质粒的提取与鉴定实验报告.docx

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质粒的提取与鉴定实验报告

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质粒的提取与鉴定实验报告

　　篇一：

质粒DnA测定生化实验报告

　　生物化学实验报告

　　姓名：

杨晓霞

　　学号：

3120XX0025

　　专业年级：

20XX级口腔

　　组别：

第一实验室

　　生物化学与分子生物学实验教学中心

　　篇二：

质粒DnA的提取、纯化与鉴定

　　姓名宿智新学院生命科学学院班级11级生工2班科目分子生物学实验学号20XX00140155第8组

　　质粒DnA的提取、纯化与鉴定

　　摘要：

本实验利用碱变法从大肠杆菌Dh5?

（e.coliDh5?

）中提取puc19质粒，旨在学习并掌握质粒DnA提取的原理、纯化和检测方法及琼脂糖凝胶电泳技术。

同时通过对质粒DnA的提取、纯化过程及电泳图谱的分析，探讨碱变法提取高质量质粒DnA的关键步骤及影响所提质粒纯度和量的相关因子。

　　关键词：

碱变法质粒电泳

　　实验目的：

　　1.学习并掌握凝胶电泳进行DnA的分离纯化的实验原理。

　　2.学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。

　　3.学习并掌握凝胶中DnA的分离纯化方法。

　　4.掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。

　　5.掌握碱变性法提取质粒DnA的方法。

　　实验原理：

　　1.质粒DnA的提取——碱变性提取法：

　　提取和纯化质粒DnA的方法很多，目前常用的有：

碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、eb-氯化铯密度梯度离心法和wizard法等。

其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DnA的提取。

该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。

提取质粒DnA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。

eb-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质量与染色体DnA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒DnA多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。

少量提取质粒DnA还可用沸水浴法、wizard法等，沸水浴法提取的质粒DnA中常含有RnA，但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。

　　碱变性法提取质粒DnA一般包括三个基本步骤：

培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DnA。

　　在细菌细胞中，染色体DnA以双螺旋结构存在，质粒DnA以共价闭合环状形式存在。

细胞破碎后，染色体DnA和质粒DnA均被释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液ph值不同。

在ph值高达12.0的碱性溶液中，染色体DnA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DnA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。

当用ph值4.6的KAc（或naAc）高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DnA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DnA不能复性，而是与不稳定的大分子RnA、蛋白质-sDs复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。

这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DnA分离。

溶于上清的质粒DnA，可用无水乙醇和盐溶液，减少DnA分子之间的同性电荷相斥力，使之凝聚而形成沉淀。

由于DnA与RnA性质类似，乙醇沉淀DnA的同时，也伴随着RnA沉淀，可利用RnaseA将RnA降解。

质粒DnA溶液中的RnaseA以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DnA。

　　姓名宿智新学院生命科学学院班级11级生工2班科目分子生物学实验学号20XX00140155第8组

　　2.凝胶电泳进行DnA分离纯化：

　　电泳（electrophoresis）是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极方向移动的现象。

各种生物大分子在一定ph条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。

凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。

含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因电离子的大小形态及电荷量的不同而有差异。

利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。

因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DnA片段，是分子生物学的核心技术之一。

　　凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围广。

此外，凝胶中DnA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭（ethidiumbromide，eb）或sYbRgold染色直接观察到，甚至含量少至20pg的双链DnA在紫外激发下也能直接检测到。

需要的话，这些分离的DnA条带可以从凝胶中回收，用于各种各样目的的实验。

　　分子生物学中，常用的两种凝胶为琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺凝胶。

这两种凝胶能灌制成各种形状、大小和孔径，也能以许多不同的构型和方位进行电泳。

聚丙烯酰胺凝胶分辨率高，使用于较小分子核酸（5—50（:

质粒的提取与鉴定实验报告）0bp）的分离和蛋白质电泳。

它的分辨率非常高，长度上相差1bp或质量上相差0.1%的DnA都可以彼此分离，这也是采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行DnA序列分析的分子基础。

虽然它能很快地进行电泳，并能容纳较大的DnA上样量，但是与琼脂糖凝胶相比，在制备和操作上繁琐。

琼脂糖是从海藻中提取的长链状多聚物，由β-D-吡喃半乳糖与3,6-脱水-L-吡喃半乳糖组成，相对分子质量为104-105。

琼脂糖加热至90℃左右，即可溶化形成清亮、透明的液体，浇在模版上冷却后形成凝胶，其凝固点为40-45℃。

琼脂糖凝胶相对于聚丙烯酰胺凝胶分辨率低，但它的分离范围更大（50至百万bp），小片段DnA（50-20000bp）最适合在恒定轻度和方向的电场中水平方向的琼脂糖凝胶内电泳分离。

