抗体纯化大全.docx

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抗体纯化大全

抗体得纯化 

第一节　硫酸铵沉淀法 

基本原理 

ﻫ硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩与部分纯化蛋白质、用此方法可以将主要得免疫球蛋白从样品中分离,就是免疫球蛋白分离得常用方法。

高浓度得盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子,从而破坏蛋白质表面得水化膜,降低其溶解度,使之从溶液中沉淀出来、各种蛋白质得溶解度不同,因而可利用不同浓度得盐溶液来沉淀不同得蛋白质。

这种方法称之为盐析。

盐浓度通常用饱与度来表示。

硫酸铵因其溶解度大,温度系数小与不易使蛋白质变性而应用最广。

 ﻫ

试剂及仪器ﻫ

·组织培养上清液、血清样品或腹水等

·　硫酸铵（NH4）SＯ4 

·　饱与硫酸铵溶液（SAS）

ﻫ·蒸馏水

ﻫ·PBS（含0。

2ｇ／L叠氮钠）（见附录一）ﻫﻫ·透析袋

ﻫ·超速离心机ﻫﻫ·　ｐH计ﻫﻫ·　磁力搅拌器 

ﻫ实验步骤 ﻫﻫ以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体得硫酸铵沉淀。

各种不同得免疫球蛋白盐析所需硫酸铵得饱与度也不完全相同、通常用来分离抗体得硫酸铵饱与度为33％—５０%。

ﻫ一、配制饱与硫酸铵溶液（ＳＡＳ）ﻫ

将７6７g（NＨ4）2SO4边搅拌边慢慢加到1升蒸馏水中。

用氨水或硫酸调到pH7、0。

此即饱与度为100%得硫酸铵溶液（４。

1mol/Ｌ,25°C）;ﻫ

其它不同饱与度硫酸铵溶液得配制见表1; ﻫﻫ二、沉淀

ﻫ1、样品（如腹水）20000´ｇ离心3０　ｍiｎ,除去细胞碎片;ﻫ

２、保留上清液并测量体积;ﻫ

3、边搅拌边慢慢加入等体积得SAＳ到上清液中,终浓度为1:

1（ｖ/v）;

4、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或搅拌过夜（4°Ｃ）,使蛋白质充分沉淀。

ﻫ三、透析

1、蛋白质溶液1000０´g离心30　min（4°C）。

弃上清保留沉淀;

2、将沉淀溶于少量（10-20ml）PBS—0、2g／L叠氮钠中、沉淀溶解后放入透析袋对ＰＢＳ-０、２g/L叠氮钠透析24-４8小时（4°C）,每隔３-６小时换透析缓冲液一次,以彻底除去硫酸氨;ﻫﻫ3、透析液离心,测定上清液中蛋白质含量。

应用提示 ﻫ

一、先用较低浓度得硫酸氨预沉淀,除去样品中得杂蛋白、

1、边搅拌边慢慢加SAS到样品溶液中,使浓度为0、5:

1（v/v）;

ﻫ２、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌６小时或过夜（4°Ｃ）;ﻫ

3、3000´g　离心30ｍiｎ（４°C）,保留上清液;

4、上清液再加ＳＡS到0、5:

1（v／v）,再次离心得到沉淀。

将沉淀溶于PBS,同前透析,除去硫酸氨;

５、杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时,用预沉淀除杂蛋白就是非常有效得;

ﻫ二、为避免体积过大,可用固体硫酸氨进行盐析（硫酸氨用量参考表１）;

ﻫ三、硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用,可得到更进一步纯化得抗体。

 ﻫﻫ参考文献 ﻫ

1、Ｂｕrd,　R、S。

Rａymonｄ,　C、S.,Ｒａｔz,　Ｃ。

　Ａ　andＤunn,　D.L（1993）　Aｒａpｉdprocedｕrefoｒｐuｒｉｆｙing　ＩｇＭmoｎoｃlonalaｎtibodiesｆroｍmｕrine　aｓｃitｅsusing　aDＥAE　–dｉsk、Hybridｏma　１2,13５.ﻫﻫ2、T、Ｇ。

