液相色谱工作总结.docx
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液相色谱工作总结
液相色谱工作总结
篇一：
高效液相总结
高效液相色谱中的速率理论
范氏方程：
H＝A＋Cu
A=2λdp在HPLC中为了降低涡流扩散的影响:
采用了3－10um的小颗粒球形固定相采用高压匀浆
Cd－为常数
Cs－常数Bu?
CdDm
u
Ds－为组分在固定相中的扩散系数
df_－为固定液涂层厚度Hs?
CSdfuDs2
在HPLC中，流动相是液体其粘度比气体大得多，而且是在室温下进行操作。
因此组分在流动相中的扩散系数Dm比GC中的Dg要小得多。
另外HPLC流动相的流速快，所以纵向扩散项对谱带扩张的影响很小，可以忽略不計。
故在H－u曲线中没极小值
根据速率理论HPLC的实验条件为：
1.小粒度、均匀的球形化学鍵合相；2.低粘度流动相，流速不宜快；3.柱温适当
流动相
在高效液相色谱中所用的流动相也称洗脱剂，溶解样品用的溶剂最好就是洗脱剂。
由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力，并参与固定相对组分的竞争。
因此流动相不仅起洗脱作用，还参与分离过程，在固定相一定时，
HPLC中,n由色谱柱质量决定，α主要受溶剂种类的影响，κ受溶剂配比的影响。
若固定相一定，改变流动相的组成就可以r21使改变；改变流动相中各种溶剂的配比，就能有效地控制k值。
用分离方程讨论流动相对分离的影响注意HPLC与GC
不同
在HPLC中，当固定相一定时，流动相的种类影响选择因子，配比影响容因子。
因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。
在GC中，流动相是惰性的，它对组分没有作用力，仅起运载作用，因此，α主要受固定相性质影响,κ主要受柱温影响，在GC中，以选择固定相和改变柱温来改善分离度。
（1）不允许使用能引起柱效能损失或柱保留特性变化的溶剂。
（
2）溶剂对于试样，必须具有适当的溶解度和良好的选择性。
3）溶剂要与检测器匹配。
对于紫外吸收检测器，应注意选择检测波长比溶剂的紫外截止波长要长。
对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。
（4）溶剂的纯度要高，使用前应过滤、脱气（5）溶剂的化学稳定性好。
不能选用与样品发生反应或聚合的溶剂。
（6）尽量使用低粘度的溶剂。
常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙腈等。
但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离.
1.恒组成溶剂洗脱：
在色谱过程中，溶剂的组成、配比不变。
适用于组分数目少、性质差别不大的试样的分离分析。
2.梯度洗脱：
在色谱过程中，可按一定程序连续地或阶段地改变流动相的组成，使一个复杂混合物的样品中的性质相差较多的组分都能获得适宜的容量因子。
梯度洗脱的优点：
1.提高分离效率，2.加快分析速度，3.改变峰形，4.提高检测灵敏度。
缺点：
一液一固吸附色谱法（LSC该法有利于不同族化合物的分离，对不同异构体的分离选择性远比其他色谱方法好
1固定相
硅胶氧化铝聚酰胺
硅胶的吸附性是由硅胶表面的硅羟基产生的。
硅胶如吸附水，可使吸附能力降低；升温可以除去吸附的水，使硅胶活化。
为了能有适当的保留值并得到较好的分离，极性弱的试样应使用活性较高的吸附剂；极性强的试样应使用活性较低的吸附剂。
进行色谱分离时，流动相若有水分，会降低吸附剂的吸附活性。
2流动相
在吸附色谱中选择流动相的原则：
极性大的试样往往采用极性强的洗脱剂；极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。
洗脱剂的极性强弱可用溶剂极性参数（P）来衡量。
P越大，表示洗脱剂的极性越强，洗脱能力越大。
例如：
正烷P=，极性最小；水P=极性最大。
实际工作中常用混合溶剂，以改分离效果。
溶剂极性参数应调节到使被测组分的容量因子在2-5的最佳范围。
P?
?
P?
?
?
P?
?
?
?
