降解亚硝酸根菌种的筛选.docx
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降解亚硝酸根菌种的筛选
降解亚硝酸根菌种的筛选
摘要
硝化细菌是一种好气性细菌，能在有氧的水中或砂层中生长，并在氮循环水质净化过程中扮演很重要的角色。
它们包括形态互异类型的一种杆菌、球菌或螺旋菌。
属于自营性细菌的一类。
包括两种完全不同代谢群：
亚硝酸菌属和硝酸菌属.任何水产养殖池都会产生有机废物，它们绝大部分属于养殖生物的排泄物，还有大量的饵料残余物，如果不及时将中些物质净化或排除，将会给水中的异营性细菌提供大量繁殖的机会，并排除有毒的氨。
如果水质偏向碱性，一部分的铵就会自然地转化成氨，当水中的氨浓度达到养殖生物的致死浓度时，就会给广大的养殖用户造成重大的损失。
硝化细菌是一类具有硝化作用的化能自养菌，包括硝化菌和亚硝化菌两个生理菌群，其主要特性是自养性，生长速率低，好氧性，依附性和产酸性等。
可通过NH4+→NO2-→NO3-这一过程将NH4+转化为NO3-。
能有效降低水体中氨氮及亚硝酸氮的含量，对水产养殖业及环境保护具有重要意义,对提高水产品产量,促进水产品养殖业的发展具有不可估量的作用。
关键词:
硝化细菌、亚硝化菌、转化、（关键词5个——7个）
Abstract
Nitrifyingbacteriaisanaerobicbacteria,tothewaterorinthepresenceofoxygeninthegrowthofsandandwaterpurificationinthenitrogencycleplaysaveryimportantrole.Theyincludedifferenttypesofformamongabacillus,orspirillumbacteria.Areself-employedforaclassofbacteria.Includingtwocompletelydifferentmetabolicgroups:
nitriteandnitratespeciesgenus.Anyaquaculturewillhaveapooloforganicwaste,whichthevastmajorityofthewastebio-farming,therearealargenumberoffoodresidues,inatimelymannerifwedonotpurifyorexcludesomematerialwillbedifferenttothewaterbusinesstoprovidealargenumberofbacteriatheopportunitytobreedandtoremovetoxicammonia.Ifpreferredalkalinewater,theammoniumwillbepartofanaturaltransformationintoammonia,theammoniaconcentrationwhenthewaterreachedalethalconcentrationofbiologicalculture,theculturewillbetothevastnumberofuserscausingsignificantlosses.nitrifyingbacteriaareaclassofnitrificationbacteriatoself-support,includingnitrificationbacteriaandfungiNitrosationtwophysiologicalmicroflora,itsmaincharacteristicisself-supportandlowgrowthrate,aerobic,andthemiddleclassdependentonacidity.ByNH4+→NO2-→NO3-toNH4+intheprocesstransformedintoNO3-.Caneffectivelyreduceammoniaandnitritenitrogeninwatercontent,theaquacultureindustryandtheimportanceofenvironmentalprotection.
