重组鸡Igλ轻链真核细胞分泌表达及其单克隆抗体的制备与鉴定.docx
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重组鸡Igλ轻链真核细胞分泌表达及其单克隆抗体的制备与鉴定
重组鸡Igλ轻链真核细胞分泌表达及其单克隆抗体的制备与鉴定
张红,张改平,章金刚,杨艳艳,易明林,李姣,韩鸿鹏
【摘要】 目的:
构建重组载体pcDNAλ并在COS7细胞分泌表达鸡Igλ轻链,制备抗鸡Igλ轻链的单克隆抗体（mAb）。
方式:
PCR扩增带有信号肽的鸡Igλ轻链基因,限制性酶切消化后,定向克隆于真核表达载体pcDNA3,构建具有6×His标签、分泌表达的重组载体pcDNAλ。
重组载体转染COS7细胞后,SDSPAGE分析真核表达载体pcDNAλ在COS7细胞的分泌表达。
用2×106个雏鸡B淋巴细胞免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与骨髓瘤细胞融合,别离采纳细胞免疫荧光和间接ELISA挑选阳性杂交瘤克隆。
结果:
成功构建分泌表达鸡Igλ轻链的重组载体,SDSPAGE分析说明在COS7细胞上清有目的蛋白的分泌表达。
杂交瘤细胞经挑选与鉴定,取得2株分泌抗鸡Igλ轻链mAb的杂交瘤细胞株,Westernblot检测到该mAb对重组鸡Igλ轻链的反映性。
结论:
构建了重组表达载体pcDNAλ并在COS7细胞上清分泌表达了重组鸡Igλ轻链。
并用淋巴细胞杂交瘤技术成功挑选出抗鸡Igλ轻链mAb。
为深切研究鸡Igλ轻链的结构与功能奠定了基础。
【关键词】鸡Igλ轻链pcDNAλCOS7细胞真核分泌表达单克隆抗体
[Abstract]AIM:
ToconstructtheeukaryoticexpressionvectorforchickenIgλlightchain,toexpressitonCOS7cellsandtopreparethemonoclonalantibodiesagainstchickenIgλ.METHODS:
ThecDNAofchickenIgλlightchainwithsignalpeptidesequencewasamplifiedandtheninsertedintoeukaryoticexpressionplasmidpcDNA3afterdoubleenzymecutting.TheconstructedrecombinantvectorwastransfectedintoCOS7cellsbylipofectaminandthesecretableeukaryoticexpressionofchickenIgλlightchainwasverifiedbyWesternblot.Themonoclonalantibodies（mAbs）againstchickenIgλlightchainwerepreparedbyimmunizingBALB/cmicewith2×106chickenBcellsandbycellfusiontechnology.RESULTS:
Theeukaryoticexpressionvectorwassuccessfullyconstructed.WesternblotdemonstratedthatchickenIgλlightchainexistedintheculturalsupernatant.ThehybridomalinessecretingantiIgλmAbswerescreenedbyindirectELISA.ThespecificreactivitybetweenantiIgλmAbsandrecombinantchickenIgλlightchainwasdetectedbyWesternblot.CONCLUSION:
ThesecretedrecombinantchickenIgλlightchainandantiIgλmAbsprovideabasisforfurtherstudyofthefunctionsofchickenIgλ.
[Keywords]chickenIgλlightchain;pcDNAλ;COS7cell;secretableexpression;monoclonalantibody
禽类拥有特殊的抗体基因结构、特有的免疫器官和相对保守的抗体基因类别,已经成为研究抗体产生和免疫系统发生发育的重要模式生物[1]。
法氏囊是鸡特有的中枢免疫器官,鸡抗体基因数量少且结构简单,抗体多样性机制与哺乳动物及人类有全然性不同[2]。
轻链作为抗体和膜表面免疫球蛋白（mIg）的重要组分,在抗原识别、B细胞分化和免疫防御等方面发挥着重要作用[3-5]。
已经发觉约95%的鸡免疫球蛋白属于λ型。
研究鸡Igλ轻链关于全面熟悉鸡的抗体基因和免疫系统发育和功能具有重要价值和意义。
