绿色荧光蛋白原核表达分析完整优秀版.docx

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绿色荧光蛋白原核表达分析完整优秀版

石河子大学

分子生物学实验结课论文

绿色荧光蛋白（GFP）原核表达分析

学生姓名

学号

专业

年级、班级

指导教师

所在学院

中国·新疆·石河子

2021年1月

绿色荧光蛋白（GFP）原核表达分析

摘要：

本实验主要探讨目的蛋白（GFP）在大肠杆菌中的表达的情况以及鉴定目的蛋白形成的是包涵体还是可溶性蛋白。

本实验先对菌液进行培养、活化、然后采用IPTG分别对其不同时间点的诱导，用SDS-PAGE来确定目的蛋白的可溶性及其分子量，掌握GFP诱导不同时间的表达情况的检测方法。

关键词：

绿色荧光蛋白；SDS-PAGE；原核表达

1前言

1.1实验目的

掌握聚合酶链式反应（PCR）的原理和操作方法；了解重组载体的构建方法；

锻炼学生查阅文献资料、设计与优化实验的能力；加强学生对化学生物学中常用研究方法的认知。

1.2实验背景

绿色荧光蛋白（greenfluorescentproteinGFP）是源于多管水母属等海洋无脊椎动物的发光蛋白，其在蓝光或紫外光下可发出明亮的绿色荧光，可以作为报告基因检测蛋白的特异性表达或进行细胞定位研究。

与以往lacZ、CAT等报告基因相比，有很多无可比拟的优越性:

GFP不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达；荧光强度高，稳定性高；不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光,尤其适用于体内的即时检测；另外GFP分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害,安全可靠；并且通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。

正是由于GFP检测具有高灵敏度，操作简单，无需使用同位素等优点，近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域。

绿色荧光蛋白还在监测目的基因表达、研究细胞内物质代谢及追踪细胞系的分化等方面有着广泛应用。

采用GFP作为标记基因，可直接收集转化细胞供实验，缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记，为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段。

同时也正因为其荧光反应不是酶反应，所以当细胞本身还存在一些可以受蓝光激发和产生绿色荧光的物质，或者GFP表达频率不高的情况下，GFP的检测可能会产生一些假相，不易对荧光进行定量的测定。

我们利用基因工程手段在大肠杆菌中高效的表达了GFP，制备出GFP抗体，利用抗原与抗体之间的特异性，在体外对GFP进行检测，可在一定程度上弥补上述GFP检测中可能出现的问题，可以作为一种重要的辅助手段用以提高GFP检测的灵敏度和准确度。

原核表达是将克隆基因插入合适载体后导入大肠杆菌，用于表达大量蛋白质的方法。

选用原核表达系统的原因是易于生长和控制、用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞培养的材料昂贵、有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。

但是在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。

包涵体是在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，形成被膜包裹的结构，具有水不溶性的特点。

本实验主要是通过SDS-PAGE来检测绿色荧光的原核表达情况。

1.3流程图：

2材料与方法

2.1材料

2.1.1实验材料

质粒DNA;PCR产物、酶切质粒、DNAMarker;外源DNA片段：

PCR扩增回收目的片段A和PGM-Tvector（Amp’,lacZ）,带限制性内切酶末端的DNA溶液（目的片段A和载体片段pBL）;E.coliDH-5α受体菌（R-M-），自提的质粒或重组子;重组质粒DNA的菌落、BL21;重组GFP质粒、标准蛋白。

2.1.2实验仪器

PCR仪、PCR管、移液枪、离心机、电泳仪、涡旋振荡器、冰箱、透射仪、紫外透射仪、刀片、台式高速离心机、恒温水浴锅、微量移液枪、Eppendorf管、高压灭菌锅、超净工作台、制冰机、振荡培养箱、移液器、摇床、酒精灯、培养皿、接种环、酒精棉球、灭菌枪头、分光光度计。

2.1.3实验试剂

模板DNA、dNTP、TaqDNA聚合酶、引物、Buffer（内含Mg2+）、ddH2O、pGM-T载体、T4DNA连接酶、限制性内切酶、DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒，其它生化试剂皆为国产分析纯。