KeyWord：
1.文献综述
1.1亚硝酸盐
目前，随着高密度集约化养殖水平的提高，亚硝酸盐引起的水质恶化越来越受到养殖界和相关学者的重视，其对水生动物的毒害作用也严重制约着水产养殖业的发展。
亚硝酸盐是生态系统中氮循环的一个天然组成部分，亚硝酸盐是水产养殖系统中一种潜在的污染物，淡水鱼类通过鳃主动吸收亚硝酸盐，导致体内亚硝酸盐的浓度过高【1】。
近年来，高密度高投饵的集约化养殖方式造成的高蛋白残饵和高含氮排泄物超越养殖水体自然菌群的代谢能力而不断沉积于池底[2]，是养殖水体中亚硝酸盐等有害物质不断增加的最主要原因【3】。
亚硝酸盐浓度的升高已成为影响水产养殖业发展的主要问题【4】，也是诱发鱼病的主要环境因子【5】，甚至可能造成大量的水生动物死亡【6】，给水产养殖业带来巨大的经济损失！
亚硝酸盐是细菌硝化作用和生态系统中脱氮作用过程的中间产物（图1），也是水产养殖系统中最常见的污染物【7】。
亚硝酸盐是由氨转变而来的，这是由亚硝化细菌完成的[8]。
亚硝酸盐是由氨转变而来的，这是由亚硝化细菌完成的，而亚硝化细菌的生长繁殖速度为18min一个世代[9]，因此，其转化的时间较短；另一类细菌，称为硝化杆菌，它可以把亚硝酸盐转变为硝酸盐[10]。
硝化细菌的生长速度相对较慢，其繁殖速度为18h一个世代，因此，由亚硝酸盐转化到硝酸盐的时间就长很多[11]。
而脱氮作用是通过许多兼性厌氧菌来实现的，它还原硝酸盐为N2与N2O、NO-和N02-等这样的中问产物[12]。
天然水环境中亚硝酸盐的浓度是非常低的，在微摩范围内，而在商业化鱼类和观赏鱼类的集约化养殖过程中，由于硝化细菌（Nitrosomassp．和M—trobactersp．）活性失调和脱氮作用过程的不平衡。
都可能引起亚硝酸盐的过量产生[13]，水中亚硝酸盐的浓度甚至可达1mM（50mg·L）或更高[14]。
近年来，随着水资源污染越来越严重，养殖水体中的亚硝酸盐、氨氮含量越来越高，这已经逐渐成为困扰水体养殖者的一个心病，如何解决水体中这些物质的含量呢？
通过了解我们知道，并不是有亚硝酸根存在就会使鱼类、水草中毒，而是水体中的亚硝酸根含量超标，才会引起亚硝酸根在鱼体内累积，当人们误食入亚硝酸根中毒的鱼，从而导致人类亚硝酸根中毒[15]。
而亚硝酸根是如何产生的呢？
这是由于水体中的氨不能够及时被转化，从而转换成了亚硝酸盐，并在水体中累积，通过食物链进入我们人体。
由于在水产的高密度养殖过程中必须连续地充氧以保证水中一定量的溶解氧，厌氧反硝化细菌的反硝化作用就不能充分地发挥．好氧反硝化细菌作为一种新型的脱氮细菌而备受关注．细菌好氧反硝化与传统的细菌厌氧反硝化相比具有独特优势：
第一，细菌在有氧条件下进行反硝化，使硝化和反硝化作用能够同时进行，硝化反应的产物可直接作为反硝化作用的底物，避免了硝酸根、亚硝酸根的积累对硝化反应的抑制，加速了硝化．反硝化的进程，且反硝化释放出的OH一（应该是右上角标）可部分补偿硝化反应所消耗的碱，使系统中pH值相对稳定；第二，与传统的化学自养硝化菌不同，好氧反硝化菌（多数也是异养硝化菌）可将氨在好氧条件下直接转换成气态的产物，且反应可由单一反应器一步完成，降低了操作难度和运行成本；第三，大部分好氧反硝化菌能很好地适应厌氧（或缺氧）周期变化，在有氧／缺氧交替时具有生态生长优势，其生长速度快、产量高、要求的溶解氧浓度较低、能在偏酸性环境中生长，细菌培养投资少，且反应速度快，反硝化彻底，适合治理大面积氮污染水域[16]。
传统理论认为反硝化细菌是异养厌氧的，但到目前为止除了发现好氧反硝化细菌外，还发现存在自养型反硝化菌，能利用一些无机物在氧化过程中释放出来的能量将硝酸根还原，发挥反硝化作用．如备受关注的脱氮硫杆菌（Thiobacillusdenitrifican）[17]．异养反硝化的研究细致深入，各种工艺设计参数较多，但需要投加有机物，提高运行成本的同时也容易造成二次污染，使它的应用受到限制．而自养反硝化存在2个优势：