库珀着,徐晓利主译《生物化学工具》人民卫生出版社出版（１980）,353。

ﻫ（夏泉）

表1、室温下硫酸氨饱与度由起始浓度（Ｓ1）提高到终浓度（S2）时需加硫酸氨得量（g/L）ﻫﻫﻫﻫﻫ０%

10％

20％ﻫ

２5％

ﻫ30％ﻫ

33％ﻫﻫ35%ﻫ

4０％ﻫﻫ45％ﻫﻫ50%ﻫ

55％

60%

ﻫ65%

ﻫ70％

７5％ﻫﻫ80％

ﻫ90％

５61１414４17619６20９２4327731３　35139０43０　4７251656１　6６2７67

ﻫ5786　11８1３715０1８３２1625１2８8　3263６54064４9　4９４　５９2649ﻫ

29　59789１12３１55　18９２2526２300３40382424５206１9

30　49619３１251５81９3　230２67　3073４8　39048558３ﻫﻫ19　3０629412７１62　198　２３527３31４　356449５4６ﻫ

1243７4１０7　1421772１4２5229２　３３3４２65２2

ﻫ31639４12９164200　２３8278　319411506ﻫ

３1　639７132　168205245285375４69

3２65　9913４171２10250３3９431

3３66１０1137176２1４　302　３92ﻫ

3３６７103　１41１792643５3

ﻫ3４6910５143227314

３4701071９027５ 

35　721532３7

ﻫ36115　１9８ﻫ

771５7

ﻫ79 ﻫﻫﻫ第二节DＥAE离子交换层析法 ﻫﻫ基本原理 

ﻫ离子交换层析就是蛋白质纯化得常规方法,与硫酸氨沈淀法联合使用可以非常有效地纯化抗体。

ﻫDＥＡE就是一种阴离子交换剂,当蛋白质溶液通过DEAE柱时,带负电荷得蛋白质可以被DEAＥ吸 ﻫﻫ附,带正电荷得蛋白质则不被吸附而随溶液流出。

纯化抗体时可选择pH值大于待纯化抗体等电 

ﻫ点得缓冲液,此时抗体带负电荷可以通过电价键吸附于DEＡE离子交换剂上,然后用增加盐浓度 ﻫ

得方法将抗体洗脱。

可以用连续梯度法洗脱,也可以用不连续梯度（分段洗脱）法洗脱。

本文以

ﻫ腹水中ｍAb得纯化为例来介绍此方法。

 ﻫ

试剂及仪器 ﻫ

·抗体样品（小鼠腹水或经硫酸氨沉淀得抗体）

·DEAE离子交换剂（阴离子交换剂）ﻫ

·层析柱（2、５ｃｍÆ´20cm）

ﻫ·　缓冲液A:

２5mmol/LTｒｉs—ＨClｐH８、8+35mｍｏl　／ＬNaCl

·缓冲液B:

2５mmol/LTriｓ—ＨClｐH8.8　+70mmｏl/LNaCl

·缓冲液　C:

25mmoｌ／LTris—HCｌｐH　8.8+50０ｍmｏl/ＬNaCl 

ﻫ·缓冲液D:

25mmol/L　Trｉs-HCl　ｐＨ8.8 

·PＢS（见附录一）

ﻫ·透析袋（MWCＯ１0000）

·磁力搅拌器

·蠕动泵与部分收集器ﻫ

·　紫外检测仪

·梯度发生器

·电导仪ﻫ

·pH计ﻫ

·　离心机 

实验步骤 ﻫﻫ整个层析过程最好在4°Ｃ　进行,可在冷室操作; 

1、抗体样品对缓冲液B　透析过夜（4°C）;

ﻫ2、按说明处理DEＡＥ离子交换剂。

然后用缓冲液Ａ平衡、用2０倍体积缓冲液A洗交换剂,可用过滤或离心法反复洗到流出液得电导率等于缓冲液Ａ;

