重组毕赤酵母高密度发酵生产碱性果胶酶的策略解析.docx

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重组毕赤酵母高密度发酵生产碱性果胶酶的策略解析

生物工程学报ChinJBiotech2008,April25;24（4:

635-639ChineseJournalofBiotechnologyISSN1000-3061cjb@©2008InstituteofMicrobiology,CAS&CSM,Allrightsreserved

Received:

August20,2007;Accepted:

September29,2007

Supportedby:

theNationalOutstandingYouthFoundationofChina（No.20625619,theKeyProjectofChineseNationalProgramsforFundamentalResearchandDevelopment（973program（Nos.2007CB714306,2007CB714303,theKeyProjectofScienceandTechnologyPlanningProjectofZhejiangProvince（No.2006C21117.

Correspondingauthor:

JianChen.E-mail:

jchen@

ZhaozheHua.E-mail:

huazz@

国家杰出青年基金（No.20625619、国家自然科学基金（973计划（Nos.2007CB714306,2007CB714303和浙江省重点科技项目（No.2006C21117资助。

重组毕赤酵母高密度发酵生产碱性果胶酶的策略

王芸1,华兆哲1,刘立明1,张朝晖3,堵国成1,陈坚1,2

1江南大学工业生物技术教育部重点实验室,无锡2141222江南大学食品科学技术国家重点实验室,无锡2141223浙江工业大学生物与环境工程学院,杭州310014

摘要:

重组PichiapastorisGS115表达碱性果胶酶的诱导阶段,最佳初始菌体浓度和甲醇诱导浓度分别为122g/L和20g/L,两者之间最佳比值范围是0.16~0.20g/g（甲醇/菌体浓度.在此基础上通过生长阶段甘油的指数流加,以及诱导阶段基于甲醇比消耗速率和溶氧等参数进行甲醇流加的方式,将甲醇与菌体浓度比例控制在0.171~0.195g/g之间.此时,酶活达到430u/mL,生产强度为4.34u/mL/h,实现了碱性果胶酶高效生产。

关键词:

重组毕赤酵母,碱性果胶酶,甲醇与菌体比例,流加策略

High-levelProductionofAlkalinePolygalacturonateLyaseinRecombinantPichiapastoris

YunWang1,ZhaozheHua1,LimingLiu1,ZhaohuiZhang3,GuochengDu1,andJianChen1,2

1KeyLaboratoryofIndustrialBiotechnology,MinistryofEducation,JiangnanUniversity,Wuxi214122,China

2StateKeyLaboratoryofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi214122,China

3CollegeofBiological&EnvironmentalEngineering,ZhejiangUniversityofTechnology,Hangzhou310014,China

Abstract:

Inordertoincreasetheproductionofalkalinepolygalacturonatelyase（PGLbyrecombinantPichiapastorisGS115,the

effectofcellandmethanolconcentrationonthePGLproductionwascarefullyinvestigatedbysinglefactorexperiment.Theoptimumconditionswerelistedasfollows:

thecellconcentration122g/L,themethanolconcentration20g/L,andtheratioofmethanolandcellconcentration0.16~0.20g/g（methanol/cell.Withtheglycerolandmethanolfeedingstrategies,theratioofmethanolandcellconcentrationcouldbecontrolledattherangeof0.171to0.195g/g.AndthehighestPGLactivity（430u/mLandhighestPGLpro-ductivity（4.34u/mL/hwereachieved.

Keywords:

Pichiapastoris,alkalinepolygalacturonatelyase,ratioofmethanolandcellconcentration,feedingstrategy

碱性果胶酶（Polygalacturonatelyase,PGL是一类能在碱性条件下高效分解植物组织中果胶质（由D-半乳糖醛酸以α-1,4糖苷键连接形成的直链状的

