大豆分离蛋白的提取实验讲义.doc
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实验一大豆分离蛋白的提取
1．实验目的
学习掌握大豆分离蛋白的碱提酸沉法。
2．分离原理：
大豆分离蛋白的制取方法，按工艺特点主要有三种：
第一种是碱提酸沉法；第二种是离子交换法；第三种是超滤法。
碱提酸沉法生产大豆分离蛋白的原理，是将脱脂大豆内的蛋白质溶解在稀碱溶液中，分离除去豆粕中的不溶物，然后用酸将大豆蛋白质提取液的pH值调至大豆蛋白的等电点，使大豆蛋白质沉淀析出，再经分离清洗，回调pH，得到粉状大豆分离蛋白。
3.试剂材料：
豆粕，5%NaOH，2NHCl（17ml浓盐酸，缓慢用水稀释至100ml）。
4.提取方法：
将2g大豆磨碎，得到可通过80目筛的豆粕。
用重量10倍于豆粕的蒸馏水与脱脂豆粉混合，用5%NaOH水溶液将豆粉悬浮液的pH调节到8.5，室温或40℃搅拌1.5h。
然后将提取液离心除渣4000rpm×15min，得上清液。
用2N的HCl将上清液的pH值调到4.5，同时轻度搅拌均匀，可见开始出现沉淀，室温静置30min，然后以4000rpm×15min离心，用蒸馏水清洗沉淀2次，将蛋白沉淀物溶于20ml水中，并调节pH到7.0，考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度，计算蛋白提取率。
5.产品测定指标：
（1）可溶性蛋白质的浓度：
采用考马斯亮蓝法。
（2）蛋白质的提取率计算公式：
可溶蛋白质的浓度（ug/ml）×稀释度×体积（ml）
提取率（%）＝×100%
原料质量（g）×106
（附）考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度
一、实验目的
掌握考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度的原理和方法，掌握离心机和移液器的正确使用方法。
二、实验原理
考马斯亮蓝G-250是一种甲基取代的三苯基甲烷，在465nm处有最大吸收值。
考马斯亮蓝G-250能与蛋白质通过范得华相互作用形成蛋白质-考马斯亮蓝复合物蓝色溶液，引起该染料的最大吸收λmax的位置发生转移，在595nm处有最大吸收值。
在一定范围内（蛋白质浓度范围为0～1000μg／mL），蛋白质-考马斯亮蓝复合物溶液颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。
该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
三、实验试剂
1． 标准蛋白液：
准确称取100mg牛血清白蛋白，用蒸馏水溶解并定容至1000ml，制成100μg/ml的原液。
2． 考马斯亮蓝G250试剂：
准确称取100mg考马斯亮蓝G250，溶于50ml90％～95％乙醇中，再加入85%磷酸（m/v）100ml，用蒸馏水定容至1000ml。
常温下可放置1个月。
四、操作步骤
1．标准曲线的制备
取7支具塞试管，按下表进行编号并加入试剂。
以第1管为空白，于波长595nm处比色，读取吸光度，以吸光度为纵坐标，各标准液浓度（μg／mL）作为横坐标作图得标准曲线。
标准曲线的制备（0～100μg／mL）及样品测定参考表
管号
试剂
1＃（空白）
2＃
3＃
4＃
5＃
6＃
7＃
标准蛋白液（ml）
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
／
水（ml）
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
／
样品提取液（ml）
／
／
／
／
／
／
1.0
考马斯亮蓝试剂（ml）
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
蛋白质浓度（μg/m1）
0
20
40
60
80
100
待测
充分混匀，室温静置3min
A595nm
2．样品中蛋白质含量的测定
根据样品吸光度值，推出样品中蛋白质含量。
七、注意事项
1．样品蛋白质含量应在10～100ug为宜。
一些阳离子如K+、Na+、Mg2+、（NH4）2SO4、乙醇等物质对测定无影响，而大量的去污剂如TritonX-100、SDS等会严重干扰测定。
2．蛋白质与考马斯亮蓝G250结合十分迅速，在2min左右即可达到平衡，其结合物在室温下1h内保持稳定，且在5min～20min之间颜色稳定性最好。
3．试管内溶液要充分混合，但应避免不正确的振荡而产生大量的气泡。
4．染料易吸附在比色杯上（注意尽量不用石英比色杯），比色杯用后可用乙醇洗去蓝色。
5．由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用r-球蛋白质为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
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