ﻫ3、将处理好得ＤEAE离子交换剂悬浮在缓冲液A　中,装入层析柱、ﻫﻫ4、用等体积得缓冲液D　稀释透析过得抗体样品,使之与缓冲液A　得离子强度一致;ﻫﻫ5、稀释后得样品10　000´g离心10ｍin（4°C）,除去沉淀变性得蛋白质;ﻫﻫ6、层析柱与蠕动泵、部分收集器及紫外检测仪连接;

ﻫ７、抗体样品以１ｍl/min　流速上柱,然后用缓冲液A洗柱1ml/ｍin,将未吸附得蛋白质洗出。

直到流出液在280ｎm得吸光度小于0.05;

8、吸附得蛋白质,用连续增加NaCl得浓度来洗脱。

用线性梯度缓冲液（35-500mmol／LNaCl）或分段缓冲液（3５、70、１40、280、50０　ｍmｏｌ／ＬNａCl）洗脱、流速1ml/min　,分部收集洗脱液2ml/管　（图2-４—１）;

9、椐紫外检测结果,将抗体峰部分合并。

装入透析袋对PBS（含0、2g/L叠氮钠）4°C透析或冷冻（视抗体得稳定性而定）;

10、DＥＡＥ离子交换剂可按照商品说明再生使用。

图2-４-1DEAＥ离子交换柱层析纯化小鼠IｇG 

流速:

1ｍｌ/miｎ样品:

0、５ml腹水 ﻫ

检测方法 ﻫ

1、大部分小鼠得单克隆抗体IgG可在５０—200mmol/LNaＣｌ浓度之间洗脱。

ﻫ

2、可用SDS—PＡＧE　或定量免疫学方法（RIA、EＬIＳＡ）检测各部分洗脱液得抗体存在及效价。

ﻫ实验要点及说明

１、要得到满意得分离结果,每mlＤＥAE　离子交换剂所加样品中蛋白质总量最好不超过1０mg。

ﻫ2、用经硫酸铵沉淀初步纯化得抗体代替小鼠腹水作为样品,可得到更好得纯化结果。

ﻫ

3、如抗体与DEAＥ离子交换剂不能有效得结合,可将起始缓冲液得pH提高０、1个单位,直到可以有效结合为止。

ﻫ4、如果没有合用得蠕动泵与部分收集器,可用手工上样与收集。

洗脱液每管收集0。

5-2ｍl　,然后用分光光度计测定各管2８０nm波长得吸光度值。

5、该方法可按比例扩大。

用适合于高流速得大柱与相应得交换剂来纯化大量得蛋白质样品。

 ﻫ

ﻫﻫ参考文献ﻫﻫﻫﻫ1、Cｏｒｔhiｅr,G、,Bｏsｃhetti,　Ｅ。

ａndCharｌey-Pouｌain,　J.（1984）ＩmproｖedmｅthodforIgG　pｕrificatioｎ　ｆroｍvａriｏusａnimａlspecieｓｂy　ioｎexchange　cｈromaｔoｇrａpｈyJ。

Iｍmuｎｏl。

Ｍeth、６6,　75-79。

2、张保真编译西安医科大学出版（1986）《免疫组织化学理论与技术》　69—７1。

ﻫﻫﻫ（夏泉）

ﻫ

第三节羟磷灰石层析纯化抗体 

基本原理 

ﻫ羟磷灰石［Ca１0（PO４）６（OＨ）2］吸附蛋白质得机理,通常认为与其晶体表面得Ｃa2+与ＰＯ4３－两种基团相关。

因为带电基团紧密排列于晶体表面,可能通过偶极子之间得相互作用来吸附蛋白质。

样品被吸附剂吸附后,用适当得洗脱液（较高浓度得盐溶液）冲洗,可使之解析。

解析下来得物质在流经层析柱得过程中向前移动,遇到前面新得吸附剂可再被吸附、在反复得吸附—解析—再吸附—再解析得过程中,由于待分离物质与吸附剂之间得吸附能力不同,它们沿洗脱液流动方向移动得速度也不相同,所以在洗脱过程中各组分便会由于移动速度不同而被分离。