?
abaabb式中，Pa’Pb’分别为溶剂A、B溶剂极性参数，фa、фb分别为溶剂A、B在混合溶剂中的体积分数。
二液一液分配色谱法（LLPC）
该法能适用于各种样品的分离和
分配系数较大的组分，保留值也较大，后出峰；分配系数较小的组分，保留值也较小，先出峰。
2.固定相载体+固定液
载体：
是惰性物质，仅起负载固定液的作用。
固定液：
是有机溶剂。
最常用固定相
（强极性固定液）聚乙二醇（中等极性）角鲨烷（非极性）
主要优点：
1.表面均匀，无液坑，传质快，故柱效高。
2.固定相在使用中不易流失，适用于梯度洗脱。
3.化学稳定性好、重现性好、分离的选择性高。
特别适用于分离容量因子k值范围宽的样品。
4.载样量大。
由于键合到载体表面的官能团可以是各种极性的，因此它适用于种类繁多样品的分离，是应用最广泛的固定相。
用来制备键合固定相的载体，几乎都用硅胶。
利用硅胶表面的硅醇基（Si一OH）与有机分子可成键,即可得到各种性能的固定相。
（1）非极性键合相：
键合相表面基团为非极性烷烃。
如不同链长的烷烃（C8和C18）和苯基等。
常用于反相色谱。
（2）弱极性键合相：
常见的有醚基和二羟基等。
可用于正相色谱或反相色谱，视流动相极性而定。
（3）极性键合相：
键合相表面基团极性基团如氨丙基，氰乙基等。
常用于正相色谱。
（l）酯化键合（≡Si一OR）,它是最先用于液相色谱的键合固定相。
（2）硅氮键合（Si一N）
（3）硅烷化键合（≡Si—O－Si－C）
这类键合固定相具有热稳定好，不易吸水，耐有机溶剂的优点。
能在70℃以下，pH=2～8范围内正常工作，应用较广泛。
动相尽可能不与固定相互溶，而且流动相与固定相的极性差别越显著越好。
正相色谱：
常用低极性溶剂，加入适量极性溶剂。
如在烃类中加入氯仿。
2.反相色谱：
通常用水或无机盐缓冲溶液为主体，加入甲醇、乙腈等。
保留值与流动相极性的关系：
梯度洗脱时，正相色谱通常逐渐增大洗脱剂中极性溶剂的比例，反相色谱逐渐增大洗脱剂中极性相对较低溶剂的比例，这样有利于组分的洗脱。
注意：
反相色谱中溶剂的洗脱能力用溶剂强度因子S表示，如水S=0洗脱能力最弱，四氢反相色谱法
固定相是采用极性较小的键合固定相，常用硅胶一C18H37硅胶一苯基等；
流动相是采用极性较强的溶剂，甲醇十水乙腈一水，
多用于分离非等极性、中极性化合物。
若采用水和无机盐的缓冲液为流动相，则可分离一些易离解的样品，如有机酸、有机碱、酚类等。
由于反相色谱法的流动相价廉易购，不干扰紫外吸收法，荧光法及电化学法的检测，分析周期较短。
加之由它派生的反相离子对色谱法与离子抑制色谱法，可以分离有机酸、碱、盐等离子型化合物，是应用最应泛的色谱方法。
应调节流动相的pH使试样组分与离子对试剂全部离子化为宜。
键合相反相离子对色谱法的固定相采用非极性的疏水键合相，如十八烷基键合相（ODS），流动相为加有平衡离子的极性溶液（如甲醇一水或乙腈一水）。
离子抑制色谱法：
如果被分析的离子是弱酸的共轭碱或弱碱的共轭酸，则可用OH-或H+作为平衡离子，在流动相中加入缓冲溶液调节一定pH，使被分析离子转化成它的共轭酸或共轭碱，在两相间分配。
离子抑制色谱法适用于3≤pKa≤7的弱酸及7≤pKa≤8的弱碱分析。
离子交换色谱法（IEC）
固定相是离子交换树脂，流动相是一定pH和离子强度的缓冲溶液。