本研究中通过构建真核表达的重组载体pcDNAλ,实现重组鸡Igλ轻链在COS7细胞的分泌表达。
利用杂交瘤技术制备了抗鸡Igλ轻链mAb,为进一步研究鸡抗体轻链的结构和功能奠定了基础。
1材料和方式
材料重组质粒pGEMλ由河南省动物免疫学重点实验室构建[6]。
真核表达载体pcDNA3（Invitrogen公司）、COS7细胞株（中科院上海细胞生物所）、脂质体LipofectamineTM2000（Invitrogen公司）、质粒提取试剂盒（Qiagen公司）、限制酶、T4连接酶、DNA聚合酶（购自TaKaRa公司）。
DMEM培育基、RPMI1640细胞培育基,HAT、HT培育基,PEG4000,胎牛血清均为Gibco产品。
NS0瘤细胞由英国国家动物健康研究院惠赠。
BALB/c纯系雄性小鼠购自郑州大学医学院实验动物中心,鼠龄6～8周,体质量18～22g用于动物免疫和制备饲养细胞。
方式
分泌型真核表达重组载体pcDNAλ的构建以已构建的重组质粒pGEMλ为模板,PCR扩增鸡IgλcDNA并引入HindIII和XholI酶切位点。
用于扩增的引物:
A15′CAGAAGCTTAGCTGCTGGGATTC3′,A25′TCTCTCGAGTTAATGATGATGGTGGTGATGGCACTCGGACCT3′。
PCR扩增反映体系为:
cDNA1μL、PremixExTaqTM25μL、上游引物1μL、下游引物1μL、ddw22μL。
PCR反映参数:
94℃,预变性2min;94℃30s,60℃30s,72℃90s,30个循环,72℃维持10min。
10g/L琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物。
HindIII和XholI酶切λcDNA和pcDNA3质粒,将λcDNA定向克隆于表达载体,构建重组表达载体pcDNAλ,转化感受态大肠杆菌JM109,转移至含有氨苄的固体平板培育基上培育,37℃条件下培育12～16h后挑取单个菌落PCR扩增,并进一步经酶切鉴定和测序验证后提取超纯质粒用于真核细胞转染。
转染COS7细胞COS7细胞用含100mL/LFBS的DMEM培育基培育于细胞培育板上,转染前24h细胞传代,培育至细胞单层达80%时,用脂质体LipofectamineTM2000（Invitrogen）介导转染（按操作说明进行）。
分泌蛋白的纯化和SDSPAGE电泳分析转染后72h搜集COS7细胞培育上清用NiNATSpinColumn亲和层析柱纯化。
纯化的重组蛋白用120g/L分离胶进行SDSPAGE电泳分析。
抗鸡Igλ轻链mAb制备①免疫小鼠:
取3周龄雏鸡法氏囊组织,研磨,无菌获取B淋巴细胞,用2×106个细胞免疫8周龄BALB/c小鼠,每只剂量mL颈背部皮下多点注射。
共免疫3次,每次距离1～2周。
最后一次免疫后10d断尾采血分离血清,用间接ELISA检测血清效价。
最后一次增强免疫后4周,尾静脉和腹腔注射5×106B淋巴细胞超强免疫,3d后进行细胞融合。
②细胞融合:
无菌取免疫鼠脾脏,将分离的脾细胞与NS0骨髓瘤细胞按10∶1的比例在预热的500mL/LPEG2000作用下融合。
融合细胞加到含饲养细胞的96孔细胞培育板上,置于HAT选择培育基中,37℃50mL/LCO2培育箱中培育。
③阳性杂交瘤的挑选与克隆:
融合后第8天别离用间接ELISA和细胞免疫荧光法对细胞生长孔上清进行抗体检测。
用重组鸡Igλ轻链包被ELISA反映板,与细胞培育上清作用后再加入羊抗鼠IgG,TMB显色。
酶联免疫检测仪记录450nm读值。
细胞免疫荧光法（IFA）制备B淋巴细胞悬液并调整细胞密度为1×109个细胞/L。
细胞与待测上清及灭活兔血清作用,充分洗涤,加入FITC抗鼠IgG二抗,荧光显微镜观看。
别离以未免疫小鼠血清、免疫小鼠血清为阴性、阳性对照。
检测的抗体阳性孔进行持续3次有限稀释克隆化,阳性克隆的检测值高且细胞状态良好者即为挑选的单克隆细胞株。
④Westernblot检测mAb与重组鸡Igλ轻链反映的特异性:
将纯化的鸡Igλ蛋白经SDSPAGE分离,转移到硝酸纤维素膜上,用挑选的mAb对Igλ蛋白进行杂交实验,鉴定mAb与Igλ蛋白反映的特异性。
2结果
重组表达载体pcDNA3λ的构建PCR扩增λcDNA并引入HindIII和XholI酶切位点。
HindIII和XholI双酶切的λcDNA和pcDNA3载体经连接转化后,提取质粒进行双酶切鉴定,切出约700bpDNA条带,证明目的基因已经插入该载体中（图1）,DNA测序结果说明插入片段为插入方向正确的目的基因,且读码框正确。
图1表达载体pcDNAλ的酶切鉴定（略）
Fig1RestrictionenzymeanalysisofexpressionvectorpcDNAλ
1:
pcDNAλwasdigestedbyHindIII;2:
pcDNAλwasdigestedbyHindIIIandXholI;3:
DNAmarker.