聚合物的酶的总称[1],作为一种用于纺织清洁生产的全新温和的生物精练酶制剂而备受关注。

在前期研究中,本研究室在分离筛选得到一株碱性果胶酶

636ISSN1000-3061CN11-1998/QChinJBiotechApril25,2008Vol.24No.4

J

高产菌株WSHB04-02的基础上[2],扩增出编码碱性果胶酶的基因,并成功将其表达于PichiapastorisGS115中[3]。

现今,在一定细胞密度下通过控制甲醇的浓度而实现外源蛋白高效表达成为目前生化工程的研究热点。

由于P.pastoris在以甲醇作为唯一碳源和能源表达外源目的蛋白时,细胞生长与蛋白表达共同争夺碳源和能源,导致表达效率低下[4]

。

因此,如何在最佳菌体浓度下控制最适甲醇浓度是实现外源目标蛋白高效表达的首要条件

[5−7]

。

为了进一步促进重组P.pastoris高密度发酵生产碱性果胶酶,本研究在详尽分析菌体和甲醇浓度对重组P.pastoris高效表达的基础上,总结出诱导阶段甲醇浓度和菌体浓度的最佳比值,并通过指数流加甘油和根据甲醇比消耗速率、溶氧等参数进行甲醇流加,控制甲醇浓度和菌体浓度的最佳比值,实现碱性果胶酶高效表达和生产。

1材料与方法

1.1菌株

以P.pastorisGS115为宿主,整合来自Bacillussp.WSHB04-02菌株中的碱性果胶酶的编码基因,具有His+和Mut+表型,拷贝数为2~3个,由本实验室构建并保存。

1.2培养基

1.2.1YEPD活化培养基

葡萄糖20g/L,蛋白胨20g/L,酵母膏10g/L。

1.2.2BMGY种子培养基

YNB13.4g/L,甘油10g/L,生物素0.4mg/L,0.1mol/LpH6.0磷酸钾缓冲溶液25mL。

1.2.3分批发酵培养基（BSM

85%磷酸26.7mL/L,CaSO40.93g/L,K2SO418.2g/L,MgSO4·7H2O14.9g/L,KOH4.13g/L,甘油40.0g/L,PTMl[8]4.35mL/L,25%氨水调至pH5.5。

1.2.4补料生长培养基

50%（W/V甘油（含12mL/LPTM1。

1.2.5发酵诱导培养基

100%甲醇（含12mL/LPTM1。

1.3培养方法

1.3.1种子摇瓶培养

从甘油管中接400μL菌液于25mLYEPD中,培养14h后按1%的接种量接种到BMGY中（50mL

培养基/500mL三角瓶,于30°C、200r/min培养24h。

1.3.2补料高密度发酵培养

将BMGY中菌液按10%接种量接入3L全自动发酵罐（LiFlusGMBioTRON,Korea,以25%氨水控制pH5.5,温度30°C,调节搅拌转速和通气量维持溶氧30%以上。

当甘油耗尽（DO迅速上升时,开始流加补料生长培养基。

当菌体达到一定浓度后,停止补料。

待甘油再次耗尽,继续保持基质匮乏状态约1h后,开始流加诱导培养基,诱导PGL表达。

发酵过程由发酵罐控制系统软件进行在线控制和数据采集。

1.4测定方法

1.4.1菌体干重的测定

取10mL发酵液置于离心管中,10000r/min离心10min,弃上清液,将离心菌体置于105°C,烘至恒重,称量并计算菌体干重（DCW,drycellweight,单位为g/L。

1.4.2碱性果胶酶活性的测定

参见文献[2]。

1.4.3甲醇浓度的测定

气相色谱法。

岛津GC2010型气相色谱仪,色谱柱PEG20M,30m×0.32mm×0.50μm,毛细管柱,气化室200°C,检测器（FID220°C,柱箱170°C,流速:

N240mL/min,空气450mL/min,H240mL/min。

1.4.4甘油浓度的测定

高效液相色谱（HPLC法。

Agilent1100液相色谱仪,C18反相柱,5μm,4.6mm×250mm,流动相:

70%乙腈,30%水。

流速:

0.6mL/min,柱温:

30°C,进样量:

10μL,检测器:

示差折光检测器。

2结果与讨论

2.1诱导初始菌体浓度对PGL表达的影响

维持诱导阶段甲醇浓度为6g/L,不同菌体浓度对PGL表达的影响如图1所示。

PGL酶活随着诱导时菌体浓度的增加而增加。

当菌体浓度为62.5g/L时,诱导89.5h酶活仅为102u/mL（Fig.1A,可能是由于甲醇作为碳源供微生物继续生长,导致不能高效诱导外源基因的表达;增加菌体浓度到122g/L时诱导86.5h酶活达207u/mL（Fig.1C,比菌体浓度为62.5g/L和90g/L（Fig.1B时分别提高了102%和23%。

王芸等:

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图1诱导初始菌体浓度对PGL表达的影响

Fig.1EffectofinitialcellconcentrationonPGLproductionintheinductionphase

□DCW▲PGL◇Methanol

Initialcellconcentrationswere62.5g/L（A,90g/L（Band122g/L（C,respectively

2.2甲醇浓度对PGL表达的影响

维持诱导阶段菌体浓度为122g/L,不同甲醇浓度（6、20和35g/L对PGL表达的影响如图2所示。

在一定甲醇浓度范围内（6~20g/L,增加甲醇的浓度能有效增强PGL诱导表达。

当甲醇浓度为20g/L时,PGL酶活（376u/mL和单位细胞产酶速度（0.025u/mL/g/L/h均达到最大值,比甲醇浓度为

6g/L时分别提高了81.6%和108.3%（Fig.2B。

甲醇浓度过高则导致PGL酶活和单位细胞产酶速度下降（Fig.2C。

这一结果表明,在一定的菌体浓度下过高或过低的甲醇浓度均不利于PGL的生产。

综合图1和图2的数据,列于表1中。

分析表1得:

（1诱导时较低的菌体浓度导致细胞利用甲醇生长,使得PGL生产能力受到限制;（2在一定菌体浓度范围内,过低或过高的甲醇浓度均不利于PGL的

生产;（3在一定菌体浓度下,一定范围内增加甲醇浓度对菌体浓度的比值有利于提高PGL酶活和生产强度。

上述分析表明,通过调控PGL发酵过程中底物甘油的浓度和诱导物甲醇的浓度可实现PGL的高产量和高生产强度。

2.3甲醇浓度和菌体浓度之间的最佳比例

分析表1数据发现,当甲醇浓度与菌体浓度之间比值为0.165g/g时,PGL酶活和生产强度达到最大值。

进一步研究了不同甲醇浓度与菌体浓度比值（0.056、0.1、0.165和0.3g/g时PGL的发酵生产情况以确证这一发现,结果如图3所示。

随着甲醇浓度与菌体浓度之间比值的增加,PGL产量、生产强度和单位细胞生产PGL的能力均不断增加。

但过高的比值（≥0.165g/g导致PGL产量等下降。

因此,为了实现发酵法生产PGL的高产量和高生产强度,需在

图2甲醇浓度对PGL表达的影响

Fig.2EffectofmethanolconcentrationonPGLproductionintheinductionphase

□DCW▲PGL◇Methanol

methanolconcentrationswere6g/L（A,20g/L（B,and35g/L（C,respectively

638ISSN1000-3061CN11-1998/QChinJBiotechApril25,2008Vol.24No.4

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表1不同诱导方式下细胞生长和PGL合成过程参数比较

Table1ComparisonofparametersforPGLproductionunderdifferentmodesofinduction

Modeofcultivation1

ParametersABCDEInitialDCW/（g/L

62.590122122122Averagemethanolconcentration/（g/L6.06.06.020.035.0Methanol/initialDCW/（g/g0.0960.0650.0490.160.28

FinalDCW/（g/L121.5120.7122122.6123.9MaximumPGL/（u/mL102168207376251.5Totalconsumedmethanol/（g/L

276.3

289.2

268

469.3

643.9

AveragePGLproductionrateoncell/（u/mL/g/L/h0.0150.0180.0120.0250.020YieldofDCWonmethanol/（g/g0.2140.10200.0010.003Yieldofonmethanol/（u/mL/g/L0.3690.5810.7720.8010.391PGLproductivity/（u/mL/h

1.14

1.87

2.39

4.06

2.70

Note:

1AandBwererepresentativeforinitialDCWat62.5g/Land90g/L,respectively;andmethanolconcentrationat6g/L;C,D,EwererepresentativeforinitialDCWat122g/Landmethanolconcentrationat6.0g/L,20.0g/L,and35.0g/L,respectively.