利用被分离组分离子交换能力的差异而实现分离。
主要用于分析在溶液中能够电离成正负离子的物质。
离子交换色谱法所用流动相大都是一定pH和离子强度的缓冲溶液
1.离子强度的影响：
如果增加离子强度（盐离子的浓度），则可降低样品离子的竞争吸附能力，从而降低其在固定相上的保留值，使容量因子减小。
增大pH值会使酸的电离度增加，使碱的电离度减少；降低pH值，其结果相反。
一般最好将pH值选择在被分离酸碱的pK附近，因处于离子状态才能交换。
离子色谱法（IC）
将离子交换色谱法与电导检测器相结合能同时测定多种无机和有机离子的新技术。
优点：
灵敏度高、选择性好、快速、能同时分析多种离子。
特别是对阴离子的分析，在各种仪器分析法中堪首选方法。
尺寸排阻色谱法（SEC）
又称空间排阻色谱法、凝胶色谱法，基于试样分子的尺寸和形状不同来实现分离的色谱方法。
主要用于较大分子的分离。
特点：
1）根据保留值测定分子量。
lgMr＝A－BVR
（2）保留时间短，谱峰窄，不用梯度洗脱。
（3）易检测，可采用灵敏度较低的检测器4）柱寿命长。
（5）不能分辨分子大小相近的化合物，相对分子质量差别必须大于10％才能得以分离。
样品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。
可见凝胶色谱法的分离机制与前几种色谱方法不同，它只取决于凝胶的孔径大小与被分离组分线团尺寸之间的关系，与流动相无关。
（1）软质凝胶如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶，它们适用以水溶性溶剂作流动相，一般用于小分子质量物质的分析，不适宜用在高效液相色谱中。
（2）半硬质凝胶如聚苯乙烯，常以有机溶剂作流动相。
用于高效液相色谱时，流速不宜大。
（3）硬质凝胶如多孔硅胶、多孔玻璃等，它们既可用水溶性溶剂，又可用有机溶剂作流动相，可在较高压强和较高流速下操作。
一般控制压强小于7MPa，流速＜1mL/min；否则将影响凝胶孔径，造成不良分离
3．流动相
（1）必须能溶解样品，并必须能润湿凝胶。
（2）溶剂的粘度要小。
（3）选择溶剂还必须与检测器相匹配。
常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。
以水溶液为流动相的凝胶色谱适用于水溶性样品，称为凝胶过滤色谱法（GFC）。
以有机溶剂为流动相的凝胶色谱适用于非水溶性样品，称为凝胶渗透色谱法（GPC）。
亲和色谱法（AC）亲和色谱是利用生物大分子和固定相表面存在某种特异性亲和力，进行选择性分离的一种方法
手性色谱法:
适用于分离手性化合物的对应体.
.
高压输液系统进样系统分离系统检测系统
此外还配有辅助装置：
如梯度洗脱，自动进样及数据处理等。
①防止任何固体微粒进入泵体；②流动相不应含有任何腐蚀性物质；③泵工作时要防止溶剂瓶内的流动相被用完；④不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液；⑤流动相使用前应先脱气
色谱柱是液相色谱的心脏部件，它的作用是分离
分析型：
柱长10～30cm，内径为2～5mm，制备型：
柱长10～
30cm，内径20～40mm。
柱子装填得好坏对柱效影响很大。
对于细粒度的填料（＜20μm）一般采用匀浆填充法装柱.
