菌属于弧菌科（Vibrionaceae）弧菌属，是一类革兰氏阴性、具极生鞭毛、能运动、无芽胞的短杆状细菌,其中有的弧菌有一定的弯曲,欠柔软,有的弯曲不明显。
根据伯杰氏细菌鉴定手册（第9版）收录的弧菌属的细菌有37种以上。
弧菌科细菌广泛分布于半咸水、河口、海洋的水体、沉积物中以及海洋生物的体表和肠道中。
目前，有关弧菌相关疾病的病原鉴定、病理和组织生理变化的研究国内已有不少报道如刘淇[9]，王国良[10]，施慧[11]，许文军[12]，Jang-SeuKi[13]等分别对上述弧菌相关方面进行了研究，但是目前由弧菌引发的疾病与水体中弧菌群落结构的关系研究较少，有报道（倪纯治等[14]）过弧菌数量与虾体弧菌相关疾病的关系，养殖水体的弧菌数量常常被看做疾病爆发的重要征兆之一。
沿海浮游细菌的基因型容易变异，因此基因类型比较丰富[15]，弧菌主要分布在沿海水域中，也有这个特点。
弧菌种类繁多，致病性菌株只占一小部分（据相关报道，溶藻弧菌（V.alginolyticus）、哈维氏弧菌（V.harveyi）等10多种弧菌可以引起海水养殖动物发病[16-17]，特别是夏季，一些弧菌暴发性增长，使养殖对象出现皮肤溃烂，烂尾，出血等症状），大部分是非致病菌，这些非致病菌在水体净化中还起着非常重要的作用，因此，相较于弧菌数量，弧菌群落的结构组成可能与疾病爆发更为相关。
随着分子生物学技术的发展，尤其是PCR和测序技术的发展，使人们能够利用16SrDNA序列来鉴定环境中弧菌菌种，来研究环境中的弧菌群落结构。
从环境中分离纯化弧菌，提取各弧菌菌株的DNA，对细菌的16srDNA区进行扩增测序，最后通过一些生物信息学的方法鉴定该弧菌的系统发育地位。
我们选取两个代表性的三疣梭子蟹养殖塘，其中一个塘中梭子蟹发生类似“牛奶病”的疾病，梭子蟹连续不断死亡，称为病害塘；另一个塘，没有明显的梭子蟹死亡迹象，称为健康塘。
我们基于细菌计数、菌落特征和16SrDNA基因序列比对对这两个三疣梭子蟹养殖塘的养殖水体中的弧菌群落组成进行了比较研究，以期进一步揭示弧菌群落结构变化与三疣梭子蟹疾病发生的关系。
1材料与方法
1.1样品采集
2010年7月24日9：
30～12：
00，宁波鄞州区瞻岐镇三疣梭子蟹养殖场，阴雨，气温25-31℃，水温28℃，我们按照《海洋调查规范》第6部分海洋生物调查（GB/T12763.6-2007）[18]的要求选取健康不发病的养殖塘和发病严重的养殖塘各两个，养殖塘面积为5-6亩，养殖密度为2000只/亩，于水深80cm左右处采取水样。
采样前，开动水车30min，以使水体充分混匀。
样品采集后均放在装有冰袋的密封泡沫箱中，并于6h内进行实验。
1.2培养基
TCBS琼脂的成分（g/L）[19]：
酵母浸出粉5.0g，蔗糖20.0g，蛋白胨20.0g，枸橼酸铁1.0g，枸橼酸钠10.0g，BTB0.04g，硫代硫酸钠10.0g，琼脂粉13.0g，牛胆粉8.0g。
pH8.6±0.4
1.3仪器设备
本实验所用到的实验仪器有：
Eppendorf离心机，BIO-RADPCR仪，变性凝胶电泳仪，琼脂糖凝胶电泳，RXZ智能型人工气候箱，SP-DJ系列水平净化工作台，-20℃保存的冰箱，水浴锅，摇床。
1.4弧菌的分离、纯化
三疣梭子蟹养殖塘水体的弧菌计数、分离和纯化均采用TCBS培养基。
采集的水样用无菌生理盐水稀释成3个梯度（10-1、10-2、10-3），每个稀释度设3个平行,取100μL稀释液涂布TCBS培养基平板，30℃恒温培养箱内连续培养2～4d，记录各平板菌落数，并推算出原样品的弧菌浓度，随机挑取部分单菌落划线分离纯化3次，得到纯化菌株用于后续实验，记录其形态特征，如颜色、质地、表面形态等。