第一，不需要投放有机物作为碳源，节省开支；第二，产生极少量的污泥，能将污泥处理量降低到最小．自养反硝化又为生物脱氮开辟了一条新的途径。
实践证明[18],生物方法能够有效的解决水体中存在的这些问题。
即经济又实用，而且能达到无二次污染。
还能丰富水体中的微生物种群环境，还能丰富水草的肥料，进而为鱼群创造大量的食物[19]。
1.2反硝化细菌作用机理
反硝化细菌是指一类能将硝态氮（NO-3）还原为气态氮（N2）的细菌群,它们分散于10个不同的细菌科中,已知的有50属以上的微生物能够进行反硝化左右,自然界中最普遍的反硝化细菌是假单胞菌属,其次是产碱杆菌属。
根据已有的讲究结果,反硝化吸进的反硝化作用分4步进行,即:
NO-3一N0-2一N0一N20一N2,分别由硝酸还原酶、亚硝酸还原、NO还原酶、N20还原酶催化[3].传统观点认为反硝化作用的一个重要条件是厌氧环境，在O2和NO3-,-同时存在时，反硝化菌首先利用O2作为最终电子受体，只有溶解氧浓度接近零时才开始发挥反硝化作用。
1.3研究意义
从生物工程学筛选菌种的角度对硝化细菌进行研究，寻找一种最高效的硝化细菌，对促进生物脱氮理论的研究有一定的参考意义。
2.实验部分
2.1实验药品及器材
2.1.1实验药品
表1
药品及仪器厂址
亚硝酸钠北京化工厂
蛋白胨北京奥博兴生物技术有限责任公司
牛肉膏北京奥博兴生物技术有限责任公司
葡萄糖
琼脂
氯化钠
氢氧化钠
75%乙醇
碘液
结晶紫试剂
翻红试剂
高压灭菌锅
恒温培养箱
无菌操作台
PH试纸
北京益利精细化学品有限公司
海南省琼海市长青琼脂加工厂
天津市博迪化工有限公司
沈阳市新华试剂厂
沈阳市新华试剂厂
实验室提供
实验室提供
实验室提供
上海申安医疗器械厂
金坛市富华仪器有限公司
沈阳市医疗器械工厂
天津塘沽澳科精细化工有限公司
蛋白胨牛肉膏葡萄糖琼脂氯化钠亚硝酸钠氢氧化钠75%乙醇碘液结晶紫试剂番红（以上的纯度，厂家）试剂KH2PO3蒸馏水
2.1.2实验器材
高压灭菌锅恒温培养箱无菌操作台烘干箱显微镜（厂家）
试管三角瓶烧杯电子天平PH试纸（1—14）培养皿吸管酒精灯恒温培养箱药匙接种环玻璃棒载玻片
2.2实验原理
试验采用富集培养的方法确定细菌的样本。
富集培养主要是利用不同的微生物生命活动的特点的不同，认为的控制环境条件，仅使适合于改条件的微生物旺盛生长，使其在菌群中的数量显著增加，成为优势微生物，从而更有利于人们分离自己所需的特定微生物.富集条件可根据所需分离的微生物的特点从物理、化学、生物等多个方面进行选择，如温度、PH、氧气、营养等。
硝化细菌大部分属于无机化能自养菌，生长周期长，生长极其缓慢，而伴生的异养菌却生长迅速.为使自然条件下生长劣势的硝化细菌转化为生长优势菌，确定以含亚硝酸钠的肉汤培养基进行富集培养，限制其他菌的生长、繁殖。
2.3实验方法及步骤
2.3.1培养基的调配
称取蛋白胨1g，牛肉膏0.5g，琼脂1.5g，NaCl0.5g，葡萄糖2g，（加没加进亚硝酸根？
）水91ml，NaNO20.2g调节PH为7.6，放到高压灭菌锅内121。
C，灭菌20分钟。
2.3.2接种
将灭过菌的培养基（不倒板？
）在无菌试验室的无菌操作台上接种,菌种来源是石油二厂的活性污泥、校内实验楼后的小河沟内的淤泥和姚秀清老师实验室提供的硝化细菌，分别接种后培养24小时。
2.3.3扩大培养
挑选培养基表面具有代表性的单菌落重新接种到试管斜面（这个培养基是什么配方）,放到恒温培养箱中27。