2.2实验方法

2.2.1PCR扩增目的基因片段

（1）依次混匀下列试剂，反应体系如下：

PCR反应体系

各成分的量

ddH2O

9.5μl

上游引物

1.0μl

下游引物

1.0μl

模板DNA

1.0μl

TaqDNA聚合酶

12.5μl

Total

25μl

混匀后瞬时离心

（2）将PCR管放入PCR仪中，设定PCR仪的循环参数。

预变性94℃3min，变性94℃30s，退火52℃30s，延伸72℃40s30个循环。

总延伸72℃4min；

温度时间

预变性94℃

3min

变性94℃

30S

退火52℃

30S

延伸72℃

40S

总延伸72℃

240S

（3）PCR扩增完毕后，取出PCR管放在冰盒上；

（4）取5μl扩增后产物，进行琼脂糖电泳检测。

2.2.2目的基因片段的琼脂糖凝胶电泳检测

（1）加20ml1×TAE缓冲液于三角瓶中；

（2）精确称取0.2g琼脂糖加到三角瓶中，于微波炉中加热至完全熔化；

（3）冷却至60℃左右，加1μl的Goldview溶液，摇匀；

（4）轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30分钟以上；

（5）轻轻拔除梳子，将胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液（TAE），使电泳缓冲液刚好没过凝胶约1mm；

（6）取5μl质粒DNA及2μl加样缓冲液混匀上样；

（7）110v约电泳0.5～1小时；

（8）紫外透射仪观察结果。

2.2.3DNA的回收和纯化

回收PCR产物（采用天根时代DNA回收试剂盒）:

（1）用干净的刀片将需要的DNA条带从凝胶上切下来，分别放入1.5ml离心管中；

（2）以0.1g凝胶对应300μl的体积加入PN;

（3）50℃水浴放置10min，期间不断温和上下翻动离心管至胶完全溶解；

（4）将上述的得到的溶液加入到一个吸附柱中，吸附柱再放入收集管，12000rpm离心60s，弃掉废液；

（5）加入700μl漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃掉废液；

（6）加入500μl漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃掉废液；

（7）将离心吸附柱放回收集管，12000rpm离心2min；

（8）取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间位置加入适当的洗脱缓冲液EB30μl，洗脱缓冲液先在65℃水浴预热，冷却至室温，12000rpm离心1min，然后将离心的溶液重新加回离心吸附柱中，12000rpm离心1min；

（9）电泳检测回收产物，余置于-20℃下保存。

透射仪观察结果，并拍照。

2.2.4重组质粒的连接

把PCR扩增的目的基因片段产物与pGM-T载体连接，反应体系如下：

大肠杆菌感受态细胞的制备

大肠杆菌感受态细胞的制备采用CaCl2法。

（1）将实验室保存的E.coliDH-5α菌株甘油管用无菌去离子水1:

100稀释后，平板划线法接种在无抗生素的LB固体培养基上，37℃培养过夜，见有菌落长出，用接种环从平板上挑取一个单菌落，接种到20ml无抗生素的新鲜LB液体培养基中，37℃、200rpm震荡培养过夜，活化E.coliDH-5α菌株；

（2）按照1%接种量，从上述培养液中吸取菌液2ml，转瓶接入200ml新鲜的无抗生素的LB液体培养基中，37℃,200rpm震荡培养至OD600值为0.5左右；

（3）在已灭菌的10ml离心管中吸取上述培养液10ml，冰水浴10min后，4℃、6000rpm离心2min，收集菌体，弃上清；

（4）加2ml冰冷预热的0.1mol/LCacl2溶液，重悬菌体，冰浴10min，4℃、6000rpm离心2min，收集菌体，弃上清；

（5）将每一份沉淀轻缓地悬于0.4～1ml含有20%甘油的0.1mol/LCacl2的溶液中，轻轻重悬菌体沉淀，冰上放置10分钟；

（6）分装100μL/管（冰浴分装），置于-70℃冰箱中保存。

2.2.6连接产物转化感受态细胞

（1）转化用固体LB培养基平板制备：

向含100μg/ml氨苄青霉素（AMP）的固体LB培养基平板上加50mg/ml的IPTG16μl和20mg/ml的X-gal40μL，用灭菌弯头玻璃棒涂布均匀，37℃避光倒置3h，让溶解X-gal的二甲基甲酰胺尽量挥发干净。