1.5弧菌基因组DNA的提取及16SrDNA基因的PCR扩增
参照张德民等的方法[20]提取弧菌基因组DNA，并加以改进：
菌株培养至对数生长后期离心收集菌体，用TE洗涤细胞，重悬于TE中，加溶菌酶0-2mg/mL，37℃水浴处理5-30min，加SDS至终浓度为2%，60℃水浴处理5-60min，酚/氯仿/异戊醇抽提，氯仿/异戊醇再抽提，乙醇沉淀，溶于去离子水中。
采用细菌通用性引物对27f（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和1541r（ACGGCTACCTTGTTACGACT）[21]扩增细菌16SrDNA约1400bp的片段，并用于测序。
采用50μLPCR反应体系，其组成为：
0.2-1μg基因组DNA，4μmol·L-1引物，200μmol·L-1dNTPs，5μL10×buffer，1UDNA聚合酶，补双蒸水到50μL。
PCR扩增程序为：
94℃预变性5min；前10个循环为94℃1min，65-60℃lmin，72℃30s（其中每个循环后复性温度下降0.5℃）；后18个循环为94℃1min，60℃1min，72℃30s；最后72℃延伸5min。
PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，用细菌级琼脂糖粉和TAE按比例混合，加热溶解摇匀后加入少量EB，趁未凝固时倒入模具，插入齿梳，凝固后形成1.5％（w/v）琼脂糖凝胶（含有0.5μg/ml溴化乙锭）的胶版，将PCR产物和6xBuffer各取3ul混合，点样，100V下电泳20min，在FR复日紫外/可见光分析生物凝胶成像系统下成像，观察PCR产物的条带，确定PCR是否成功。
1.6弧菌16SrDNA序列的测定及系统发育学分析
引物对（27f-1512r）PCR扩增的16SrDNA产物用UNIQ-10柱式通用DNA纯化试剂盒纯化，送上海生物工程技术服务有限公司进行序列测定，将所得序列提交到GenBank数据库中，登录号为：
GU132526，GU132530，GU132535等。
用BLAST程序进行同源性比对，下载相关序列用Mega4.0软件，再选择其他几株已知类别的代表弧菌，构建系统发育树。
2结果
2.1弧菌数量比较
对三疣梭子蟹健康塘和病害塘养殖水体中的弧菌进行菌落计数（表1），计算出其弧菌浓度，从表中可知，健康塘水体弧菌数量为1.85-2.35×102cfu/mL，弧菌的平均数量为2.1×102cfu/mL；病害塘水体弧菌数量为0.65-1.90×102cfu/mL，弧菌的平均数量为1.3×102cfu/mL。
从以上数据可以看出，病害塘养殖水体弧菌的样本1与健康塘在同一数量级上，比健康塘养殖水体的数量略少；病害塘养殖水体弧菌的样本2比健康塘少一个数量级，数量几乎少了一半；从平均数来看，病害塘养殖水体的弧菌平均数量1.3×102cfu/mL与健康塘养殖水体的弧菌数量2.1×102在同一数量级上，且病害塘的弧菌数量比健康塘的弧菌数量仅略少一些。
表1三疣梭子蟹养殖水体的弧菌数量（cfu/ml）
Tab.1Thenumberofvibriointherearingwater（cfu/ml）
样本
Sample
健康塘
heathypond
病害塘
diseasedpond
样本1
Sample1
2.35×102
1.90×102
样本2
Sample2
1.85×102
6.50×101
平均值
average