C再次培养12小时。
2.3.3制作观察涂片
挑选试管中（一个试管里还有几种吗？
）代表性极强的菌落，用接种环（灭菌不？
冷却不？
）挑去一点，在载玻片上加一点蒸馏水轻轻研磨，然后放到酒精灯上慢慢烤干，等载玻片干燥后用结晶紫试剂进行除染（滴加多少染液，染多久）在次放到酒精灯上烤干，（不用水洗？
）用碘液进行媒染，等待2分钟，等载玻片自然干燥后（不用水洗？
），用75%的乙醇进行脱色处理，（脱色多少时间？
脱到啥程度？
）（不用水洗？
）然后再用酒精灯将载玻片烤干，最后用番红试剂复染（染多久？
）（不用水洗？
）.等载玻片干燥后就可以反倒显微镜下进行观察了。
2.3.4观察结果
将制作好的涂片放到显微镜下观察,用5*40的进行初步观察,后换10*40的在次观察。
经培养得出由石油二厂提供的污泥所接种长出的菌落，长势良好，菌落大，颜色淡黄.又姚秀清老师实验室接种的硝化细菌长势良好，菌落大小适中，颜色略白.又校内实验楼后小河沟接种的菌落长势不太好。
2.3.5纯化
将培养基的浓度改为0.3g/L,灭菌过后将培养过的菌种接种到新的培养基上.等待24小时后,再次进行扩大培养。
2.3.6观察结果
挑取代表性的单菌落制作涂片，将制作好的细菌观察涂片放到显微镜下观察。
可以看到显微镜下,涂片上是杆状的细菌,红色,说明该菌为革兰氏阴性菌。
2.3.7多次纯化
再次改变培养基内的亚硝酸钠的含量为0.1g/,进行接种、培养、染色观察、改变培养基的亚硝酸钠含量为1.5g/L接种、培养、染色观察。
2.3.8菌株最适合培养基的测定
将筛选好的硝化细菌，接种到加入不同量亚硝酸钠的培养基（固体的？
还是液体的？
）上，27。
C恒温培养12小时，稀释平板法测定菌株的菌体浓度。
2.3.9菌株最适合培养温度的确定
分别设定28。
C、30。
C、33。
C、37。
C、40。
C、45。
C（温差怎么不是相等的？
）等温度下，在上面选择的最适合培养基培养24小时，观察细菌的生长情况和菌落数量，得出菌体的最适合生长温度，每次处理重复3次。
2.3.10菌体最适合培养时间的确定
设10小时、20小时、50小时、72小时、100小时、120小时等时间剃度，在最适合温度最适合培养基下培养，用血球计数板测定所筛选的菌株在最适生长条件下菌体的最高浓度，每次处理重复3次。
结果与讨论
3.1硝化细菌
硝化细菌是一种好氧细菌，能在有氧气的水中或砂砾中生长，并在氮循环水质净化过程中扮演着重要的角色。
它们包括形态互异类型的一种杆菌、球菌以及螺旋型细菌，属于绝对自营性微生物的一类，包括两个完全不同代谢群：
1.亚硝酸菌属（nitrosomonas）：
在水中生态系统中将氨消除（经氧化作用）并生成亚硝酸的细菌类；亚硝酸菌属细菌，一般被称为“氨的氧化者”，因其所维生的食物来源是氨，氨和氧化合所生成的化学能足以使其生存。
2.硝酸菌属（nitrobacter）：
可将亚硝酸分子氧化再转化为硝酸分子的细菌类。
硝酸菌属细菌，一般被称为“亚硝酸的氧化者”，因其所维生的食物来源是亚硝酸（但也不一定是亚硝酸，其它有机物亦有可能），它和氧化合可产生硝酸，所生成的化学能足以使其生存。
因这些硝化细菌能将水中的有毒的化学物质（氨和亚硝酸）加以分解去除，故有净化水质的功能。
不过需要注意：
硝化细菌在水质ph中性、弱碱性的环境下发挥效果最佳，在酸性水质中发挥效果最差。
3.2菌种的确定
由于硝化作用必须是由硝化细菌和亚硝化细菌共同完成，而两者对营养物质的要求又非常严格.亚硝化细菌只能利用氨产生亚硝酸,是硝化细菌进行通话作用所必须的能源物质.我们知道亚硝酸对人体来说是由害的,亚硝酸同一些金属离子结合以后可以形成亚硝酸盐,而亚硝酸盐又可以和胺类物质结合,形成具有强烈致癌作用的亚硝酸胺。