按其适用范围可分为：
1.专属型检测器：
它仅对被分离组分的某一性质有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光检测器等。
2.通用型检测器：
它检测的是一般物质均具有的性质，属于这类检测器的有示差折光，蒸发光散射检测器等。
l）紫外检测器：
特点灵敏度高，要求试样必须有紫外吸收，而且溶剂必须能透过所选波长的光。
2）荧光检测器：
特点为高灵敏度、高选择性和样品用量少。
只适合于能产生荧光的物质的检测。
它是体内药物分析常用的检测器之一。
3）示差折光率检测器：
利用流动相中出现试样组分引起折光率变化进行检测。
灵敏度可达10-7g·cm-3。
主要缺点是对温度变化敏感，必须保持恒温并且不能用于梯度洗脱。
4）电化学导检测器：
特点为灵敏度高，对具有氧化还原性的物质都可进行检测。
分为极谱检测器、库仑检测器、安培检测器、和电导检测器，电导检测器主要用于离子检测。
5）蒸发散射检测器：
特点为对各种物质都有响应，灵敏度比较低。
流动相必须是挥发性的，不能含有缓冲盐。
主要用于糖类、高级脂肪酸、氨基酸、维生素等物质的检测
一、定性方法
1.色谱法：
利用保留值2.化学法：
利用化学专属反应3.两谱联用
二、定量方法
1.外标法2.内标法
色谱系统适用性内容包括：
理论塔板数分离度拖尾因子（对称因子）重复性
在选定的条件下:
理论塔板数不能低于各品种项下规定的最小理论塔板数,相对标准偏差不大于%，除另有规定外,分离度应大于,拖尾因子（T）应在～之间。
分离类型的选择
1．根据相对分子质量选择
气相色谱：
适用于相对分子质量低的，其挥发性好样品。
标准液相色谱类型（液一固、液一液、及离子交换色谱）最适合的相对分子质量范围是20O～XX。
尺寸排阻法：
最适于相对分子质量大于XX的样品。
2．根据溶解度选择
弄清样品在水、异辛烷、苯、四氯化碳、异丙醇中的溶解度是很有用的。
如果样品可溶于水并属于能离解物质，以采用离子交换色谱为佳。
如样品可溶于烃类（如苯或异辛烷），则可采用液一固吸附色谱；如样品溶解于四氯化碳，则多采用的分配和吸附色谱分离。
3．根据分子结构选择
用红外光谱法，可预先简单地判断样品中存在什么官能团。
然后，确定采用什么方法合适。
酸、碱化合物用离子交换色谱；脂肪族或芳香族用液一液分配色谱、液一固吸附色谱；异构体用液一固吸附色谱；同系物不同官能团及强氢键的用液一液分配色谱。
篇二：
Agilent1200高效液相色谱仪工作站学习总结
Agilent1200高效液相色谱仪工作站学习总结
开首语本人在XX年本人在XX年1月8日至1月11日参加广州日至111日参加广州安捷伦科技有限公司的1200高效液相色谱仪安捷伦科技有限公司的1200高效液相色谱仪化学工作站的学习培训，几天学习培训，使我对1200液相色谱仪的硬件及软件有了更全我对1200液相色谱仪的硬件及软件有了更全面的了解和更多的认识，现在做个总结向大家介绍如下。
硬件篇安捷伦高效液相色谱仪1200由几部分组成，脱气机，泵、进样器、柱温箱和检测器。
安捷伦1200HPLC系统采用积木式堆积结构，方便用户按照自己的需要配置不同的的系统，整个系统的流路自上而下设计、连接，减小了系统的死体积和延迟体积。
Agilent1200HPLC系统堆叠方式
脱气机安捷伦1200系列在线脱气机有，微量真空脱气机G1379B、标准真空脱气机G1322A。
原理基本相同，就是使用半透膜管路，允许气体分子通过，液体分子无法通过。
A型用的是微渗管，B型用的是滤膜。
流路A型是左进右出，而B型为下进上出，本科室使用的为A型G1322A。
使用真空脱气机可以降低噪声，保证保留时间的重现性，与He脱气相比，更方便，更节省费用。
真空脱气机脱气原理
泵安捷伦1200系列泵有：
单元泵：
G1310A、四元泵：
G1311A、二元泵：
G1312A、二元泵SL型：
G1212B。
单独一个泵腔泵腔无法满足溶剂传输系统的要泵腔求：
连续性、稳定性都不符合标准，现在新购仪器中已很少考虑。