2.1×102
1.3×102
2.2弧菌群落结构多样性
2.2.1弧菌菌落类型多样性比较
我们从三疣梭子蟹养殖健康塘和病害塘的养殖水体中olond124共分离弧菌42株，其中健康塘水样与病害塘水样各21株，首先对其进行划线纯化，经3-5天培养后，记录其菌落形态并统计归类。
根据弧菌菌落特征的差异（如表面形态、形态、质地、颜色等）将弧菌菌落初步划分为5个类型（C1-C5）（见表2）。
从整体上来看，其中C1类型为最优势类型，共有18株菌，占分离菌株总数的42.9%，在健康塘养殖水体和病害塘养殖水体中分别有6、12株菌；其次是C2类型，共有12株菌，占分离菌株总数的28.6%，在健康塘养殖水体和病害塘养殖水体中分别有7、5株菌；第三是C4类型，共10株，占分离菌株总数的23.8%，在健康塘养殖水体和病害塘养殖水体中分别有6、4株菌；另外，C2和C5类型的菌株较少，均只有1株菌，均占分离菌株总数的2.4%，仅分布于健康塘养殖水体中。
分别从健康塘和病害塘养殖塘水体的数据可以看出，健康塘养殖水体和病害塘养殖水体均有21株弧菌，健康塘养殖水体的弧菌菌落分布在5个类型中，其中C2（凸起、奶油、圆、墨绿）有7株菌，为第一优势类型；其次，C1（凸起、奶油、圆、橙黄）和C4（平展、奶油、圆、橙黄）均有6株，为第二优势类型，且仅比第一优势类型相差一株；另外，C3（凸起、蜡状、圆、墨绿）和C5（平展、蜡状、圆、橙黄）各一株。
病害塘养殖水体的弧菌菌落类型仅分布在3个类型中，比健康塘少了两个，其中C1（凸起、奶油、圆、橙黄）有12株，为第一优势类型，且数量上占有绝对优势；其次，C2（凸起、奶油、圆、墨绿）有5株，为第二优势类型，与第一优势菌相差7株；另外，C4（平展、奶油、圆、橙黄）有4株。
首先，从健康塘和病害塘的弧菌菌落类型多样性比较可知，健康塘水体的弧菌分布在5个类型中，较病害塘的弧菌分布要广，健康塘的弧菌主要集中分布在C1、C2和C4这3个类型，第一优势类型为C2，分布比较均匀；病害塘养殖水体的弧菌分布在3个类型中，主要集中分布在C1类型，C1类型占了病害塘养殖水体分离菌的57.1%，占了病害塘弧菌的一半多，较另外两个弧菌菌种具有明显的优势，从这一点可知病害塘养殖水体的弧菌分布相对比较集中，与健康塘养殖水体不同。
另外，两者也有共同之处，健康塘和病害塘养殖水体的共有类型有3个，分别为C1、C2和C4。
从各群落类型的数量可以看出，健康塘养殖水体的这3个类型集中了90.5%的弧菌数量，病害塘养殖水体则集中了全部的弧菌数量，从这一点来看具有相似性。
表2三疣梭子蟹养殖水体的弧菌菌落类型分布
Tab.2Thecolonycategoryofthevibriointherearingwater
菌落类型
colony-basedgroups
表面形态
surfaceshape
质地
texture
形态
shape
颜色
culour
健康塘
heathypond
病害塘
diseasedpond
总数
total
C1
凸起
奶油
圆
橙黄
6
12
18
C2
凸起
奶油
圆
墨绿
7
5
12
C3
凸起
蜡状
圆
墨绿
1
0
1
C4
平展
奶油
圆
橙黄
6
4
10
C5
平展
蜡状
圆
橙黄
1
0
1
总数total
21
21
42
2.2.2弧菌种属分布多样性比较
我们对分离的弧菌进行16SrDNA鉴定，健康塘养殖水体和病害塘养殖水体共分离了42株弧菌，实验过程中死亡5株，DNA提取失败2株，未鉴定成功2株，实际鉴定33株，16SrDNA序列Blast比对表明33株弧菌归属于6个种（98%的序列相似性作为种的划分标准）（表3），取该6个种类的代表性菌株和其他6株非代表性菌株的序列构建系统发育树（图1），比较弧菌种属在各养殖水体中的分布。