3.3影响细菌硝化作用的因素
影响细菌硝化作用的因素主要为PH、温度、有机物、亚硝酸盐、光照和自由氨等。
3.3.1PH影响
环境的pH必定会影响到微生物的生长于代谢，因为pH值是影响生理生化反应的重要影响因子，环境的pH值的变化引起微生物细胞表面特性的变化，从而引起细胞体生理生化过程的变化，最终导致微生物代谢与生长的变化。
pH是影响硝化作用的重要环境因素之一，在pH中性或微碱性条件下，硝化过程迅速，适宜的pH是7.3～8.5。
于亚硝酸细菌会选择此范围的上限，其最佳pH是7.6～8.4，这时硝化速率达到最大。
pH超越这一最佳范围时，硝化速率将降低，当pH<7.0时，亚硝酸细菌生长缓慢.pH<6.5时，亚硝酸细菌的生长将受到抑制.PH<6.0时，系统中的硝化作用将会停止.细菌的最佳pH为7.3～7.5。
3.3.2温度影响
温度对硝化细菌的生长和硝化速率有较大的影响。
一般的硝化细菌是中温生长菌，其适宜的温度范围是25～30℃。
温度低于25℃，硝化细菌的生长缓慢，低于10℃以下时硝化细菌的生长和硝化作用明显减慢。
温度高于30℃时，硝化细菌的生长也减慢，高于35℃，则对硝化细菌的酶系具有破坏作用，硝化细菌的生命将受到潜在的威胁。
所以在任何情况下都应注意保持硝化反应器温度的稳定性，以避免极端温度和瞬间变化的温度给硝化作用带来不良的影响。
对于硝化细菌的一般培养温度建议在25～30℃为宜。
3.3.3有机物
硝化细菌属于典型的自养细菌，有机物对于硝化细菌是否具有毒害作用是人们普遍争论的问题.亚同认为多种有机物对硝化作用有抑制作用。
来越多的研究表明，有机物对硝化细菌的影响主要是因为有机物的存在刺激异养细菌迅速生长，从而使异养细菌与硝化细菌竞争溶解氧、氨和微量营养物质，使得硝化细菌的生长受到限制，而有机物本身并不直接影响硝化细菌的生长与硝化作用。
3.3.4亚硝酸钠
由于培养基内加入亚硝酸钠量的不同，所以培养出的菌落也不尽相同，低浓度的2份培养基上的菌落个数较多，但是菌落较小，颜色淡黄，高浓度的2份培养基尽管菌落数少，但是菌落很大，且菌落厚实，颜色略白。
见表2、表3。
表2菌落比较
亚硝酸钠含量菌落个数
菌落颜色
0.2mg/L
0.5mg/L
1.0mg/L
1.5mg/L
7
12
5
1
淡黄
淡黄
略白
略白
表3单因素实验数据
药品
第一次
第二次
第三次
第四次
牛肉膏g
蛋白胨g
琼脂g
水ml
葡萄糖g
亚硝酸钠g
NaClg
PH
1.0182
0.3452
1.7075
90
5
0.3
0.5147
7.6
1.0185
0.3623
1.8532
91
5
0.5
0.5201
7.6
1.0213
0.3523
1.8647
90
5
1
0.5523
7.6
1.0154
0.3265
1.8523
90
5
1.5
0.5362
7.6
3.3.5光照
由于有些亚硝化细菌对近紫外波段的光很敏感，所以在培养的时候需要用报纸将接种后的培养皿密包，以免亚硝化细菌被近紫外波段的光照射导致死亡。
3.3.6溶解氧（DO）
在活性污泥硝化系统中，大多数学者认为溶解氧应控制在1.5～2.0mg/L，溶解氧值偏小，一方面加剧了活性污泥的内源呼吸，造成活性污泥的大量消耗，另一方面高溶解氧对反硝化反应不利，能耗也增大，降低了设备运行的经济性。
溶解氧值偏小时硝化作用将趋于升高。
HANAKI研究表明，低DO下，氨氧化细菌增殖速率加快，补偿了由于缺氧造成的代谢活动下降，使得整个硝化阶段中氨氮氧化未受到明显抑制。
LAANBROEK研究进一步表明在缺氧状态下，亚硝酸大量积累是由于氨氧化细菌对DO的亲和力较亚硝酸细菌强。
但ECKENFELDE提出DO必须在2mg/L以上。