加入ITPG和X-gal的转化用平板应避光保存，以防试剂见光分解。

（2）连接产物转化E.coliDH-5α感受态细胞：

①取5μl连接产物加到100μlE.coliDH-5α感受态细胞中。

轻弹混匀，水浴20min。

②取出离心管，42℃水浴中热激90后，立即置冰浴中冷却5min。

③向离心管中加入800μL37℃预热的无抗生素的LB液体培养基。

④取出离心管，12000rpm离心2min，弃上清800μL，用剩余的约100μL上清将沉淀菌体吸打混匀后，在LB平板上涂布ITPG和X-gal。

将平板倒置在37℃恒温箱中培养14h～18h，直至长出菌落，观察结果。

重组质粒的菌落鉴定

本次实验所用的pGM-Tvector含Ampr、lacZ基因，所以有重组质粒的菌落为白色，没有重组质粒的菌落为蓝色。

具体操作如下：

①挑取菌落：

使用无菌枪头随即挑取5个白色菌落，放入含氨苄青霉素的LB液体培养基的1.5mlEP管，振荡培养4h以上，吸取0.5ul菌液作为PCR反应模板，其余继续培养。

②PCR反应体系与反应程序均与目的基因扩增条件一致。

③扩增产物取5ul用1%琼脂糖凝胶进行检测。

2.2.8提取重组质粒

将鉴定为阳性重组子的质粒EP管挑取出来，按照实验室提取质粒的试剂盒说明书操作。

提取后，取5ul用1%琼脂糖凝胶进行检测。

2.2.9重组质粒双酶切

用限制性内切核酸酶BamHⅠ和SalⅠ对PCR阳性菌落提取的质粒做双酶切鉴定。

酶切反应体系如下表。

体系成分

体积

质粒

5.0ul

去离子水

11ul

10×BufferT

3.0ul

BamHⅠ（120U/ul）

0.5ul

SalⅠ（100U/ul）

0.5ul

总体积

20ul

37℃酶切过夜，70℃灭活酶活性。

1%琼脂糖凝胶进行检测。

2.2.10GFP基因重组表达质粒及诱导表达

（1）将上步经酶切鉴定得到的GFP目的片段与表达质粒连接，并转化至大肠杆菌BL21菌株。

转化菌涂布于含有卡那霉素的LB琼脂平板上，37℃过夜培养；

（2）观察菌落生长情况，进行菌落PCR鉴定；

（3）将鉴定为阳性的菌落接种于20ml含50mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃摇菌培养过夜。

（4）按1:

100稀释过夜菌，接种于100ml含有卡那霉素的LB培养基中，37℃摇菌继续培养至A600约为0.4-0.8。

（5）取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度为1mmol/L，于37℃诱导表达。

每隔1h分别取菌体1ml，离心12000g，30s得到沉淀，观察蛋白表达情况。

2.2.11SDS-PAGE检测诱导表达的蛋白

（1）取未诱导、诱导不同时间的培养物500ul于微量离心管中，室温高速离心1min。

沉淀悬浮于100ul1×SDS凝胶加样缓冲液中，100℃加热3min，室温高速离心1min后，冰上放置。

（2）安装电泳装置，配制12%分离胶倒入凝胶槽，加蒸馏水密封。

待凝固后再倒入5%浓缩胶，插上梳子。

待凝固后，拔出梳子，放入电泳槽中，上样，电泳。

（3）电泳结束后，将凝胶浸泡在染色液中，室温在摇床上缓慢染色4h。

（4）脱染：

将染液回收，凝胶先用蒸馏水漂洗一次后侵入脱染液中脱染，更换几次脱色液，直至出现清晰的电泳带。

（5）脱色后，将凝胶保存在水中或是含20%甘油的水中；

（6）观察实验结果。

3结果与分析

3.1PCR扩增目的基因片段的琼脂糖凝胶电泳检测

M为Marker，1-4为PCR扩增产物，产物长度约为750bp，由于实验疏忽不严谨，条带不明显且不明确。

3.2DNA回收电泳检测

由于操作不当，DNA片段分解了，没有回收到电泳条带。

3.3连接产物转化后的蓝白斑筛选

将目的基因片段与pMD18-T载体连接，并转化大肠杆菌E.coliDH5α菌株感受态，37℃，培养16h以后得到蓝白斑的菌落，白色菌落即有可能为含重组子的菌落（如下图）。