从整体上看，在这6个种类中，V.alginolyticus为最优势种，共有15株菌，占测序弧菌总数的44.5%，将近一半，其中健康塘养殖水体和病害塘养殖水体分别有6、9株菌；第二优势种为V.harveyi，共有7株菌，占测序弧菌总数的21.2%，其中健康塘养殖水体和病害塘养殖水体分别为3、4株菌；第三优势种为V.campbellii和V.natriegens，均有4株菌，均占测序弧菌总数的12.1%，其中V.campbellii在健康塘养殖水体和病害塘养殖水体中分别有3、1株菌，V.natriegens在健康塘养殖水体和病害塘养殖水体中则均为两株；其余两种菌V.neptunius和V.xuii的数量相对较少，仅分布在个别样品中，为1-2株。
分别从健康塘和病害塘养殖水体的数据可以看出，健康塘养殖水体的弧菌共有16株，5个种，其中V.alginolyticus有6株，为第一优势种，V.harveyi有4株，为第二优势种，V.campbellii有3株，为第三优势种，其余的两个种有1-2株菌，数量上分布比较均匀；病害塘养殖水体的弧菌共有17株，6个种，其中V.alginolyticus有9株，，为第一优势种，V.harveyi有3株，为第二优势种，其余4种菌各有1-2株，数量分布上相对与健康塘来说比较集中，V.alginolyticus的数量超过病害塘测序弧菌的一半，占有绝对优势。
从健康塘和病害塘养殖水体的弧菌种属多样性比较来看，健康塘养殖水体和病害塘养殖水体的差异不是很大，有5个种（V.alginolyticus、V.campbellii、V.harveyi、V.natriegens和V.neptunius）为两者所共有，其中V.alginolyticus为健康塘养殖水体和病害塘养殖水体的共有优势种，分别有6、9株菌，占各自塘的测序弧菌总数的比例为37.5%、52.9%，第二优势菌都为V.harveyi，其余3个种在两塘中的数量差异也很小。
但是健康塘和病害塘养殖水体的弧菌种属分布也有不同之处，病害塘弧菌的分布中第一优势菌为占了一半多的菌种，其数量占有绝对优势，分布比较集中，而健康塘的弧菌分布相对比较均匀，这一现象与菌落的类型分布特点相似。
另外，有1株菌V.xuii仅在病害塘养殖水体出现。
表3三疣梭子蟹养殖水体弧菌种属分布
Tab.3Thespeciesdistributionofthevibriointherearingwater
相近种属名称
similarspecies
代表菌株
representativestrains
相近种16SrDNA序列
16SrDNAsequencesofsimilarspecies
16SrDNA相似性
16SrDNAsimilarity（%）
健康塘
heathy
pond
病害塘
diseasedpond
总数
total
V.alginolyticus
ZHS-4
X74690
99.6
6
9
15
V.campbellii
ZDS-4
X56575
99.3
3
1
4
V.harveyi
D1X-7
X74706
99.8
4
3
7
V.natriegens
H2X-7
X74714
100
2
2
4
V.neptunius
ZHS2-6
AJ316171
99.5
1
1
2
V.xuii
XHS2-7
AJ316181
98.8
0
1
1
总数total
16
17
33
图1三疣梭子蟹养殖水体代表菌株及部分其他非代表弧菌的系统发育学分析