也有人提出DO不能低于0.5mg/L，还有人提出对氨氧化细菌和亚硝酸细菌有所差异，DO分别为1.0、2.0mg/L。
而MICHAEL与RICHARD在总结大量文献的基础上通过对各种因素及双底物限制动力学进行分析得出结论：
在较高的平均细胞停留时间的（MCRT）的条件下，DO在0.5～1.0mg/L就可完成硝化作用，MCRT较低时完全硝化则需要较高的DO。
而STENSTROM认为能发生硝化作用的最低DO约为0.3mg/L。
王歆朋等发现低的DO（0.8mg/L）会对硝酸菌的生长酶系产生抑制作用，而对亚硝酸细菌的生长酶系产生促进作用。
总之为了确保硝化作用有效进行，最好硝化系统中DO保持1.0~1.5mg/L。
3.3.7自由氨
氨氮的升高导致亚硝酸氮的累积，这将严重抑制亚硝酸转化为硝酸。
SHAHER曾报道：
氨氮在5～10mg/L，没有亚硝酸积累，他发现随着氨氮浓度由7.5mg/L→10mg/L→17mg/L→25mg/L→35mg/L→45mg/L的逐渐升高过程中，亚硝酸积累呈增大趋势。
AUTHONISEN在实验中注意到高浓度的FA对硝化反应有抑制作用，并影响到硝化产物。
还有一些实验表明，高浓度的氨氮所造成的亚硝酸的积累并不稳定，时间一长系统中亚硝酸浓度和亚硝化比率均会下降，硝酸浓度增大，这说明硝酸菌对氨氮产生的抑制会逐渐适应。
溶解氧和氨的浓度以及pH是影响硝化反应速率的重要环境因素。
有国外文献报道，高浓度的氨可以选择一个新的硝化菌群，高氨引起的菌群的变化是逐渐发生的。
这说明，硝化细菌能更好的适应高氨环境。
尽管最初系统中的硝化细菌在高氨的环境中也是相当活跃的，但更能适应这一环境的硝化细菌逐渐成为这个系统的主体。
在正常pH范围的情况下，pH的改变不会导致菌群种类发生改变，但是当pH低于6.0或高于8.5时就会引起硝化细菌种类会发生变化。
3.4菌株最适合生长培养基的测定
表4
亚硝酸钠浓度
菌液浓度
0.0mg/L
0.3mg/L
0.5mg/L
1.0mg/L
1.5mg/L
0
2.57
105
2.71
105
2.10
105
1.54
105
可以得出菌在培养内亚硝酸钠的浓度为0.5mg/L生长的最好，而培养基内不加亚硝酸钠则没有菌株长出，说明菌株需要亚硝酸盐诱导才能生长。
3.5菌株最适生长温度的测定
图1细菌生长曲线
细菌的生长曲线表现为4个时期：
迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期。
由图1可以看出，细菌的指数生长期，培养50小时的时候，生长浓度达到了4.0
105/mL，72小时达到4.2
105/mL的最高生长浓度，100小时维持同样水平，说明有一个相对较长的稳定期，100小时后随着培养时间的继续延长，细菌的细胞浓度逐渐降低，进入了衰亡期。
结论
采用在富集培养补加亚硝酸盐和平板分离法，较易从自然界中分离到硝化细菌。
加富培养为硝化细菌的生长繁殖创造了有利的条件，使它较其他种类微生物生长快。
在分离前用无菌玻璃珠充分振荡富集液，分离效果较好。
这是因为硝化细菌具有生长在固体表面的习性，即使在液体培养基中，它们也往往附着在培养基中固体颗粒或器壁上。
用无菌玻璃珠振荡富集液可使附着的硝化细菌从附着物上游离下来，提高细胞的自由分散度。
硝化细菌大多数是专性化能无机营养菌，生长缓慢，伴生的异养细菌生长迅速，超过硝化细菌，而且硝化细菌代时长，30℃培养几天才能长成菌落，菌落较小，直径约为100
，比常见的细菌单菌落小得多，肉眼不易观察，这都给分离工作带来了不便。
根据
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