抗体与其它蛋白质一样可以用羟磷灰石吸附柱层析进行纯化。

试剂及仪器 ﻫ

·抗体样品（腹水或培养上清液）

ﻫ·　羟磷灰石（Ｈydｒｏxylａpａtite有售）ﻫﻫ·层析柱（２。

5cmÆ´20　cm）ﻫﻫ·　吸附缓冲液:

２0mmｏｌ/Ｌ　磷酸钾缓冲液pH6.8　含30ｍmｏl/LNａCl

·洗脱缓冲液:

500mmｏl／L磷酸钾缓冲液ｐＨ6。

8含30ｍmol/LNａCl 

ﻫ·PＢS（见附录１）

·透析袋（MＷCO100０0）ﻫ

·　磁力搅拌器ﻫ

·蠕动泵与部分收集器

·紫外检测仪ﻫﻫ·　梯度发生器

ﻫ·离心机 

ﻫ实验步骤 ﻫﻫ1、羟磷灰石柱得准备:

将羟磷灰石悬浮于吸附缓冲液中,使之充分水合后装柱、用1０´柱体积得吸附缓冲液洗柱;

ﻫ２、样品得预处理:

含抗体得样品先在4°Ｃ对吸附缓冲液透析过夜或用该缓冲液10倍稀释,再将透析或稀释后得样品4000´g离心1５min（4°C）;

ﻫ３、仪器安装:

将蠕动泵、紫外检测仪与部分收集器与层析柱连接;ﻫ

4、上样:

将样品上清液以1ｍl/miｎ得流速加到柱上,然后用20´柱体积得吸附缓冲液洗柱;ﻫﻫ５、抗体得洗脱:

提高磷酸盐得浓度可以将抗体洗脱、常用得方法有两种:

一种就是用梯度发生器进行线性浓度梯度洗脱,浓度为2０—５00ｍmoｌ/L得磷酸钾缓冲液;另一种方法就是用不连续浓度梯度洗脱,例如可以用３5、70、1４0、280与500mmol/Ｌ得磷酸钾缓冲液依次分段洗脱。

收集洗脱液２ml/　管（图２-４－2）;ﻫ

6、合并洗脱液中含抗体得部分（见下面检测）对ＰBS透析。

根据抗体得稳定性4°Ｃ或冷冻防腐（0。

2g/L叠氮钠）保存; ﻫﻫ图2—4-２羟磷灰石柱层析纯化单克隆抗体ＩgGﻫﻫ流速:

１ml/ｍin样品:

腹水1mｌ ﻫﻫ检测方法 

ﻫ1、单克隆抗体IgG通常在２00—400mmol/L磷酸钾浓度之间洗脱。

ﻫ2、可用ＳDS—PＡGE　或定量免疫学方法（ＲIＡ、ELＩSA）,检测各部分洗脱液得抗体。

 ﻫ

应用提示 

１、每10０ml羟磷灰石可吸附大约500mｌ细胞培养上清液或3ml得腹水或血清中所含得抗体。

ﻫﻫ2、使用羟磷灰石柱较适合得　柱长/直径可以在5/１—15/1之间（典型尺寸:

２。

5ｃmÆ´2０cm　柱长）。

3、在吸附过程中应避免有对钙得亲与力大于磷酸盐得物质（如EDTA与柠檬酸等）得存在,以免减少羟磷灰石得吸附容量。

ﻫﻫ４、用过得羟磷灰石柱可以用吸附缓冲液平衡再生后重复使用。

或加入甲苯（0、03％,v/v）或叠氮钠（０、2g/L）储存。

ﻫ5、如果没有合适得蠕动泵与部分收集器,可手工加样与收集洗脱液2mｌ　/　管,并用分光光度计

测定各管在　28０nｍ波长得吸光度。

ﻫ6、与本方法类似得吸附与洗脱过程也可用来纯化其它蛋白质。

ﻫ参考文献 

Bukｏvsｋy,J。

andKenneｔt,R、H、（１987）　Sｉｍpleandrａpidpuｒiｆｉcatioｎ　ｏfmｏｎoclonａlantｉｂｏdiesｆroｍceｌlｃｕltuｒｅsupernaｔanｔａndａsciｔesfｌuｉｄsbyhydroxyｌapａtiｔecｈrｏmaｔogｒａpｈyｏn　anａlｙｔｉcaｌand　prepaｒatｉvescalｅs。

Hｙbridｏma6,21９—２28.