单元泵，按溶剂的传输系统有两种，一种是并联柱塞泵，另一种是串连柱塞泵。
并联柱塞泵由于两个泵的相位不同，可以补偿流量脉冲，但由于单向阀的数量增多，所以容易造成泄漏，增加了维护使用的难度。
串连柱塞泵左泵腔的活塞运动速度为右泵腔活塞的2倍，因此，相同时间内，左泵提供的流量为右泵的两倍，左泵提供的溶剂一半直接供给系统，另一半被右泵吸入，稍后供给液相系统，减少了单向阀的用量，可以使用压缩因子补偿。
四元泵，其实就是比单元泵多了四元比例阀。
由单元泵可以升级到四元泵，除了要加上四元比例阀外，还要更换主板。
需要注意的是，当使用盐溶液和有机溶剂时，建议将盐溶液接到四元比例阀下面的通道上，有机溶剂接到上面的通道上。
如果经常使用盐溶液，建议定期用水冲洗所有的通道以去除阀口上可能出现的盐沉淀。
四元泵的工作原理
二元泵，有两个泵头，特点是高压混合，无需脱气；对于有强紫外吸收的流动相，使用静态混合器可以降低基线噪声；可以选择溶剂切换阀自动进行溶剂切换；对于高盐流动相，可选择泵头密封垫清洗
装置。
所以脱气机不是标准配置，但增加真空脱气机，流量范围可以从～5ml/min扩展至～5ml/min；加入静态混合器，使流动相混合更加均匀；如果配置
溶剂切换阀，则两个泵头可分别控制两种溶剂，类似四元比例阀，但并不完全一样，只能同时混合两种溶剂，不可实现四种溶剂的同时使用。
二元泵为高压泵，为后混合式，精度更高，而且由于为高压混合，产生的气泡也更少，所以价格也比四元泵贵得多。
四元泵为低压泵，流速稳定性相对较差，低压混合容易产生气泡，在实验中常会遇到这样的问题，多元
混合中出现流动相不稳定的现象，特别是流动相配比较低的如小于1%，其多元混合效果难以达到我们的要求，造成保留时间漂移，甚至得不到我们预期的色谱峰。
明白四元泵的低压混合的道理，实际操作中我们发现问题时，有助于我们对原因的分析。
必要时泵可以拆御，更换密封垫及滤芯。
对容易出故障部位及处理方法，比如宝石
活塞杆是不能超声的部件，泵头密封垫要成对更换，实验室中至少应备有一付号泵头密封室中至少应备有一付4号泵头密封室中至少应备有一付垫，部件号为：
5663-6589（用于反相色谱）；部件号为：
（用于反相色谱）；0905-1420（用于正相色谱）。
同时实验室应备（用于正相色谱）。
同时实验室应备）。
过滤芯，有5-10个PTFE过滤芯，以备日常所需。
判断方个过滤芯以备日常所需。
法为，打开冲洗阀，以水为溶剂，法为，打开冲洗阀，以水为溶剂，流速5m
l/min，系统压力大于10bar就应更换过滤白，系统压力大于就应更换过滤白头了。
头了。
二元泵的工作原理
进样器，安捷伦1200系列进样器有：
标准自动进样器G1329A、高性能进样器G1367A、高性能进样器SL型G1367B、手动进样器G1328B。
自动进样器的特殊功能，洗针功能可以把样品残留降低到最小限度；多次吸液用于进样量大于100μl的情况；程序进样可以非常灵活
地执行用户的进样程序要求，如多种样品自动混合，自动进样等高级功能的自由设置，但是，由于进样针的扩散，所以进样量越小，受到扩散的影响也越大，所以自动混合的准确度还是难以达到容量瓶的混合方式。
这在做标准由线时得注意的问题，如为定量则不推荐小样量的混合方式。
程序进样方式设置如下图：
第一步：
设置进样第一步：
器
第二步：
第二步：
使用进样器程序（U）
第三步：
更多信息（功能项）第三步：
更多信息（功能项）
对于手动进样器，必须了解六通阀的工作原理，应特别注意的是进样量少于定量环的50%或大于定量环的3-5倍量是比较准确的，不过，大家用自动进样器已经习惯了，如果再用回手动进样器会不会有
些郁闷？
会不会有一种坐惯了宝马又要回到踩单车的感觉？
柱温箱，使用安捷伦柱温箱可以保证柱的稳定性，从而保证了保留时间的重现性。
恒定的柱温特别是日温差大的时候更为必要。
检测器，安捷伦1200系列检测器有，可变波长检测器G1314B、二极管阵列检测器G1315B、二极管阵列检测器SL型G1315C、示差折光检测器G1362A、荧光检测器G1321A。