Fig.1Thephylogeneticanalysisofthevibriointherearingwaterandsomeothers
注：
包含的菌株为本实验从养殖塘分离鉴定的弧菌各菌种的代表菌株，其余为部分其他非代表性弧菌菌株和标准菌株。
3讨论
弧菌是海水环境中的常在菌群，广泛分布在自然海区，是一种条件致病菌，当养殖动物受伤、体弱、抗病力降低和环境条件恶化时，环境中的部分致病性弧菌就会乘虚而入，引起蟹、虾等各种水产动物的疾病，严重时甚至死亡。
本文从弧菌的菌落计数出发，通过菌落特征的观察和弧菌种属多样性序比较，对三疣梭子蟹养殖健康塘和病害塘水体的弧菌群落结构进行了比较研究，意在通过两者的比较，找出养殖塘弧菌群落结构与发病的关系。
3.1养殖水体弧菌群落结构与病害的关系
研究证明，大部分病原体在致病前都是处在一种代谢繁殖不活跃或十分不活跃状态，疾病的爆发，是因为病原体数量激剧增加、病原体的致病力大大加强[22]，本文也证实了这一情况。
V.alginolyticus为致病性弧菌[23]，在三疣梭子蟹健康塘和病害塘的养殖水体中都存在，并且在病害塘中数量有较多的增加，成为绝对优势菌种，这可能是引发三疣梭子蟹疾病的原因之一，另外，菌落分布的结果也有类似现象，病害塘的弧菌种类减少，并且C1（凸起、奶油、圆、橙黄）数量较健康塘大大增加，成为了绝对优势类型。
总而言之，就是说在正常情况下，养殖水体中弧菌的种类分布比较均匀，各致病性和非致病性弧菌之间可能存在某种平衡，当这个平衡被打破时，某种或某些致病性弧菌大量繁殖，这些致病性弧菌就比较容易侵入蟹体内，导致疾病的发生。
弧菌可分为致病性弧菌和非致病性弧菌，且绝大多数种类为非致病性弧菌，目前已确定的主要的致病性弧菌仅包括霍乱弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌在内的约10种左右[23]，从以上实验结果我们可以看出，健康塘和病害塘养殖水体的弧菌在数量上差别不大，病害塘比健康塘稍微少一些；两者的弧菌菌落类型分布方面有些差异，健康塘分布比较均匀，而病害塘的弧菌分布比较集中在C1类型；另外，两者在种属分布方面的特点与菌落分布相似。
因此我们可以推断，弧菌发病与养殖水体中弧菌群落结构的变化有直接关系，弧菌数量有集中到某些致病菌的趋势，使这些致病菌处于绝对优势地位，从而比较容易侵入蟹体，引起三疣梭子蟹的疾病。
3.2菌落类型与种属分布的联系
从表4可知，虽然同一种弧菌的菌落特征不是完全分布于同一菌落类型，如V.alginolyticus分布于C1，C2，C4三个类型，V.harveyi分布于C1，C2，C4三个类型。
但是每种弧菌都有各自的优势菌落类型，如V.alginolyticus和V.natriegens的优势菌落类型均为C1，分别占各自种属总菌株数的80.0%和75.0%；另外，V.campbellii有3株菌分布于C2类型，占该种总菌株数的75.0%，V.harveyi的7株菌各有3株分布在C2和C4类型，各占该种总菌数的42.9%从这些结果我们可知，V.alginolyticus的菌落形态主要为凸起、奶油、圆、橙黄，V.campbellii的菌落形态主要为凸起、奶油、圆、墨绿，V.natriegens的菌落形态主要为凸起、奶油、圆、橙黄，V.harveyi的菌落形态主要为凸起、奶油、圆、墨绿和平展、奶油、圆、橙黄，V.harveyi的种内差别较大，发育
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