（夏泉） ﻫ

第四节抗体得辛酸纯化法 ﻫ

基本原理 ﻫﻫ在人、羊或兔血清或含有IｇG得培养上清中及小鼠得腹水中加入辛酸,可与其中大部分蛋白质形成沉淀,而对ＩｇG得性质没有影响,因此就是纯化ＩgG得有效途径。

沉淀后经离心即可获得IgG。

辛酸沉淀法与硫酸铵沉淀法比较其主要优点为可减少聚合物得形成,但与其相同,所得得抗体纯度不够,还需用其它方法以进一步提高其纯度。

ﻫ试剂及仪器 

ﻫｓ　腹水或细胞培养上清

ｓ0。

06mol/L醋酸钠缓冲液（pH4、0）（见附录１）

ﻫｓ1NHCl

ﻫs辛酸（正－八碳酸,n-ｏｃtａnoic　ａｃid）

ﻫs1NNaOHﻫﻫｓPBS（见附录）ﻫ

s透析袋（MＷＣO　10,00０）

ﻫs电磁搅拌器ﻫ

s离心机 ﻫ

操作步骤 

１。

用烧杯加2０ml０.０6　mｏl/L醋酸钠缓冲液（ｐH4。

0）到10ml腹水或细胞培养上清中;ﻫﻫ２.　用１ＮHCｌ调节pＨ到4、8,后滴加辛酸同时用力搅拌,具体用量参见表1;

3。

　在室温下继续搅拌30分;

4.５,０00×g室温离心３0分,保留上清;ﻫﻫ5.用1NNaOH　调节pＨ到5.7;ﻫﻫ6。

　含有IgG得上清对PBＳ透析,然后分装、置—20℃保存、 ﻫ

表１沉淀不同来源IgG得辛酸参考用量 ﻫﻫＩｇＧ来源辛酸用量（每10ml腹水或上清）

ﻫ小鼠4０0μl

人７０0μｌﻫﻫ羊700μlﻫ

兔　750μｌﻫﻫ

质量检察 

上清中ＩgG得纯度可用SDS－ＰAＧE分析及合适得酶标免疫测试法测定其免疫活性来确定、

上清中可能存在少量杂质,可通过ＤEＡＥ离子交换层析除去。

 ﻫﻫ参考文献 ﻫﻫ１。

　Russo,C、,　Callegaro,Ｌ。

Ｌaｎza,Ｅ。

aｎdＦerroｎe,Ｓ。

（１983）　Puｒiｆicaｔionoｆ　IgＧmoｎoclonalaｎtibｏdybyｃａpryliｃacidpｒecipitatiｏn、　Ｊ.Ｉmmunol.Ｍeth。

65,269－27１ﻫﻫ２.Steiａnbuch,M、anｄAｕdｒaｎ,R.（1969）　Ｔheisolationof　IgGfｒom　mａmmａliａｎseraｗｉｔｈ　theaｉdｏfｃapryｌｉcａｃid.Arch.Bioｃhem。

Bｉｏphyｓ、13４,２79-28４ ﻫ

（朱正美）ﻫ

ﻫ第五节　Sephaｄex凝胶过滤纯化抗体 

基本原理 ﻫ

凝胶过滤又称分子筛层析。

就是一种借助分子筛效应将分子大小不同得混合物进行分离得方法。

交联葡聚糖凝胶Ｓｅpｈadex就是常用得层析介质、它就是一种含有许多网眼得球形小颗粒,网眼大小分布均一。

当分子大小不同得混合物通过凝胶柱时,其中较大得分子不能进入凝胶网眼,将毫无阻力或阻力很小地随洗脱液流出,而小分子物则能扩散进入网眼,被阻滞在层析柱上,分子量越小,扩散出来所耗时间就越长、因此分子大小不同得MoAb可以借助分子筛效应进行分离提纯、本文以IgM得纯化为例介绍此方法。