生长阶段控制底物甘油浓度使细胞快速生长到最适菌体浓度,然后控制甲醇流加速度使甲醇浓度与菌体浓度比值维持在0.165g/g左右。

图3甲醇和菌体浓度的比例对PGL产量、生产强度和单

位细胞生产PGL的能力的影响

Fig.3Effectofratiobetweenmethanolandcellconcentration

onPGLproduction,PGLproductivityandPGL

productionpercell

■

PGL/100

PGLproductivity□PGLproductionpercell

2.4控制最佳甲醇和菌体比例的底物流加策略2.4.1生长阶段甘油流加策略

采用流加速度先递增再递减的甘油流加策略[9],根据参考文献[10]计算得到菌体生长阶段甘油指数流加相关参数,列于表2。

菌体生长过程如图4所示,通过指数流加策略控制菌体在甘油中的比生长速率,细胞生长维持较高的速度,发酵33h,菌体浓度达到140g/L。

表2指数流加模型中有关参数设定

Table2Parametersinexponentialfed-batchmodel

Parametersμ（h-1YX/S（g/gSF（g/LS（g/LSetvalue

0.176

0.435

500

0.2

图4指数流加的补料分批发酵过程

Fig.4Time-courseofrecombinantP.pastorisgrowth

phaseusingexponentialfeedingstrategy

□DCW■Glycerol—Feedingrate

2.4.2诱导阶段的甲醇流加策略

在诱导初始阶段,细胞处于由甘油代谢向甲醇代谢的过渡适应期,甲醇比消耗速率不断增加[11,12];当细胞完全适应甲醇环境后,处于非生长状态下的P.pastoris甲醇比消耗速率维持恒定[13],此时DO维持在20%~30%;诱导90h后,细胞活力下降,DO上升,甲醇比消耗速率下降。

因此,作者提出以下甲醇流加策略:

（1诱导前期（0~8h以2mL/h的速度逐步

王芸等:

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提高甲醇流加速度,使培养液中甲醇浓度接近20g/L;（2诱导中期（8~90h将甲醇流加速度控制在9.7

mL/h以维持体系中甲醇浓度为20g/L;（3诱导后期（90h以后,DO上升,将流速维持在2mL/h。

采用这一甲醇控制策略,PGL发酵过程曲线如图5所示。

此时甲醇与菌体浓度比例控制在0.171~0.195g/g之间。

发酵结束时碱性果胶酶酶活达到430u/mL,生产强度达到4.34u/mL/h。

实现了碱性果胶酶的高产量和高生产强度生产。

图5甲醇流加控制下的发酵过程曲线

Fig.5Time-courseofPGLproductionunderaproposed

methanol-fedcontrolprofile

◆DCW▲PGL□Methanol—Feedingrate---qs×

1000·······DO

3结论

采用重组毕赤酵母发酵生产PGL中发现,控制诱导阶段甲醇浓度和菌体浓度之间的最佳比例是重组毕赤酵母高效表达外源基因的关键因素。

当诱导阶段起始菌体浓度为122g/L,甲醇浓度20g/L,两者之间比值为0.16~0.20g/g（甲醇/甘油浓度时,PGL

酶活和生产强度达到最大值。

为此,发展了菌体生长阶段甘油指数流加策略和诱导阶段甲醇流加策略,使甲醇与菌体浓度比例维持在0.171~0.195g/g之间,实现了高密度发酵。

碱性果胶酶酶活和生产强度分别为同类文献报道最高水平的10倍和14倍[3],实现了PGL发酵生产的高产量（430u/mL和高生产强度（4.34u/mL/h的统一。

REFERENCES

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PATE.PharmaceuticalBiotechnology,1994,1:

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诸葛斌.碱性果胶酯裂解酶、基因工程菌的构建、高表

达及酶学性质研究.江南大学博士学