琼脂糖凝胶电泳易于操作，适用于核酸电泳，测定DnA的相对分子质量，分离经限制酶水解的DnA片段，进一步纯化DnA等。

　　琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法。

在溶液中，由于核酸有磷酸基而带有负电荷，在电场中向正极移动。

DnA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移率主要取决于6个因素：

样品DnA分子的大小、DnA分子的构象、琼脂糖浓度、电泳所用电场、缓冲液和温度。

　　主要仪器和材料试剂：

　　1.仪器和材料：

　　恒温振荡培养箱，高速冷冻离心机，旋涡振荡器，水浴锅，1.5mL离心管，50mL离心管，不同型号的吸头，微量移液器，微波炉，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，电子天平，手套，紫外灯，eppendorf管等。

　　菌体：

e.coliDh5α受体菌，具有Ampr标记的质粒puc19。

　　2.实验试剂：

　　Lb培养基，抗生素（氨苄青霉素），溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，RnaseA母

　　姓名宿智新学院生命科学学院班级11级生工2班科目分子生物学实验学号20XX00140155第8组

　　液，Te缓冲液，饱和酚，氯仿/异戊醇混合液，酚/氯仿/异戊醇（pcI）混合液，预冷无水乙醇，TAe电泳缓冲液（10×），上样缓冲液（6×），琼脂糖，溴化乙锭（eb）,DnA相对分子质量标准物DnAmarkerλ/hindⅢ，5mol/Lph5.2的醋酸钠。

　　实验方法

　　姓名宿智新学院生命科学学院班级11级生工2班科目分子生物学实验学号20XX00140155第8组

　　姓名宿智新学院生命科学学院班级11级生工2班科目分子生物学实验学号20XX00140155第8组

　　篇三：

质粒的提取酶切实验报告

　　实验一质粒的提取酶切

　　实验目的

　　掌握质粒小量快速提取法。

用琼脂糖凝胶电泳法鉴定其纯度。

实验原理

　　质粒是一种染色体外的稳定遗传因子。

大小在1~200kb之间，具有双链闭合环状结构的DnA分子。

主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。

质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。

他可独立游离在细胞质内，也可整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能却赋予宿主细胞的某些表型。

　　采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（sDs）可使细胞壁裂解，经溶菌酶和阴离子去污剂（sDs）处理后，细菌DnA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DnA则留在上清液中。

用酒精沉淀洗涤，可得到质粒DnA。

　　在细胞内，共价闭环DnA（cccDnA）常以超螺旋形式存在。

若两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫作开环DnA（ocDnA）。

在电泳时，同一质粒如以cccDnA形式存在，它比其开环和线状DnA的泳动速度都快，因此在本实验中，质粒DnA在电泳凝胶中呈现3条区带。

　　限制性内切酶是一种工具酶，这类酶的特点是具有能够识别双链DnA分子上的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DnA的双链，形成一定长度和顺序DnA片段。

ecoRI和bglII的识别序列和切口是：

ecoRI：

g↓AATTc

　　bglII:

A↓gATcT

　　g，A等核苷酸表示酶的识别序列，箭头表示酶切口。

限制性内切酶对环状质粒DnA有多少切口，就能产生多少酶切片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。

用已知分子量的线状DnA为对照，通过电泳迁移率的比较，就可以粗略推测分子形状相同的未知DnA的分子量。

　　实验步骤

（一）质粒的提取

　　1.培养细菌将带有质粒Dh5ɑ的大肠杆菌接种于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的

　　1×Lb中，37℃培养过夜。

　　2.取液体培养菌液1.5ml置塑料离心管中，10000r/min离心lmin，去掉上清液。

加入150μl溶液I，充分混匀，在室温下放置10min。

　　3.加入200μl新配制的溶液II，加盖后温和颠倒5~10次，使之混匀，冰上放置2min。

　　4.加入150μl冰冷的溶液III，加盖后温和颠倒5~10次，使之混匀，冰上放置10min。

　　5.用台式高速离心机，10000r/min离心5min，将上清液移入干净的离心管中。

　　6.向上清液中加入等体积酚/氯仿（1：

1，v/v），振荡混匀，转速10000r/min，离心2min，将上清液转移至新的离心管中。

　　7.向上清液加5mol/Lnacl至终浓度为0.3mol/L，混匀，再加入2倍体积无水乙醇，混匀，室温放置2min，离心5min，倒去上清乙醇溶液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。

　　8.加0.5ml70%乙醇，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥。

　　9.加入50μl含RnaseA20μg/ml的Te缓冲液溶解提取物，室温放置30min以上，使DnA充分溶解待用或置-20℃备用

　　（也可用试剂盒按操作步骤提取质粒）

　　10.将抽提出来的质粒进行琼脂糖凝胶电泳

（二）质粒的酶切和鉴定

　　质粒DnA酶切的加样

　　重组质粒5μL

　　10×buffer1μL

　　bglII1μL

　　ecoRI1μL

　　ddh2o2μL

　　加样后的进行金属浴4h℃

　　再进行琼脂糖凝胶电泳

　　结果与分析