IｇM因分子特别大（9０0kｄ）而不能进入凝胶颗粒得网孔,可首先被洗脱达到初步纯化得目得、 

试剂与器材 ﻫ

·　ＳｅpｈadexG100或G200 

ﻫ·粗制ＩgＭ－MoＡb培养物或抗血清,腹水等

·洗脱缓冲液:

0。

01ｍoｌ/LTris－ＨCｌ缓冲液ｐH8。

0含0、5mol/Ｌ　NaCｌ ﻫﻫ·层析柱（１。

０　cmÆ　´3０cm或1.5cｍÆ´　40　cm）

·透析袋（MＷＣO1０　０00）ﻫﻫ·磁力搅拌器

ﻫ·部分收集器

·紫外检测仪

·离心机 ﻫﻫ步骤 ﻫﻫ1、样品处理:

将腹水、抗血清或培养上清液离心400０´g　20分钟,以除去细胞碎片、较稠得腹水与血清需适当稀释;ﻫﻫ2、装柱:

根据样品量选择合适得层析柱,将０.０1ｍoｌ/LｐH8、０含0。

５mｏl／LＮａCl得Triｓ－HCl缓冲液加到柱长得1/4处,然后将漂洗溶涨得SeｐｈaｄexG1０0或G２００　倾入柱中,自然沉降3０分钟,再用同样得缓冲液平衡柱1小时,流速0.5ｍl/min;

3、　仪器连接:

将紫外检测仪与部分收集器与层析柱连接;

4、上样与洗脱:

待柱上平衡缓冲溶液接近凝胶上表面时,缓慢加入样品溶液0、5ｍl/min。

当样品液面接近凝胶上表面时,加少量缓冲液清洗柱壁,然后接上缓冲液洗脱并收集1－2ml/管。

280nm检测得第一蛋白峰即为IgＭ－MoAｂ。

ﻫﻫ5、浓缩与保存:

将２80ｎｍ检测得第一蛋白峰合并,移入透析袋在磁力搅拌器上4°C对PBS流动透析过夜。

透析后得溶液可经聚乙二醇或五氧化二磷真空干燥浓缩后,分装封管,-20°C保存备用。

 ﻫﻫ检测 ﻫ

1、可用ＳDＳ－PAＧE　或定量免疫学方法（RIA、ELＩSA）检测各部分洗脱液得抗体。

２、IgＭ-MｏＡb一般在外水体积洗脱。

ﻫ应用提示 ﻫ

1、凝胶过滤不变换洗脱液,一次装柱后可反复使用多次。

操作简单,快速经济。

ﻫ2、实验可重复性高,样品回收几乎可达100%,且方法温与,不易引起生物样品变性失活,可进行大量样品得分离纯化。

ﻫ3、用于小分子物（如无机盐）从大分子物（MＷ＞200０0）分离得层析柱,柱体积应大于样品体积4－10倍,其高与直径得比例应为5:

1-15:

1;用于大分子物之间得分离（如免疫球蛋白之间得分离）,则柱体积应大于样品体积2５—100倍,高与直径得比例应为20:

1—100:

1。

4、Sephadｅｘ凝胶装柱时,应灌制均匀无断层与气泡、在整个操作过程中,凝胶应始终保持在液面以下。

ﻫ

５、提取得IgM浓度过低或反复冻融会引起变性,应分装后在－7０°Ｃ或－20°C冻存,或者加0.２ｇ/Ｌ叠氮钠在4°C可保存数月。

6、如无合用得部分收集器,可手工收集１－２ml/管,用分光光度计测定各管吸光度值。

参考文献 

１、　周本正编着　《层析技术及其应用》　湖北科学技术出版社（1９9２）2８-30

ﻫ２、M。

Z、阿塔西,C。

J。

范奥斯,Ｄ.R.阿勃索洛姆主编郑昌学,吴安然等译　《分子免疫学》科学出版社（19８８）　212－21４ ﻫ

第六节免疫球蛋白G得亲与层析纯化法（蛋白A或蛋白G法） 

ﻫ基本原理 

ﻫ蛋白A就是金黄色葡萄球菌得细胞壁（cellwalｌ）（cell　waｌl）成分。

蛋白G就是G组链球菌得细胞壁（cｅｌlwalｌ）（celｌｗalｌ）成分。

这两种蛋白质分子可通过免疫球蛋白得FC区与大多数哺乳动物（mａmmａl;mammalｉaｎ）（mａmｍaｌ;ｍａmmaｌiａn）得IgG结合（见表１）、利用基因工程（ＧeneｔiｃEngｉneeｒiｎg）（Geｎetic　Ｅngiｎeerｉng）技术,将蛋白A与蛋白Ｇ分子中与Ｆc区结合得结构域部分得基因融合,所产生得融合蛋白,则具有更广泛得IgG结合特异性。

蛋白A、蛋白G或融合蛋白A／Ｇ与免疫球蛋白Ｆc段得结合性能使它成为可用于ＩgＧ分离得、天然得亲与配基。

将这些配基蛋白结合到固体支持物上,提供了应用亲与层析纯化抗体得一步法得基础。

试剂及仪器 ﻫ

l　含IgＧ得样品ﻫ

lPBＳ（见附录）

ｌ装有2ml固相化得蛋白Ａ、蛋白G或蛋白A/G得小型层析柱（有商品供应）ﻫ

ｌ透析袋（MWCＯ１０,0００）ﻫ

l结合缓冲液:

０。

1mol／LＴrｉs－HClｐH7、5＋0。

15mol/LNaClﻫﻫl　分步收集器（可按需要选用）

ｌ洗脱缓冲液:

0、1ｍol/LGly-HＣｌｐH2。

8+0。

15mol/LNaCl

ﻫl中与缓冲液:

1ｍｏｌ/ＬＴriｓ－ＨCl　pH8。

0

l蠕动泵（可按需要选用）

ﻫｌＵＶ监测器ﻫ

l　pＨ计 

操作步骤 

*样品（可为血清、腹水、含有IgＧ得单克隆与多克隆抗体得细胞上清液）。

ﻫﻫ１.　样品在4℃,对结合缓冲液透析过夜,或将其与至少1:

1稀释得结合缓冲液混合;

2。

　如果条件充许,将层析柱与蠕动泵、分步收集器与UＶ监测器相连;

ﻫ3、　至少用１0ml结合缓冲液,以1ml／miｎ速度,洗涤柱中得2ml亲与层析介质;

ﻫ4、上样;ﻫ

5.一旦样品进入凝胶,用结合缓冲液洗柱（至少10个柱体积）,直至A2８０ｎm小于0、03;ﻫﻫ6.　用洗脱缓冲液洗脱所结合得IgG,分布收集２ｍl/管;ﻫ

7.收集过程中,每管立即加入0.１ml中与缓冲液,以中与洗脱所得得IgG液。

ﻫ8、　含ＩgG得各管对PBＳ透析,其后根据抗体得稳定性,加入防腐剂（0、020g/L叠氮钠）,置4℃或冷冻保存。

实验要点及说明 ﻫ

通常可通过SDＳ-PAGE分析或通过适当得免疫方法　（如Weｓterｎbloｔ,ELＩSA等）,对洗脱组分进行纯度鉴定与免疫活性测定、ﻫﻫ1、上样量由层析柱得对特定免疫球蛋白得容量确定,2mｌ柱对于小鼠IｇG得容量约1０ｍg,对于人IgＧ得容量约为１8mg;ﻫ

2。

　柱上结合得抗体被洗脱得速度很快,通常在第一洗脱流份中;ﻫ

3.下列缓冲液也可用为结合缓冲液:

含０.1５ｍol/L　NａCｌ得50ｍmoｌ/Ｌ硼酸钠pＨ8、0,或含0、15mol/ＬNaCｌ得0。

1mol/Ｌ磷酸盐液pH７.5。

高盐结合缓冲液（>1moｌ/LＮａCｌ）可能增加总得柱结合容量约50%;ﻫ