箭头所指处为蓝色菌落

3.4外源基因诱导表达

用IPTG诱导表达后呈现绿色，说明含外源基因GFP的质粒在大肠杆菌体内成功表达。

绿色荧光的亮度增加说明随着诱导时间的增加，GFP基因表达量增加，而没有经IPTG诱导的菌体则不发出绿色荧光（如下图）。

3.5GFP原核不同条件的诱导表达和检测

将诱导表达的蛋白处理后进行SDS-PAGE检测,确定其分子量大小。

可以看到，诱导时间不同蛋白表达量不同，条带颜色不一样。

由于实验疏忽，电泳条带不明显到时实验失败。

电泳带淡有三种可能原因：

（1）电泳时，点样后等待时间过长，导致点样液扩散。

（2）目的质粒浓度低。

（3）机器曝光时间不对。

在实验过程中，等待点样时间较长，原因1有可能。

在电泳带底部见模糊阴影，可能有杂DNA污染。

我们并非在无菌的条件下做实验，电泳口也可能有杂质，PCR时也可能载体自连产生假阳性，这些情况都可能造成目的质粒浓度低。

其他组的电泳结果也不是很亮，所以还可以调整曝光时间试试。

4心得体会

本实验涉及知识面广，需要综合利用分子生物学、化学生物学、基因工程和微生物学中的基础理论知识和技术，有利于学生对几个学科间知识的融会贯通。

实验中涉及步骤较多，需要1～2周时间才能完成，因此较适合作为高年级学生的综合实验。

本实验对实验者的实验技能要求较高，实验过程中应用到一系列基本操作方法，需使用多种实验仪器，可以综合锻炼学生的实验技能。

在实验教学过程中，教师要注意加强引导，实施开放式教学，给学生创建一个独立工作的环境。

同时学生也可通过查阅文献，对给定的实验步骤进行优化，有利于开阔学生的视野，培养学生解决问题、分析问题的能力。

绿色荧光蛋白是现代化学生物学中常用的一种分子成像标记物，被广泛应用于科学研究中。

由于绿色荧光蛋白在紫外光激发下可以发出明亮的、肉眼可见的绿色荧光，有利于激发学生的实验热情，提高学生学习化学生物学的兴趣。

由于本实验使用可进行亲和纯化的表达载体，因此也可以进行后续的蛋白质纯化及蛋白质电泳实验。

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组氨酸标签蛋白的纯化

His-Tag融合蛋白是目前最常见的表达方式，而且很成熟，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性，无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱去（IMAC）纯化。

2．1IMAC（ImmobilizedMetal-ionaffinitychromatography）是Porathetal.1975年用固定IDA作为配基的填料螯合过渡金属铜、镍、钴或锌离子，可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白，1987年Smithetal.发现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离子的IDA-sephadexG-25作用力更强，此前在1986年他和他的合作者用Ni2+-IDA-sephadexG-25亲和纯化在氨基端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原。

同年1987年Hochulietal.发现带有相连组氨酸的多肽和Ni2+-NTA填料作用力更强于普通的肽，1988年他第一次用这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽，无论是在天然还是变性条件下一次亲和纯化都得到很好效果，此后表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC变得非常普遍，相对而言，不带标签的蛋白纯化就非常困难，所以表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC纯化变成最常用而且最有效的研究蛋白结构和功能的有力手段。

1986年Porathetal.还发现Fe3+-IDA-sephadexG-25可以用于磷酸化蛋白的纯化，而后发现Ga3+-IDA也有同样的效果，这样螯合这两种金属离子的填料就有效用于磷酸化多肽的富集和纯化，同时IMAC也可以用于纯化各种和金属离子结合的多肽，应用非常广泛。

市面常见的商品化IMAC用于带六个组氨酸标签蛋白的配基有以下几种：

2.2影响IMAC纯化结果的因素：

填料的种类：

不同填料厂家的填料有差别，所以使用过程最好能得到厂家的技术支持，因为不同的厂家填料不同，此外蛋白纯化个性很强，没有哪一个填料是能适合所有带六个组氨酸标签蛋白的纯化，载量高和特异性好本身就是矛盾。

2.2.2填料的配基种类、密度、金属离子种类

填料最简单的判断是螯合好同样的金属离子，哪家产品的颜色越深就意味着和蛋白的作用力越强，适用范围越广，载量也越高，纯化的好坏关键看纯化的条件，仅有填料的特异性是不够的，同样配基密度下IDA填料的亲和力要比NTA的强，所以NTA上不能吸附的样品可以选择IDA为配基的填料。

螯合金属离子和蛋白作用强弱为铜和镍离子的强，而锌和钴离子的弱。

因此如果一个蛋白作用力强，想得到好的特异性可以选择螯合钴离子，它还有一个优点是不怕还原剂，特别时候有高浓度的还原剂。

相同金属离子，IDA的强于NTA。

螯合金属离子的价位越低和蛋白的作用力越强。

同时镍离子是最常用的，如果有条件可以换不同金属离子以得到更好的效果，因为不同的金属离子有不同的选择性。

因此要希望填料应用范围广就选择镍琼脂糖凝胶，如果是希望特异性好而且稳定就选择镍NTA琼脂糖凝胶.