本所用的是VWD的G1314B型，DAD型及FLD的就不多说了。
对VWD型检测器应了解它的工作原理，氘灯的使用维护及更换。
需要注意的是，使用中不要频繁的开关氘灯，否则影响氘灯的寿命。
可以利用诊断方式来检测氘灯的能量，当然，发现氘灯能量降低时不要马上得出氘灯应该更换的结论，这也许是流通池脏或有气泡造成的能量降低，所以必须用诊断方式检测流通池。
诊断结果大于说明流通池很干净，小于则说明流通池该清洗了。
更换氘灯后要在诊断日志中填写更换氘灯，这样氘灯的使用时数便从零开始。
这里还有一点得注意的是流通池的后压力非常重要，一定要使用适当出口连接管，出口管线要使用专用废液管为系统提供适当的后压，不得私自将废液管截短，以防气泡进入流通池。
但如果压力过高，流通池的石英窗片可能破裂。
在这里我要说的是，对安捷伦1200高效液相色谱仪正确的操作方法和定期的维护保养的是很重要的。
篇三：
液相色谱论文
高效液相色谱技术的应用
生物技术及应用王伟XX0708018
高效液相色谱自20世纪70年代问世以来，凭着其自身显著的优势，经过近30年的发展，在基础理论、仪器装置和色谱柱等方面的研究已趋于成熟，现在已成为化学学科中最有优势的分离分析方法之一。
与其它的分离方法相比，高效液相色谱法具有下列主要优点：
应用了颗粒极细（一般为10ton以下）、规则均匀的固定相，传质阻抗小，分离效率高，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍；采用高压输液泵输送流动相，分析时间短，通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时；广泛使用了高灵敏检测器，大大提高了检测灵敏度。
因此，HPLC的应用范围非常广，百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。
以下就具体介绍一下高效液相色谱法在国内外应用：
在食品领域的应用
①HPLC在食品营养成分领域的应用包括对碳水化合物的检测、维生素的检测、氨基酸的检测、脂肪酸的检测等，HPLC法操作简便，重现性好，色谱分离时间短且分离度好。
已经逐渐取代了传统的检测方法。
②HPLC在食品添加剂领域的应用目前，我国有20多类、近1000种食品添加剂，合理使用添加剂对人体健康以及食品都是有益无害的，但如果不加以限制使用，对人体健康会产生危害。
HPLC可以分别对食品甜味剂，防腐剂，色素以及抗氧化剂等进行检测。
③HPLC在食品污染物领域的应用HPLC可以检测食品中农药、兽药的残留以及食品中其他来源的化学污染物，西维因、多菌灵和狄氏剂等150多种农药都可以用HPLC法进行分离或分析，在啤酒中时有发现的致癌性很强的亚硝胺类化合物，利用反相色谱法能快速、准确地检测。
在药品检验中的应用
高效液相色谱法在1985年版《中国药典》中收载后，为药品检验工作更高效、灵敏、准确地进行药物质量控制奠定了基础，并迅速成为药品检验采用的主流分析方法之一。
①鉴别中的应用在HPLC法中，保留时间与组分的结构和性质有关，是定性的参数之一，可用于药物的鉴别。
②有关物质检查中的应用因HPLC法具有简便、快捷、专属、准确等优势，其已成为检测有关物质的主流方法。
③含苣测定中的应用HPLC法具有分辩率高、分析速度快，重复性好、样品用量低、自动化程度高等优点，在定量测定时极具优势其中大部分是反相色谱，也有吸附色谱、离子交换色谱等。
④中药成分检验中药是一个多成分的复杂体系，通过各成分之间的配伍组合，达到最佳治疗效果。
由于成分多样和复杂，成分分析较为困难。
HPLC法可以将各成分或待测成分与其他杂质进行有效的分离，达到进行鉴别、检查、含量测定的目的。
近几年，HPLC法在中药检验中，应用越来越广泛，《中国药典》XX年版（一部）收载的含量测定方法以HPLC法为
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