细胞转染及重组蛋白的SDSPAGE电泳分析COS7细胞培育达到80%融合时,用脂质体LipofectamineTM2000将表达载体pcDNAλ和空质粒pcDNA3转染COS7细胞,37℃、50mL/LCO2孵育箱内培育72h。
搜集细胞培育上清用NiNTAspincolumn亲合柱层析纯化分泌蛋白,纯化的重组蛋白用120g/L分离胶进行SDSPAGE电泳。
pcDNAλ转染的COS7细胞培育上清有重组蛋白Igλ分泌表达,在Mr约23000位置有明显的蛋白表达条带（图2）。
图2分泌型重组鸡Igλ的SDSPAGE电泳分析（略）
Fig2SDSPAGEanalysisofthesecretedchickenIgλ
1:
SupernatantofCOS7cellstransfectedwithpcDNAλ;2:
RecombinantchickenIgλafterpurificationbyNiNTAspincolumn;3:
Proteinmolecularweighmarker.
mAb与B细胞反映的特异性IFA鉴定mAb与B细胞反映的特异性。
mAb作用后,B细胞有明显的荧光,阴性对照那么没有荧光显现（图3）。
图3IFA检测mAb与鸡B细胞反映特异性（略）
Fig3DetectionofchickenBcellsreactionwithmAbbyIFA
A:
ChickenBcellsreactedwithmAb;B:
ChickenBcellsreactedwithnegativemAbcontrol;C:
ChickenBcellsunderlightmicroscope.
mAb与鸡Igλ反映的特异性
（1）间接ELISA:
重组鸡Igλ蛋白包被ELISA反映板,与mAb进行间接ELISA反映,鉴定mAb与鸡Igλ反映的特异性。
以mAb的最大稀释倍数作为mAb的间接ELISA效价和工作浓度。
1mg/L的Igλ蛋白包被反映板测定的杂交瘤上清的间接ELISA效价:
E九、3F3别离为1∶512和1∶128。
（2）Westernblot:
鸡Igλ蛋白经SDSPAGE分离,转移到硝酸纤维素膜,别离用mAbE9和3F3对Igλ蛋白进行杂交实验,鉴定mAb与Igλ蛋白反映的特异性。
显示的阳性杂交条带说明mAb与重组蛋白Igλ能特异性反映（图4）。
图4重组鸡Igλ与抗鸡IgλmAbWesternblot（略）
Fig4WesternblotanalysisofthesecretedchickenIgλreactionwithmAb
1:
TheculturesupernatantofCOS7cellstransfectedwithpcDNAλ;2:
RecombinantchickenIgλafterpurificationbyNiNTAspincolumn;3:
ReactivityofRecombinantchickenIgλwithmAbE9;4:
ReactivityofRecombinantchickenIgλwithmAb3F3.
3讨论
分泌蛋白的合成通常起始于细胞质基质中的游离核糖体,在N端信号肽引导下进入内质网继续蛋白质合成和加工修饰,最后经由高尔基体的囊泡运输转移至细胞膜外。
鸡Igλ轻链为分泌蛋白,N端具有21个氨基酸组成的信号肽[7]。
本研究中采纳PCR技术扩增出带有信号肽序列的鸡Igλ轻链基因,限制性酶切消化后,定向克隆于真核表达载体pcDNA3,成功构建带有6×His标签、分泌表达的重组载体pcDNAλ。
重组载体转染COS7细胞,搜集细胞上清进行NiNTA亲合柱层析纯化分泌蛋白,SDSPAGE电泳分析说明有目的蛋白的分泌表达。
重组表达载体所具有的6组氨酸标记物序列编码的6组氨酸标记物亲合性好,便于重组蛋白的分离纯化。
Igλ轻链是鸡B细胞表面分子膜免疫球蛋白（mIg）的重要组分,在制备抗体时,咱们别离尝试用鸡法氏囊B细胞和可溶性抗原（重组鸡Igλ）免疫小鼠,而且从抗原剂量、接种途径、距离时刻和是不是加入佐剂等几方面进行了条件优化。
免疫效价测定结果说明,用2×106个细胞免疫小鼠,首免和二免距离1周时刻,小鼠免疫效价尽管比加佐剂的可溶性抗原低,但抗体特异性高,杂交瘤挑选成效更好,说明用全细胞免疫小鼠制备针对膜表面分子的mAb具有必然优势。
咱们别离采纳细胞免疫荧光、间接ELISA和蛋白质印迹技术对阳性杂交瘤进行挑选和鉴定,三种方式的综合运用提高了挑选成效,尤其是蛋白质印迹综合了电泳的高分辨率和免疫探测技术的灵敏性和专一性的优势,在特异蛋白质检测方面已取得普遍的应用,对鉴定mAb的特异性更为适用[8]。
【参考文献】
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