蛋白本身的结构和样品来源

IMAC原理已经说明只要是带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白都可以被吸附，所以要想得到好的纯化效果，必须选择好纯化的条件，通常带组氨酸蛋白都可以在天然情况下被镍琼脂糖凝胶或镍NTA琼脂糖凝胶吸附，但是如果标签折叠在蛋白内部不容易暴露，这样就难纯化，如果镍琼脂糖凝胶都不能吸附，可以在样品和平衡缓冲液中加1-2M脲，这样蛋白结构相对松散，也许能吸附而蛋白不会变性，对于本身就是变性的蛋白如果8M脲不能吸附，改用6M盐酸胍溶解样品就可以被吸附，因为盐酸胍可以打开脲打不开的结构使得标签能暴露。

当然如果有二硫键最好加1-2mMDTT也可以更好解决吸附的问题。

此外也可以把标签换到另外一端。

2.2.3缓冲体系，pH及盐浓度

对于一些作用力弱的蛋白不能选择带氮原子的的一些缓冲体系，如Tris-HCl等，适当提高缓冲液pH可以增加吸附效果，同样原理可以降低pH洗脱一些咪唑洗不去的杂带。

为避免由于电荷作用的干扰，平衡缓冲液中需要加0.1-1M氯化钠，而在平衡缓冲液添加00.1-0.5%吐温或者triton可以降低由于疏水相互作用导致的非特异吸附。

2.2.4表面活性剂及其他添加剂

添加一些表面活性剂可以增加蛋白的溶解度，降低疏水相互作用，这样使纯化的结果更好，在实验表明在平衡缓冲液中加0.5-1%的吐温可以使电泳的背景更清晰，杂带减少。

对一些难溶解的样品也可以加乙醇或者甘油。

在变性条件下有时会在样品中添加还原剂如巯基乙醇或者二巯基苏木糖醇，它们如果浓度过高或者上样量过大，会导致镍离子还原甚至脱落，使填料失效，如果要在这样的环境下，那最好选择螯合价位高的填料如镍NTA琼脂糖凝胶或降低还原剂的浓度，通常1-2mM是没问题的。

如果一定要选择高浓度的还原剂，也可以把镍离子还成钴离子，它不怕还原，把普通的镍琼脂糖凝胶还成钴离子即可。

以下是破碎及提取、纯化操作和常见问题解决方法：

破碎方法

样品的处理对纯化是很重要的，重要的原则是破碎要温和，不能使蛋白断裂或者降解，否则一些片段同样也带有标签，这样增加了纯化的难度。

需要注意的问题是超声破碎温度，强度，时间

大肠杆菌的破碎方法：

1）收集培养发酵液，4度7000-8000g离心10分钟，收集沉淀的菌体（如果不是马上破碎可以放-70度冷冻，但是最好能保存成小块或者薄片，这样好用。

）

2）取1-2克菌体加10ml破碎缓冲液（pH7.4的50mM磷酸缓冲液含0.5MNaCl，0.5mg/ml溶菌酶，1mMPMSF，1mMMgCl2，1.7units/mlBenzonase,其中的菌酶，1mMPMSF，1.7units/mlBenzonase现加）在冰上混合45分钟，如果pH不在7-8，需要用0.5MNaOH一边搅拌一边滴加.如果溶菌酶10mg/ml混合时间可以缩短到10分钟.

3）把混合菌体在冰水中用超声探头破碎20秒种,总共四次,中间间隔要保持2分钟冷却破碎液,检测pH,如果不在7-8,还是用0.5MNaOH一边搅拌一边滴加去调.如果菌体的为50-500克,可以高压破碎的方法,缓冲液同上,体积为1升,破碎三次,压力为800bar.

4）破碎的液4度12000g离心10分钟，如果要让溶液更澄清，可以4度50000g离心30分钟，这时候可以把上清和沉淀分别留样，跑电泳，如果只沉淀中有目标蛋白，那就用变性条件下去提取。

5）破碎离心的上清加2M咪唑溶液0.12ml使终浓度为20mM，样品的总体积为10ml。

过柱子的样品最好过0.45μm的滤膜，避免堵柱。

2．可溶性蛋白